《生物技术制药》复习提纲

《生物技术制药》复习提纲

一、基本概念

1.质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸

分子。

2.贴壁细胞：生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表

面上生长、增殖的一类细胞。

3.悬浮细胞：生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长的一类细胞。

4.抗体：是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。

5.抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答、并能与相应免疫应答产物(抗

体和致敏淋巴细胞)在体内外发生特异性结合的物质。

6.半抗原：只有抗原性而无免疫原性的物质。

7.人-鼠嵌合抗体：在基因水平上将鼠源单抗的H和L链可变区基因分离出来，分别与人1g

的H和L链的稳定区(C)基因连接成人-鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞,

就能表达完整人-鼠嵌合抗体。

8.改形抗体：又称CDR移植抗体，是Ig分子中参与构成抗原部位的区域，是H和L链V区

的互补性决定区，而不是整个可变区。

9.Fab抗体：具有完整的双价抗体活性,且保持抗体分子的立体构型，在人体稳定的小抗体雌

形。

Fv抗体：含有L链和Fd链一半的N端可变区，具有与完整抗体相似的结合能力的片段。

10.单链抗体：是由一段弹性连接肽(Linker)把抗体可变区重链(VH)与轻链(VL)相连而成，是

具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。

11.植物的分化：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程，可分为

胚胎发生和器官发生。

12.脱分化:是指培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过

程。

13.再分化:通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化成为胚状体或直接

分化出器官的过程。

14.愈伤组织：是植物损伤后，在伤口长出的•块软组织。

15.继代培养：由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代时间称之为第一代培养。连

续多代的培养即为继代培养。

16.固定化酶：是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理,

使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。

17.固定化细胞：将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定

位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。

18.模拟酶：是指根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂，亦称“人

工毗。

19.细胞融合:是指认为地使两种不同的生物细胞在同一培养器中，用无性的人工方法进行直

接接触，产生能同时表达两个亲本细胞有益性状的细胞杂交技术。

20.免疫耐受:在某种情况下，抗原也可诱导相应的淋巴细胞克隆对该抗原表现为特异性无应

答状态。

21.完全抗原:具有免疫原性和反应原性的物质。

22.抗原决定簇：又称表位，指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，是被免疫细胞识

别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。

23.单克隆抗体：是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释

法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯•的单克隆细胞系而产生的。

24.生理活性物质:是一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称。

二、技术原理

1.简要说明影响目的基因高效表达的因素:

(1)表达系统；

(2)载体构建;

(3)外源基因的拷贝数;

(4)外源基因的表达效率：

(5)外源蛋白的糖基化；

(6)宿主菌株的影响。

2.基因载体应具备的条件：

(1)具有复制起始点，使重组DNA能在受体细胞内进行复制，达到无性繁殖的目的

(2)有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；

(3)有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；

(4)有一定容量；

(5)有相当的拷贝数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。

3.导致基因工程菌中质粒不稳定的原因及如何提高质粒的稳定性？

(1)分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。

结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变

(2)导致基因工程菌遗传不稳定性的原因：

※受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解

※外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢

※重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配，这是重组质粒逃逸的基本原因

※受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排

(3)提高稳定性的方法：

※采用两阶段培养法：(先使菌体生长至一定密度；再诱导外源基因的表达。)

※在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。

※调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度

※有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比

生长速率，可改善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释速率，都可以提高质粒稳定性。

4.简述三种分离纯化常用色谱方法的基本原理。

（1）离子交换层析（IEC）

基本原理：通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目

的。

⑵疏水色谱（HIC）

基本原理：主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，

无机盐的存在能使相互作用力增强。

⑶亲和层析（AC）

基本原理：是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、

受体与激素、醐与底物之间的作用。

（4）凝胶过滤

基本原理：是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢

移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。

5.抗体的基本结构及每一区域的功能作用。

（1）由4条多肽链组成的四聚体，即由2条相同的轻链（L）和2条相同的重链（H）组成,

重链之间以及轻链与重链之间通过二硫键连接，呈Y字型结构。

（2）其中可变区（V区）中，存在着抗体分子和抗原分子发生特异性结合的关键部位，即互

补决定区（CDR）；而恒定区（C区）则决定了Ig分子的异种抗原性。

6.试比较动物细胞和植物细胞生理特点的异同。

项目

动物细胞

植物细胞

相

同

点

大小/Um

10—100

营养要求

很复杂

产物存在部位

胞内或胞外

产物浓度

低

不

同

点

生长形式

悬浮、贴壁

悬浮

备增时间

15—100

20—120

细胞分化

有

有限分化

环境影响

非常敏感

敏感

细胞壁

无

有

含水量/%

约90

供氧需求

1—25

20—30

产物种类

疫苗、单抗、酶、生长因子、激素、免疫调节剂

酶、天然色素、天然有机化合物

7.试比较说明动物细胞培养基与植物细胞培养基的区别。

成分

动物培养基

植物培养基

无机盐

有

有

碳源

糖类

糖类、肌醇

氮源

氨基酸

蛋白质水解质和各种氨基酸

维生素

脂溶性和水溶性的都有

B族维生素、生物素、肌醇

植物生长

调节剂

无

生长素、分裂素、赤霉素、

脱落酸和乙烯

其他成分

动物血清、添加剂(激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因子)

