丙酮酸乙酯在CDDP对抗肝癌中的增效作用研究

丙酮酸乙酯在CDDP对抗肝癌中的增效作用研究肝癌是临床上常见的消化系统恶性肿瘤之一，国内发病率在恶性肿瘤中占第三，死亡率高居第二；其包括原发性肝癌和转移性肝癌，其中原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一。肝癌的可能危险因素包括乙型肝炎和丙型肝炎感染、酒精性肝病或非酒精性脂肪肝。肝癌是一种抗化疗肿瘤，具有过度表达多重抗药性（MDR）基因。目前，肝癌仍需进行有效的系统化疗。CDDP的抗癌性质在二十世纪六十年代被意外发现，它是一种主要的光谱化疗剂，用于治疗包括肝癌在内的许多恶性肿瘤；但其计量依赖性的副作用限制了其大剂量的管理[27]，但临床上CDDP仍被应用于睾丸癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌等多种实体肿瘤，而且均有一定疗效。CDDP与多种抗肿瘤药有着协同作用且无交叉耐药、疗效确切的特点。EP是一种脂溶性丙酮酸衍生物，用作稳定的食品添加剂，对人体相对无毒。EP具有抗炎、抗氧化以及抗肿瘤作用；在多种炎症反应中起炎性介质的抑制、抗氧化等作用，可降低炎症损伤，保护脏器。EP也是HMGB1的抑制剂，HMGB1是一种重要的晚期炎症介质，在多种恶性肿瘤组织中高表达并与肿瘤的远处转移及预后相关，而EP作为HMGB1的抑制剂，能抑制HMGB1的表达；因此其通过调节HMGB1-RAGE和AKT途径抑制胃癌的生长[8]。HMGB1是一种非组蛋白染色体蛋白，在真核细胞中丰富表达。HMGB1既是炎症的早期启动者，更是炎症晚期的促进者；其可主动释放至细胞外，参与肿瘤的发生发展、侵袭和转移[12]。细胞质HMGB1可以促进自噬和增加对抗癌药的耐药性[23]；细胞核HMGB1也可参与DNA修复[24,25]，从而降低了抗癌药的敏感性和放射敏感性。对于抗癌药，增加的DNA修复能力就会导致对药物的敏感性降低。同时HMGB1可以与CDDP-DNA加合物结合并修复DNA损伤，因此抑制HMGB1被认为会降低癌细胞修复DNA的能力并其抑制CDDP的抵抗力[25,26]。CDDP通过诱导细胞凋亡损伤肿瘤细胞，凋亡诱导与DNA合成和修复的预防有关，这可能导致G1，S或G2/M期的细胞周期停滞[28]。尽管单一CDDP或EP治疗已显示出抗肝癌活性，但尚未报道这两种药物的联合作用。在此，将进行CDDP联合EP处理，并与CDDP单药处理HepG2细胞的效果比较，研究在EP作用下细胞核内外HMGB1水平表达对CDDP的抗癌作用的影响。同时通过建立荧光标记的HepG2细胞荷瘤裸鼠模型，并对荷瘤裸鼠进行不同组合的药物处理；然后通过研究测定，比较裸鼠的体重、肿瘤大小、肿瘤增殖抑制率等，以阐明联合EP下的CDDP，可通过对HMGB1的表达调节，从而增强CDDP抑制体内HepG2细胞的增殖作用。1材料与方法1.1实验材料

6周龄的BALB/c(nu/nu)裸鼠SPF级，雄性，购自**大学；裸鼠的垫料、饲料、小鼠肝癌HepG2细胞购自**公司；CCK8检测试剂盒、RIPA裂解液（强）、PMSF、SDS凝胶配制试剂盒、HMGB1RabbitPolyclonalAntibody、PCNARabbitMonoclonalAntibody、β-ActinMouseMonoclonalAntibody、Dylight800,GoatAnti-RabbitlgG(H+L)Dylig、Dylight680、GoatAnti-MouselgG(H+L)Dyligh、Goat-Rabbit-lgG-Alexa-Fluor-488(ab150)、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒、WB封闭液、WB转膜液购自**公司；DMEM培养基、FBS胎牛血清购自**公司。1.2细胞的培养

