仪器分析 课件 第08、9章 超临界色谱及色谱新方法、高效毛细管电泳分析法

*第八章

超临界流体色谱及其它8.1.1

超临界流体色谱的特点与原理8.1.2超临界流体色谱仪的结构流程8.1.3超临界流体色谱的应用第一节

超临界色谱SupercriticalfluidchromatographandothersSupercriticalfluidchromatograph,SFC*8.1.1

超临界流体色谱的特点与原理1.概述

超临界流体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。超临界流体色谱(SFC)，20世纪80年代快速发展，具有液相、气相色谱不具有的优点。（1）可处理高沸点、不挥发试样；（2）比LC有更高的柱效和分离效率。*2.超临界流体性质（1）性质介于液体和气体之间，具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。*HPLC与SFC

的H-u关系曲线比较*2.超临界流体性质（2）可通过改变超临界流体的密度（程序改变）调节组分分离（类似于气相色谱的程序升温，液相色谱中的梯度淋洗）。

超临界流体的密度与压力有关。在SFC中压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。

CO2流动相，当压力改变：7.0×106→9.0×106Pa，C16H34的保留时间由25min→5min。*程

序

升

压

程序升压对SFC分离改善的效应图实验条件：柱：DB-1；流动相：CO2；温度：90ºC；检测器：FID样品：1-胆甾辛酸酯2-胆甾辛癸酸酯3-胆甾辛月桂酸酯4-胆甾十四酸酯5-胆甾十六酸酯6-胆甾十八酸酯*3.原理

SFC的流动相：超临界流体（CO2、N2O、NH3）。

SFC的固定相：固体吸附剂(硅胶)或键合到载体(或毛细管壁)上的高聚物，可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱SFC。

分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离。通过调节流动相的压力(调节流动相的密度)，调整组分保留值。*8.1.2

超临界流体色谱仪的结构与流程1.结构流程

*2.主要部件（1）SFC的高压泵

无脉冲的注射泵，通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量。

（2）SFC的色谱柱和固定相

可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；

SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物。专用的毛细管柱SFC。*主要部件（3）流动相

SFC的流动相：超临界流体，如CO2、N2O、NH3

CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收。缺点：极性太弱。加少量甲醇等改性。（4）检测器

可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的FID检测器。*压力效应：在SFC中压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。

CO2流动相，当压力改变：7.0×106→9.0×106Pa，C16H34的保留时间由25min→5min。

SFC柱压降大(比毛细管色谱大30倍)，柱前端与柱尾端分配系数相差很大；超临界流体的密度在临界压力处最大，超过该点，影响小，超过临界压力20%，柱压降对分离的影响小。*8.1.3

超临界流体色谱的应用1.聚苯醚低聚物的分析分析条件：色谱柱：10m×63μmi.d.

毛细管柱；固定相：键合二甲基聚硅氧烷；流动相：CO2；柱温：120

C；程序升压。*2.低聚乙烯的SFC分析*3.甘油三酸酯的分析四种组分仅双键数目和位置不同，难分离。分析条件：色谱柱：DB-225SFC毛细管柱；流动相：CO2

。

从15MPa程序升压到27MPa，2.5h完全分离。*内容选择结束8.1超临界流体色谱

8.2激光色谱

8.3

场流分离*第八章

超临界流体色谱及其它8.2.1

激光色谱的基本原理8.2.2激光色谱的特点8.2.3激光色谱的应用前景与发展第二节

激光色谱SupercriticalfluidchromatographandothersLaserchromatograph*概述

激光色谱（opticalchromatography）是板今太郎于1995年首次提出的利用激光作为推动力的一类新型的色谱分离技术。分析化学领域的又一个前沿课题。为人们提供了一个用于研究微米区域内（甚至更小）粒子的物理、化学及生物特性的全新方法。对化学、分子生物学和生物医学工程等领域产生影响。*8.2.1

激光色谱的基本原理1.光捕集

OpticalTrapTechnique；Ashkin

1970年

通过光学系统将一束特定波长的激光聚焦于溶液中，由于溶液中粒子的折光指数大于溶剂的折光指数，所以粒子在激光的辐射压力作用下被聚焦，相当于粒子被捕集一样(在物理上将这种现象称为激光致冷)。为光色谱的诞生奠定了基础将待分离组分（或粒子）按几何尺寸的大小分离的技术。*2.激光分离原理

