DB15∕T 2785-2022 食用向日葵品种纯度鉴定 SNP标记法

ICS67.050

CCSX04

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2785—2022

食用向日葵品种纯度鉴定SNP标记法

Varietalverificationoftheconfectionsunflower(Helianthusannuus

L.)SNPmarkertechnology

2022-08-30发布2022-09-30实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2785—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC20）归口。

本文件起草单位：三瑞农业科技股份有限公司、华智生物技术有限公司、巴彦淖尔市产品质量计量

检测中心（巴彦淖尔市天赋河套质量标准检验研究中心）、内蒙古自治区质量和标准化研究院。

本文件主要起草人：JIUHUANFENG（冯九焕）、唐顺学、陈海军、李昊佼、李新、刘劼、邬冬梅、

秀芳、侯敏、魏志恒、白君君、王祉诺、贾向春、靳存旺。

I

DB15/T2785—2022

食用向日葵品种纯度鉴定SNP标记法

1范围

本文件规定了利用单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism,SNP）分子标记进行食用向

日葵（HelianthusannuusL.）品种纯度鉴定的术语定义、原理、仪器设备及耗材、试剂及溶液配制、

检测程序、数据采集和结果分析、鉴定结果报告等要求。

本文件适用于食用向日葵品种的纯度鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

品种纯度varietalpurity

品种在特征特性或DNA分子标记基因型方面一致性的程度。通常用供检样品中本品种的个体数占检

测样品个体总数的百分率表示。

异型个体off-typeindividual

供检样品中，与本品种在DNA标记位点或一个或多个遗传性状上存在差异的个体。

单核苷酸多态性singlenucleotidepolymorphism（SNP）

基因组中基于单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。

推荐标记recommendedmarkers

品种纯度鉴定中优先选用的具有良好基因型分型质量的标记组合。

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竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应kompetitiveallelespecificPCR（KASP）

通过引物末端特异性碱基竞争性匹配DNA模板，实现SNP基因型分型的聚合酶链式反应。

基因型分型genotyping

通过检测方法确定某品种(或遗传材料)的基因、DNA区段或遗传标记的基因型。

4原理

不同向日葵品种的基因组间存在核苷酸序列差异，其中单核苷酸（A、C、G、T）多态性(SNP)在基

因组内分布广泛、密度高，这种差异可以通过荧光标记的KASP基因型分型等技术进行检测。

利用一套多态性高、具良好基因型分型质量的推荐标记，检测供检样品中不同个体间的基因型差

异，统计供检样品中异型个体数，从而对供检样品整体的遗传一致性程度进行测算，判定品种的纯度。

5仪器设备及耗材

主要仪器设备及耗材为：

——实时荧光定量PCR仪、全自动样品快速研磨仪、高速离心机、核酸浓度测定仪、微孔板离心

机、微量移液器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、酸度计、磁力搅拌器、电子天平、冰箱等；

——96孔深孔板、384孔PCR板（白色）、微量离心管、普通枪头、封板膜、钢珠等。

6试剂及溶液配制

试剂要求

6.1.1所用试剂至少为分析纯或分子生物学纯。试剂配制用水应符合GB/T6682规定的一级水要求。

6.1.2所需试剂为十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA•2H2O）、三羟甲基氨基甲烷

（Tris-base）、醋酸铵、三氯甲烷、异丙醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、乙

醇、PCRMasterMix等。

溶液配制

6.2.12mol/LTris-HCl溶液（pH8.0）：称取Tris碱242.8g，溶于850mL水中，加入浓盐酸调

pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌。

6.2.20.25mol/LEDTA溶液（pH8.0）：称取84.06gNa2EDTA•2H2O，溶于900mL水中，加固体NaOH

（约20g）调pH至8.0，加水定容至1000mL，高压灭菌。

6.2.310%SDS溶液：称取100gSDS，加水定容至1000mL。

6.2.4溶液I：取2mol/LTris-HCl（pH8.0）、0.25mol/LEDTA溶液（pH8.0）、10%SDS各100

mL，加水900mL，调pH至8.0，定容至1000mL。用时按2%（M/V）加入聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP-

K30）。

6.2.5溶液Ⅱ：取500g醋酸铵固体，加水定容至860mL，抽滤后放4℃冰箱备用。

6.2.62×KASPMasterMix：包括TaqDNA聚合酶、通用荧光引物、dNTP、镁离子、ROX内参荧光染料。

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6.2.7KASP引物：包括10µMPrimer_AlleleX、10µMPrimer_AlleleY、10µMPrimer_AlleleC。