(1)将购买的HepG2细胞经过75%酒精消毒后置于细胞培养箱中培养；

(2)每隔24小时将HepG2细胞换液；

(3)当HepG2细胞长到对数生长期末时进行传代；(4)按第2步骤和第3步骤培养细胞，直至HepG2细胞的数量满足各实验需求。1.3CCK-8检测CDDP与EP的细胞毒性并测定药物IC50(1)96孔板接种对数生长期的HepG2细胞，培养24小时；(2)将96孔板划分为对照组、CDDP组、EP组、CDDP-EP组进行给药；(3)24h后加入CCK-8溶液，继续培养后用酶标仪在450nm波长处检测其吸光度（OD）值；(4)实验重复3次，处理所得数据，用SPSS24.0软件计算药物处理的IC50值，选择最佳给药浓度。1.4裸鼠HepG2肿瘤模型的建立及活体成像(1)准备5-6周龄的BALB/c(nu/nu)雄性裸鼠24只（体重约20-25g）；(2)培养带转染p-Gluc荧光标记的HepG2细胞，长到至细胞数量达到可用于裸鼠移植瘤接种；(3)DMEM制成约1Χ107个/ml的HepG2细胞悬液，注射器吸取100μl细胞悬液，在裸鼠右侧近前肢内侧进行皮下注射；(4)培养大约14天后成瘤，成瘤5天后选择肿瘤生长良好、直径约1cm、体积100-200mm3的裸鼠作模型；(5)用600μl的荧光底物（D-luciferin,potassiumsalt，30mg/ml）与800μl的1%的戊巴比妥钠混合，取200-240μl左右用于裸鼠腹腔注射（I.P.）麻醉裸鼠；(6)肿瘤侧面朝上进行活体成像，并拍照记录（视野为BF，曝光时间为15ms）；然后转“LUCI”暗视野观察，拍照记录（曝光时间30000ms），将裸鼠明视野照片与暗视野照片拟合后合并导出图像；1.5裸鼠体内用药效果测定将荷瘤裸鼠随机分成4组，标记为对照组、CDDP组、EP组、CDDP-EP组，每组6只，通过I.P.注射；从加药处理起持续6周，每隔3天给药1次；同时，每三天测量记录体重1次，同时测量肿瘤双垂径并计算肿瘤大小（肿瘤体积计算公式：V=1/2ΧDmaxΧ(Dmin)2）活体拍照记录。(3)处理结束后，处死裸鼠并取出实体瘤称重，瘤重抑制率=(1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)Χ100%，统计实验结果。1.6统计分析采用GraphPadPrism5进行数据分析，计量以均数±标准差（X±s）表示，组间的比较采用单因素方差分析（t检验），*P<0.05为差异具有统计学意义，**P<0.01有显著性差异。2实验结果2.1CCK-8检测细胞毒性96孔板中接种HepG2细胞，培养24h后进行对照组、CDDP组、EP组、CDDP-EP组分组给药，24h后加CCK-8溶液，用酶标仪检测吸光度，得图1。由药物处理后细胞存活率的曲线图可知，不论是CDDP处理还是EP处理后均对HepG2细胞的生长有抑制作用，且在一定范围内随着药物浓度的增大，抑癌作用越显著；作用时间越长，抑癌作用也更加强大。对于4组不同处理后所得细胞存活率的比较，CDDP-EP组的抑癌作用最为显著，其次是EP和CDDP组，而CDDP-EP组的肿瘤抑制作用远远大于EP和CDDP组，这表明CDDP和EP的联合用药具有协同作用。图1不同药物处理后CCK-8检测细胞存活率2.2不同药物处理后裸鼠肿瘤的活体成像观察通过建立裸鼠移植瘤模型后，本研究成功获得24只肿瘤大小约1cm的荷瘤裸鼠。然后将荷瘤裸鼠随机分4组，分别进行PBS、CDDP、EP单药腹腔（I.P.）注射及CDDP与EP联合I.P.注射，一周加药两次，每次加药前进行肿瘤大小的观察与拍照记录（如图2，0day），连续记录6周。