粒子受流动相的推动力f推和激光束的辐射压力f辐共同作用。粒子受辐射压力的作用聚焦在激光束的中心线上。

f辐>f推时，粒子运动方向发生反转并获得一定的加速度，并受流动相的阻力而逐渐减速，当f辐=f推时，离子在该处停留。大粒子受到的辐射压力大，离激光光源位置远，从而实现分离。

*8.2.2

激光色谱的特点1．进样简单2．优化分离条件容易

改变激光束的聚焦条件可以控制粒子的分离效果。光色谱可以控制测定时间。3．不需要用标准物质对照定性

知道分析物粒子的尺寸大小和折光指数，就可以通过计算来确定粒子的位置而定性。4．可以随时检测

检测效率100%。

*5．可同时实现分离和富集

改变激光器的输出功率就可以将粒子按几何尺寸大小收集。6．可以更有效地分离单个“粒子”或“大分子”

如生物细胞和生物大分子。7．只要中断激光束就可以恢复样品的初始浓度8．可以进行“原位”反应或性质研究

粒子位置确定，并可根据需要确定停留时间，可方便地对离子进行化学反应或其他研究。9．色谱柱的尺寸可以减小至微米级

为微米区域内的化学或分子生物研究提供了场所。

*8.2.3

激光色谱的应用前景与发展对聚合物微球、生物细胞、生物大分子(如蛋白质、肽、DNA、RNA的细粒体)进行分离研究。从理论上讲，可以检测到一个蛋白质分子，这是其他分析方法所不具备的突出特点。发展方向：1．完善光色谱理论：分离数学模型，影响分离因素。2．研制高灵敏度的检测器：提高检测技术。3．研制性能优良、自动化程度高的光色谱仪器。4．进行深入的应用研究：生物大分子的微区研究。揭示生物大分子的反应机理等。

*内容选择结束8.1超临界流体色谱8.2激光色谱

8.3

场流分离*第八章

超临界流体色谱及其它8.3.1

场流分离的基本原理8.3.2

场流分离仪器8.3.3沉降场流分离8.3.4热场流分离8.3.5流体场流分离第三节

场流分离SupercriticalfluidchromatographandothersFieldflowfractionation；FFF*

8.3.1

场流分离的基本原理

1.

概述

场流分离（FFF）是一种混合物的流动分离技术，但不是严格意义上的色谱分离。通过在外部施加力场的作用下，利用溶质在流经一个空的柱槽时根据溶质在物理性质方面的差异如质量、体积、扩散系数、电荷等，使溶质分布在流动相中的不同区域实现分离的技术。所施加的力场可以是电场、磁场、热梯度、重力场等各种形式，外力场的作用力方向与流动方向垂直。*2.基本原理*停留时间与弛豫过程

当试样进入柱槽时，载液将被中断一段时间，称为停留时间，以使溶质有足够时间在分离场和扩散力的作用下在柱槽的富集板附近形成平衡层，这一过程被称作弛豫过程。

在弛豫过程，溶质在横向分离场产生的驱动力F作用下向液槽聚集壁移动，移动速率u可用下式表示：f为摩擦系数；R为摩尔气体常数；T为温度；D为扩散系数。*

当组分在壁上的聚集与扩散平衡后，形成平行于槽壁的、分离的、窄的颗粒层，每一层具有指数浓度分布，越靠近槽壁浓度越高，浓度分布层厚度（l）分布可表示为：

层厚度l与槽厚度w的比为：

为了使λ尽可能小，施加的力场必须尽可能大。*3.FFF中的保留比定义为保留比定义为：

Vr-液槽的空体积，V0-被分离组分的保留体积，t0为不保留溶质的出峰时间，tr为保留时间。

理论保留值可由下式计算：

对充分保留的组分（λ<0.1）,上式可简化为极限形式：

受扩散控制的FFF过程的保留时间计算通式为：

*4.场流分离类型

依据样品的分子量或粒子直径范围不同分为正常型和位阻型两类：

（1）正常型

直径小于1

m的溶质或粒子的分离是按正常型分离的。正常型分离的洗脱顺序与凝胶色谱相反，小分子先于大分子被洗脱。（２）位阻型

直径为1～100

m的粒子的分离行为不同于小粒子。直径大的粒子处于平均流速较快的区域故有较快的移动速度，先于小粒子流出，与正常型正好相反，而与凝胶色谱相同。*8.3.2

场流分离仪器

外力场类型：热FFF；沉降FFF。仪器的基本组件：FFF通道、场发生器和场梯度控制器、流体泵、检测器和记录仪。FFF通道：塑料或金属片上形成的带状通道，一般厚度为0.05～0.5mm，长100cm，宽2～3cm。通道的设计应允许场力线通过，因而不同体系需要采用不同材质的通道。*8.3.3