7检测程序

样品准备

7.1.1供检样品可以为种子或幼叶。

7.1.2除供检样品外，必要时应提供对照品种、其亲本或亲本之一的样品。

7.1.3供检样品为种子时，重量应不低于500g。

7.1.4从供检样品分取规定数量的试样用于检测，试样的分取应符合GB/T3543.2的要求。

7.1.5依据需达到的品种纯度的国家规定的质量标准，试样数量应符合GB/T3543.5的规定，或通过

Seedcalc8计算。比如，在95%置信水平，要达到96%、98%、99%以上纯度质量标准，每个样品需检测的

种子数应分别不少于100粒、200粒、400粒。

DNA提取

DNA提取采用下列方法，其它能达到后续操作质量要求的DNA提取方法均适用于本文件：

——切取向日葵种子约1/3（通常选取非胚芽一端），或剪取叶片0.5cm～1cm大小，放入96

深孔板中，每孔1个样品。放入4mm钢珠，加100μL溶液I，用全自动样品快速研磨仪50

Hz研磨60s，重复2～3次，使样品完全破碎；

——于4000rpm离心约3min，小心打开胶盖（注意避免样品间污染）。加500µL溶液Ⅰ，盖

上胶盖，颠倒摇匀，65℃恒温水浴30min～50min；

——加300μL溶液II，颠倒摇匀后，于3600rpm离心20min；

——取上清液300μL移入新的96深孔板，加入0.6倍体积预冷的异丙醇，盖上胶盖，颠倒混

匀，-20℃静置10min。4000rpm离心15min，弃去上清液(勿使DNA倒掉)；

——加入约300μL70%乙醇，盖上胶盖，颠倒摇匀后4000rpm离心15min。70%乙醇重复洗涤

一次，方法同上；

——室温放置晾干，待DNA充分干燥后，加200μLddH2O充分溶解，4℃保存备用。

PCR检测

7.3.1总则

依据检测目的，统筹考虑检测规模和成本，确定适宜的样品检测数量及标记数量。

配制反应体系时，每板应同时设置2个无DNA模板阴性对照（NTC）。根据NTC信号强弱，判

断最适扩增循环数。若NTC信号过高，则应降低扩增循环数。

7.3.2推荐标记

推荐标记筛选原则及使用要求如下：

——选择遗传多态性高、基因组上分布均匀、基因型分型质量好、以及重复稳定性好的标记；

——本文件优先选用了17个SNP分子标记作为推荐标记（见附录A），用于检测所有试样个体的

基因型；

——对于仍处于遗传分离或不稳定的标记位点应予以剔除。若17个推荐标记中，有3个以上标

记位点出现严重的遗传分离，可终止该样品的纯度鉴定。

7.3.3实时荧光定量PCR反应体系

3

DB15/T2785—2022

本文件推荐以下反应体系，其它兼容KASP的检测体系均适用于本文件。依据PCR缓冲液类

型、微孔板类型及检测平台，试验条件可做相应调整。

PCR扩增反应体系参照表1进行配制，其中2×KASPMasterMix含有dNTP、TaqDNA聚合

酶、通用荧光引物及ROX荧光内参。

表1PCR扩增反应体系

成分原浓度终浓度推荐用量（μL）

DNA25ng/μL～50ng/μL7.5ng/μL～15ng/μL1.20

2×KASPMasterMix2×1×2.00

Primer_AlleleX10μM0.15μM0.06

Primer_AlleleY10μM0.15μM0.06

Primer_C10μM0.40μM0.16

ddH2O--0.52

总体积--4.00

7.3.4实时荧光定量PCR反应程序

荧光定量PCR反应通常采用下列程序：

——预变性：94℃预变性15min；

——梯度PCR：94℃变性20s，65℃退火和延伸60s（每循环降低0.8℃），10个循环；

——扩增：94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，荧光信号读取，30个循环。

注：以上为推荐的基于实时荧光定量PCR仪检测平台的扩增程序，其它如GenomicsSNPLine、ArrayTape、微流控

芯片等利用KASP技术实现基因型分型的检测平台同样适用于本文件。

8数据采集和结果分析

数据采集

8.1.1采用实时荧光定量PCR仪提供的数据分析软件，对每一标记产生的SNP荧光信号和基因型分型

值进行分析。

8.1.2按照分型明确、NTC(无样品阴性对照)无特异性扩增的原则，保留或剔除该位点的数据。若一个

标记的缺失数据率大于等于5%，需重做；单一个体检测成功率大于等于98%，若某个体的缺失标记位点

数大于等于2个，该个体数据则不予采用。