42天以后，对裸鼠进行活体成像观察，结果见图2。从活体成像图上红色区域显示的部分可以看出，EP组的肿瘤大小与对照组比较，没有发生明显变化；而CDDP组与CDDP-EP组的肿瘤均小于对照组，且CDDP-EP组的肿瘤大小明显小于对照组（*P<0.05），活体成像结果说明CDDP和EP联合注射能有效地控制移植瘤的大小。图2不同药物处理后裸鼠肿瘤的活体成像2.3裸鼠不同药物处理后裸鼠的体重变化情况将荷瘤裸鼠随机分成4组后，进行CDDP与EP的腹腔注射，一周加药两次，每次加药前进行对裸鼠体重的测量与记录，连续记录6周。42天以后，对裸鼠体重的平均变化进行记录，结果见图3。CDDP-EP组中裸鼠的平均体重为21g，CDDP组中为19g；另外，EP组与对照组中裸鼠的体重都约为25g。通过对CDDP组与组的体重变化比较发现，CDDP联合EP加入缓解了裸鼠个体体重剧烈减小的趋势，在6周后仍维持正常小鼠的体重，而CDDP组的裸鼠的个体明显消瘦。这一观察结果表明，EP是一种有效的CDDP增效剂，CDDP-EP联合作用不仅维持了CDDP药物的化疗效果，也减小了CDDP药物带来的体重的降低（*P<0.05）。图3不同药物处理后裸鼠体重的平均变化2.4裸鼠在不同药物处理后移植瘤的体积变化情况对荷瘤裸鼠进行CDDP与EP的腹腔注射，一周加药两次，每次加药前进行肿瘤大小的记录，连续记录6周。42天的观察与处理后，结果如图4。结果可见随着用药次数增加，CDDP组与CDDP-EP组的肿瘤体积得到抑制，增长速度较对照组与EP组明显减缓，并且CDDP-EP组对肿瘤体积的抑制作用较为明显。这一观察结果表明，CDDP和EP的联合用药可有效稳定移植瘤的体积（*P<0.05）。图4不同药物处理后裸鼠肿瘤的体积的平均变化2.5CDDP-EP联合处理裸鼠后移植瘤的活体解剖观察处理42天后将所有裸鼠都处以安乐死，并对其移植瘤进行活体解剖观察，结果如图5A。测量后得出，对照组与和EP组的平均肿瘤直径为569.33mm3和692.25mm3；然而，CDDP-EP组与CDDP组的平均大小分别为467.25mm3和257.25mm3。从而可知CDDP-EP组中肿瘤平均大小明显小于对照组；而CDDP组与对照组比较，无明显减小（见图5B）。图5A裸鼠移植瘤的活体解剖图 图5B药物处理42天后裸鼠的肿瘤体积(*P=0.0146)2.6不同药物处理后裸鼠的瘤重抑制率通过不同药物处理裸鼠后，第42天颈椎脱臼处死裸鼠，在无菌条件下取出实体瘤称重，计算出其瘤重抑制率[瘤重抑制率=(1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)Χ100%]。结果见表1，CDDP组与CDDP-EP组的肿瘤抑制率分别为36.80%和62.90%。通过对各组瘤重抑制率比较，可以看出CDDP-EP组对肿瘤的抑制有一定的作用（*P<0.05）。表1不同处理后裸鼠的瘤重抑制率不同处理瘤重抑制率(%)CK0.00EP6.82CDDP36.80CDDP-EP62.903结论本研究结果显示，对于4组不同处理后的体外HepG2细胞，CDDP-EP组的抑癌作用最为显著，且CDDP-EP组的肿瘤抑制作用远远大于EP和CDDP单独给药时的抑制作用效果的总和，这表明CDDP和EP的联合用药具有协同作用。同时，对于不用药物处理的裸鼠体内肿瘤比较后发现，CDDP组和EP组的肿瘤体积相比较对照组没有显著的变化，而CDDP-EP组的裸鼠肿瘤体积显著小于对照组；CDDP组的裸鼠个体较对照组显著消瘦，而联合用药则缓解了CDDP单独用药时裸鼠个体体重明显减小的趋势。另外，CDDP-EP组对肿瘤体积的抑制作用较为明显，肿瘤抑制率也明显较大。综上所述