沉降场流分离

约1μm或更大的且有足够密度的颗粒可用沉降FFF分离技术，即在重力场的作用下获得分离。

载液的密度显著地影响到组分的保留，故对于精密的工作应准确地知道载液的密度，通过加入密度调节剂来调整载液密度，使各组分的保留值差增加。*应用

可用来筛分各种分散性乳液样品和表征聚甲基丙烯酸甲酯聚合样品，也可用于几种病毒的相对分子质量测定，聚合的血清白蛋白微球和几种油水乳浊液的分级。分子太小而不被沉降时，则无法使用沉降FFF技术。

*8.3.4

热场流分离

一个壁包含有加热器，另一个则壁采用冷却剂循环。通过调节热壁的温度，就可以控制通过薄液槽的温度降。

*8.3.5

流体场流分离应用最广、分离能力最强和样品适应性最广。一垂直于载流的流体，穿过柱槽产生一个均匀的流体场。控制超滤膜的孔径，利用超滤膜的过滤作用可改善分离效果。场流分离仪具有色谱和过滤得多重分功能。

*内容选择8.1超临界流体色谱

8.2激光色谱8.3

场流分离结束

第九章2025/11/13第九章

高效毛细管电泳分析9.1.1概述9.1.2经典电泳分析法9.1.3高效毛细管电泳分析过程与特点第一节

概述GeneralizationHighperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE2025/11/139.1.1概述电泳：在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。（动画）2025/11/13概述

1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白。（动画）

发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；

第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖。2025/11/139.1.2经典电泳分析

利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。

按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；2025/11/13高效毛细管电泳的出现传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析方法相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75

m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳。2025/11/139.1.3高效毛细管电泳分析过程与特点高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：

一、采用了0.05mm内径的毛细管；二、采用了高达数千伏的电压。

毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加。高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。2025/11/13双电层与电渗流在pH溶液中，毛细管内壁与溶液间出现双电层。管内壁带负电荷，柱内溶液表面带正电荷。电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流(Electroosmoticflow，EOF)现象。电渗流现象：柱内溶液整体向负极移动。2025/11/13分离过程

带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。

正离子：两种效应的方向一致，在负极流出；（动画）

中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，阳离子后流出；

阴离子：两种效应的运动方向相反。ν电渗流<ν电泳时，在阳极流出。ν电渗流>ν电泳时，阴离子随电渗流在负极流出，在这种情况下，不但可以按类分离，同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。2025/11/13高效毛细管电泳的特点1.仪器简单、易自动化

电源、毛细管、检测器、溶液瓶。2.分析速度快、分离效率高

在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105～107/m理论塔板数。3.操作方便、消耗少

进样量极少，水介质中进行。4.应用范围极广

有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等。

2025/11/13内容选择结束9.1概述

9.2

高效毛细管电泳仪

9.3高效毛细管电泳的理论基础

9.4

高效毛细管电泳的分离模式

9.5应用与进展2025/11/13第九章

高效毛细管电泳分析法9.2.1高效毛细管电泳仪9.2.2流程与主要部件9.2.3进样方式第二节

高效毛细管电泳仪Highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCEHighperformancecapillaryelectrophoresisapparatus2025/11/139.2.1高效毛细管电泳仪2025/11/13仪器22025/11/13仪器32025/11/139.2.2仪器流程与主要部件

主要由高压电源、缓冲液及进样系统、毛细管柱、检测器及数据处理等五部分组成。

电压：0～50kV；分离柱不涂敷任何固定液；紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：10-19～10-21

mol·L-1）2025/11/131.高压电源（1）0～50

kV

稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；2.毛细管柱

（1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差。（2）规格：内径20～75μm，外径350～400μm；长度