8.1.3数据记录为X/Y。其中，X、Y为同一位点上两个不同的等位变异，即纯合基因型记录为XX或

YY，杂合基因型记录为XY；缺失位点记录为-/-。

结果分析

8.2.1当供检样品中某个体在2个或2个以上标记位点与本品种标准基因型存在差异时，判定该个体

为异型个体。

8.2.2品种纯度按照下列公式计算：

品种纯度(%)=(检测个体总数-异型个体数)/检测个体总数×100%

8.2.3判定杂交种的品种纯度是否达到国家规定的质量标准、合同和标签标注指标要求，使用GB/T

3543.5规定的容许差距，容许差距按式（1）计算。

T=1.65√푝×푞/푁……（1）

4

DB15/T2785—2022

式中：

T－容许差距；

p－品种纯度的标准规定值；

q－100-p；

N－检测试样总数，单位为个。

8.2.4判定亲本或原种的品种纯度是否达到国家规定的质量标准、合同和标签标注指标要求，可按照

GB/T3543.5的规定，使用淘汰值判定。淘汰值可以通过Seedcalc8或如下式（2）计算：

R=X+1.65√푋+1.8……（2）

式中：

R－淘汰值（结果舍去所有小数位数，不采用四舍五入或六入）；

X－标准所换算成的异型个体数，单位为个。

9鉴定结果报告

品种纯度检测结果可按下列方式填报：

对编号为供检样品，采用检测平台，利用个推荐标记进行纯度检测。

结果显示：在份供检样品中，份为异型个体，该供检样品的纯度为％。

具体检测结果可填入表2。

表2品种纯度鉴定结果

供检样品编号供检样品类型推荐标记数供检样品数异型个体数纯度％

注：供检样品存在遗传不稳定或严重分离的标记位点为：

5

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A

A

附录A

（规范性）

推荐引物序列及基因组位置

17个推荐标记的KASP引物序列及基因组位置信息见表A.1。

表A.1推荐引物序列及基因组信息

标记IDLGPrimer_AlleleX/Ya(5’-3’)Primer_AlleleC(5’-3’)基因组位置b

GCACACGCAGAGCACCTACTT

PCP011GCACACGCAGAGCACCTACTCGTGTAAGATGTGGTAGACGCAGCTT144989472

GCATATTAACAGGCAAGAACACTTGT

PCP022GCATATTAACAGGCAAGAACACTTGCGTCTGTAATGATCTTGCAGCTGCGAA144865512

GAAATTCCGGTCCCGCATTCCAT

PCP033AAATTCCGGTCCCGCATTCCACGGACTTTGGTTTTGAGGATCGGTGAA113166971

GGCTTACCATCTTGACATTATGGGTT

PCP044GCTTACCATCTTGACATTATGGGTGTATGGCATCAACGAGGTATCCAGATAATA456506

CAAGGGTTGTATACAACACAAAGGCA

PCP055AAGGGTTGTATACAACACAAAGGCGCAAGCTGCAAGTTTCTTTAGCAAATCCAA154220962

ATGTTGTGTTATGCAAGTGAGAGAGTT

PCP066GTTGTGTTATGCAAGTGAGAGAGTGCACCTTAACGATATTAACCCGATGGTTAT38051242

TACGATGACGTTGTGGAACGACTT

PCP077CGATGACGTTGTGGAACGACTCGCCTGATTTTAGATGGATCGTCTAAGTTT115935118

GAGAGCGAGTTCACCAACATAATGT

PCP088AGAGCGAGTTCACCAACATAATGCCCACGGTTGAACCCTGATACTTGTT48738858

GCATCATCAAAGAATCGAGCTAGCA

PCP099CATCATCAAAGAATCGAGCTAGCGAATTAAATTTCATTATGCTAGCTGACT137888783

CAAGTTCATAACAGAGAAGATTTTCAGAAT

PCP1010AAGTTCATAACAGAGAAGATTTTCAGAACCGAAACCTTGTGAAACTTGTTGGTTACTA27896920

ATCTTTGACACCACCAAACTCTAGTAT

PCP1111CTTTGACACCACCAAACTCTAGTACGTACATCCAA