无

8.试比较动物细胞与植物细胞培养操作方式的异同点。

(1)动物细胞与植物细胞培养都用到半连续式操作，它是一种将培养基一次性地加入反应器

中，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式。

(2)不同的是动物用的分批式操作，而植物用的是成批培养；动物还有到灌流式操作，而植

物还用到连续培养和固定化培养。

9.简要说明制备的单链抗体的基本原理及该抗体的优缺点。

(1)基本原理：首先从杂交瘤细胞、外周血淋巴细胞中提纯mRNA,再经RT-PCR分别扩增抗

体的重链可变区和轻链可变区编码基因，人工合成一条寡核甘酸序列(称为Linker),将VL

的C端与VL的N端或VH的C端与VL的N端相连接，构建成单链抗体基因，在一定的表达系

统中得以表达。

(2)优点:

井分子小，容易进入组织；

#为单链，易于进行分子改造；

井体内半衰期短、免疫原性低；

(3)缺点：

#稳定性依然较低；

#功能单一，仅能与一种抗原特异性结合；

#亲和力低，稳定性较差，体内消除过快。

10.试以环糊精为例说明模拟酶制备的基本原理。

三、技术方法

1.基因工程药物制造流程。

※目的基因和载体的准备；

派目的基因与载体的连接构建重组质粒；

※转化至受体细胞构建基因工程菌；

※培养工程菌；

※目的基因的表达，产物分离纯化；

※除菌过滤；

※半成品、成品检定；

※包装。

2.试述获得目的基因的一种方法。

【反转录法】

先从产生某特异蛋白的真核细胞中提取mRNA,以其为摸板，在反转录酶的作用下，反转录合

成该蛋白mRNA互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为摸板，在反转录酶或DNA聚合酶

I的作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。

3.如何将目的基因与载体进行连接（几种末端的连接策略）。

4.单克隆抗体制备的流程，并简要说明每一步骤的理论依据。

5.简要说明酶的固定化方法。

酶的固定化,就是通过载体等将酶限制或固定于特定的空间位置,使酶变成不易随水流失即运

动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。按所用载体和操作方法的差异，•般可分为载体

结合法、包埋法和交联法三类。

(1)载体结合法

载体结合法是将酶结合到不溶性载体上的一种固定化方法。根据结合形式的不同，可分为物

理吸附法、离子结合法和共价结合法。

(2)交联法

交联法是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法。可

分为交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法及载体交联法4种。

(3)包埋法

可分为网格型和微囊型两种。将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型，将酶

或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。包埋法•般不需要酶蛋白的氨基酸残基参与反

应，只适合于小分子底物和产物的酶。

6.固定化酶反应器的类型特点及选择依据。

(1)固定化酶反应器的类型特点：

※间歇式搅拌罐反应器(亦称分批搅拌反应器，BSTR)

结构简单，设有夹套或盘管装置，主要用于游离酶反应。

※连续流动搅拌反应器(CSTR)

在结构上与BSTR基本相同，区别是连续进料、连续出料有搅拌系统，组分分布均一；但剪

切力较大，容易引起固定化酶的破坏。

※填充床反应器(PBR)

反应器内流体的流动形态接近于平推硫硫型，底物按一定方向以恒定流速通过反应床。

※流化床反应器(FBR)

混合程度高，传热、传质情况良好。

※循环反应器(RCR)

让部分反应液流出，和新加入底物流入液混合，再进入反应进行循环。用于不溶性反应底物。

※连续流动搅拌器-超滤膜反应器(CSTR/UFR)

可以实现前的反复使用和使底物彻底转化。

(2)固定化酶反应器的选择依据

※固定化酶的形状

※底物的物理性质

※酶反应的动力学特性

※外界环境对酶的稳定性的影响

※操作要求及反应器的费用

四、实践与进展

1.试述基因工程药物的发展前景

自从DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发

展。目前，世界各国都将基因工程及其逐渐加速的产业化进程视为国民经济的新增长点，展

开了激烈的市场竞争。到