1m。2025/11/133.缓冲液池

化学惰性，机械稳定性好。4.检测器

要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化。2025/11/139.2.3毛细管电泳的进样方式

进样量：毛细管长度的1%～2%；纳升级、非常小。1.流体力学进样方式（1）进样端加压（2）出口端抽真空（3）虹吸进样2025/11/132.电动进样方式特别适合黏度大的试样。存在的问题：

进样不均：电歧视现象，淌度大的离子比淌度大的进样量大。离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去。3.扩散进样

试样通过扩散作用进入分离柱端口处。2025/11/13内容选择结束9.1概述9.2高效毛细管电泳仪

9.3高效毛细管电泳的理论基础

9.4

高效毛细管电泳的分离模式

9.5应用与进展*第九章

高效毛细管电泳分析法9.3.1PHCE基本原理9.3.2PHCE中的基本基本关系式9.3.3影响分离效率的因素第三节

高效毛细管电泳理论基础Highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCEBasictheoryofHPCE2025/11/13双电层与电渗流在pH溶液中，毛细管内壁与溶液间出现双电层。管内壁带负电荷，柱内溶液表面带正电荷。电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流(Electroosmoticflow，EOF)现象。电渗流现象：柱内溶液整体向负极移动。2025/11/13分离过程

带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。

正离子：两种效应的方向一致，在负极流出；（动画）

中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，阳离子后流出；

阴离子：两种效应的运动方向相反。ν电渗流<ν电泳时，在阳极流出。ν电渗流>ν电泳时，阴离子随电渗流在负极流出，在这种情况下，不但可以按类分离，同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。*9.3.1高效毛细管电泳基本原理

电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度。迁移速度与哪些因素有关？

当带电离子以速度ν

在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：FE=QE

阻力：F=f

e故：

QE=f

eQ—离子所带的有效电荷；E—电场强度；

e—离子在电场中的迁移速度；f—摩擦系数。*所以，带电离子在溶液中的迁移速度：

物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。

淌度μ

：单位电场强度下的平均电泳速度。

被分离组分的保留时间t为：μe

：电泳迁移率（电泳淌度,单位：cm2·V-1·s-1），E：电场强度，V：电压；L：毛细管长度（有效长度为l）。

Q为离子所带的静电荷,f为stokes阻力系数*对于球形离子：

f=6πηrRs

—离子的表观液态动力学半径；η—介质的粘度；从上式可见，当毛细管长度一定时，带电离子的迁移速度与溶质离子的电荷、施加的电压、缓冲液黏度及带电离子的大小有关。电渗流是驱动离子运动的第二种作用力。*双电层与电渗流

石英毛细管柱，内充液pH>3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。

在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，形成电渗流，速度ν电渗流。*1.HPCE中电渗流的大小与方向

电渗流的大小用电渗流速度

eo表示，取决于电渗流迁移速度μeo和电场强度E。即：

eo=μeo

E电渗流迁移速度μeo取决于电泳介质及双电层的Zeta电位

，即：l

—毛细管有效长度；teo—电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。

为溶剂的介电常数；

为双电层的Zeta电位。实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算*HPCE中电渗流的方向

电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；石英毛细管：内表面带负电荷，电渗流流向阴极。改变电渗流方向的方法：

（1）毛细管改性

表面键合阳离子基团。

（2）加电渗流反转剂

内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。*2.HPCE中电渗流的流形

电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小），应避免毛细管两端出现高度差而改变流形，降低分离效率；

液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。*3.HPCE中电渗流的作用

电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；

各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：

+=

e+

eo阳离子运动方向与电渗流一致；

-=

e-

eo阴离子运动方向与电渗流相反；

ν0=ν

eo中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。*4.HPCE中影响电渗流的因素(1)电场强度的影响

电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。(2)毛细管材料的影响

不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同。*(3)

电解质溶液性质的影响（a）溶液pH的影响

对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；

pH<3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（b）阴离子的影响

在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液粘度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。**(4)

温度的影响

毛细管内温度的升高，使溶液的粘度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”。

焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；

HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1

C，将引起背景电解质溶液粘度变化2%～3%。*(5)

添加剂的影响（a）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。（b）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向。加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大。（c）加入有机溶剂，如甲醇、乙腈，使电渗流增大。*9.3.2HPCE中的基本关系式1.迁移时间（保留时间）

HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。V—外加电压；L—毛细管总长度；

l—毛细管有效长度；

ap=+eo

。*2.分离效率（塔板数）在HPCE中，仅存在纵向扩散：σ2=2Dt

从上式可以看出，提高分离电压是增加分离效率的主要途径。

扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。在理想条件下，理论塔板数可达106块。*3.分离度

影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。提高毛细管电泳的分辨率有两条途径：一是通过增大分离电压来提高柱效；二是控制电渗流，当电渗流移动方向与分离组分的迁移方向相反，而速度大小相等时，分辨率将趋于无穷大。分离度也可按谱图直接由下式计算：*9.3.3影响分离效率的因素—区带展宽1.纵向扩散的影响

在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：σ2=2Dt

由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.进样的影响

当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：

Winj=(24Dt)1/2实际操作时进样塞长度

毛细管总长度的1%～2%。*3.电解效应的影响

工作中，阳、阴两极最有可能发生的电极反应分别为：

阳极：4OH-=2H2O+O2↑+4e-

阴极：2H++2e-=H2↑

阳极：OH-被消耗而H+量相对增加；阴极：H+消耗而使OH-量相对增加。通电时间越长，电流越大，两极溶液的pH差越大。电泳缓冲溶液：缓冲试剂、pH调节剂、溶剂和添加剂。电渗流与双电层有关。当缓冲液浓度(或离子强度)改变时，影响溶液的黏度、双电层的Zeta电位，导致电渗流速度改变。

*电解效应的影响规律

电渗流与双电层有关，当缓冲液浓度(或离子强度)

，溶液的黏度

，双电层的厚度

，Zeta电位

，电渗流速度

，分辨率

。

高浓度的电解质容易导致溶液过热，会引起电泳区带展宽，使分辨率降低。*4.焦耳热与温度梯度的影响

分离效率与电场强度成正比，但分离电压高，电泳过程产生焦耳热大，对分离不利。产生的焦耳热可由下式计算：

m—电解质溶液的摩尔电导；I—工作电流：cm—电解质浓度；

散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：

（1）减小毛细管内径。（2）控制散热。*5.溶质与管壁间的相互作用

存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽。

蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。

细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100～1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。*6.其他影响因素

（1）电分散作用对谱带展宽的影响

当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。（2）“层流”现象对谱带展宽的影响

一般情况下，HPCE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流；

产生的原因：毛细管两端液面高度不同。实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。*请选择内容9.1概述

9.2

高效毛细管电泳仪9.3高效毛细管电泳的理论基础

9.4

高效毛细管电泳的分离模式

9.5应用与进展结束2025/11/13第九章

高效毛细管电泳分析法9.4.1毛细管区带电泳9.4.2毛细管凝胶电泳9.4.3胶束电动毛细管色谱9.4.4毛细管等电聚焦9.4.5毛细管等速电泳9.4.6

毛细管电渗色谱第四节

高效毛细管电泳分离模式Highperformancecapillary

electrophoresis,HPCESeparatetypesofHPCE

2025/11/13分离类型八种分离类型，介绍常用的几种；根据试样性质不同，采用不同的分离类型；每种机理的选择性不同。2025/11/139.4.1毛细管区带电泳

Capillaryzoneelectrophoresis，CZE

带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出。中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响在阳离子后流出。

阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流>ν电泳时，阴离子在负极最后流出,在这种情况下，不但可以按类分离，同种类离子由于差速迁移被相互分离。

最基本、应用广的分离模式。2025/11/139.4.2毛细管凝胶电泳

Capillarygelelectrophoresis，CGE

将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN测序的重要手段。

特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。2025/11/13

1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。9.4.3胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）

Micellarelectrokineticcapillarychromatography

在电场力的作用下，胶束在柱中移动。2025/11/13

2.电泳流和电渗流的方向相反，且

电渗流>

电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动。

5.色谱与电泳分离模式的结合。

3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。2025/11/13

1.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术。2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6～8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度。3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零。9.4.4毛细管等电聚焦

Capillaryisoelectricfocusing，CIEF2025/11/13

4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离。

5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液。6.加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测。7.电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。2025/11/13

1.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。9.4.5毛细管等速电泳

Capillaryisotachophoresis，CITP2025/11/13

3.不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(ν=μE

)，淌度大的离子区带电场强度小。沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中离子跑到“1”号区，离