DB15∕T 2594-2022 紫花苜蓿组织培养技术规程

ICS65.020.20

CCSB21

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2594—2022

紫花苜蓿组织培养技术规程

Technicalcodeofpracticefortissuecultureofmedicagosativa

2022-06-24发布2022-07-24实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2594—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。

本文件起草单位：中国农业科学院草原研究所、内蒙古农业大学。

本文件主要起草人：徐春波、王勇、赵海霞。

I

DB15/T2594—2022

紫花苜蓿组织培养技术规程

1范围

本文件规定了紫花苜蓿组织培养的术语与定义、培养基、外植体、愈伤组织诱导培养、增殖培养、

分化培养、生根培养、炼苗与移栽等基本内容及技术要求。

本文件适用于紫花苜蓿组织培养育苗。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备

NY/T2306花卉种苗组培快繁技术规程

DB15/T1940西部沙樱组织培养技术规

3术语和定义

NY/T2306界定的术语和定义适用于本文件。

紫花苜蓿medicagosativaL.

属于豆科（Leguminosae）苜蓿属（Medicago）多年生草本植物。

4环境与器具灭菌

按照DB15/T1940操作。

5培养基

基本培养基

MS培养基、1/2MS、改良SH培养基和MSO培养基见附录A。

母液的配制和保存

5.2.1配制

将常用试剂配制成50～100倍的母液，严格按照GB/T603规定方法配制。所用激素均配制浓度为0.5

mg/mL，配制方法详见附录B。

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DB15/T2594—2022

5.2.2保存

母液配制好分别贴上标签，注明溶液名称、配制倍数、配制日期、配制者。母液贮存在4℃的冰箱

中。贮藏时间在3个月之内，有霉菌和沉淀产生，则不准许使用。

培养基的配制

5.3.1配制

配置1L培养基时，先加蒸馏水600ml～700ml，再加入7.5g琼脂，加热搅拌琼脂融化后加入25g

蔗糖，搅拌溶解后再分别加入母液，搅拌均匀，加蒸馏水定容至1L。

5.3.2pH值调节

用1mol/L的NaOH将配制好的培养基调到pH值5.8～6.0，用酸度计或精密pH试纸测定。

5.3.3分装和灭菌

配制好的培养基趁热分装。分装量以占培养容器的1/4～1/3为宜。切勿将培养基沾到瓶口和外壁上，

以免招致杂菌污染。分装后立即加盖，不同的处理做好标记。分装后进行灭菌，121℃状态下保持20min。

6外植体

无菌苗的培养

紫花苜蓿种子用75%的酒精灭菌3min～5min，无菌水冲洗，再用10%次氯酸钠消毒10min～15min，

无菌水冲洗5～6次后用灭菌的滤纸吸干种子表面的液体，接种到1/2MS培养基上。

外植体的选择和制备

取7d～10d无菌苗的子叶和下胚轴或15d～20d无菌苗的叶片、叶柄和茎段，将外植体剪成3mm～

5mm长的小块或小段。

7愈伤组织诱导培养

培养基

诱导培养基为改良SH+2.0mg/L2，4-D+0.5mg/L6-BA。

接种

将外植体接种在愈伤组织诱导培养基上，每2.5cm2～3cm2接种1个，均匀摆放，封好皿口，标明名

称和日期。

培养条件

白天25℃、晚上18℃，每天光照时间16h，光照强度1000Lux～2000Lux。

培养时间

培养20d～30d。

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DB15/T2594—2022

8增殖培养

培养基

增殖培养基1为MSO+0.5mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LAgNO3。增殖培养基2为MS+0.3mg/L

TDZ。

接种

在超净工作台上，将诱导出的愈伤组织转到增殖培养基上，每4cm2～5cm2接种1个，均匀摆放，封

好皿口，标明名称和日期。

培养条件

按照7.3进行。

培养时间

增殖培养基1培养14d～20d，移到增殖培养基2继续培养5d～7d，之后再移至增殖培养基1培养

10d～15d。

9分化培养

培养基

分化培养基为MS+0.2mg/LKT。

接种

在超净工作台上，将胚性愈伤组织转入分化培养基，每5cm2～6cm2接种1个，均匀摆放，封好瓶口，

标明名称和日期。

培养条件

按照7.3进行。

培养时间

培养40d～50d；每20d换1次培养基。

10生根培养

培养基

生根培养基为1/2MS。

接种

在超净工作台上，将长至3cm～5cm的小苗逐一转入生根培养基，每器皿接种1苗，封好瓶口，标

明名称和日期。

培养条件

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DB15/T2594—2022

按照7.3进行。

培养时间

培养20d～30d。

11炼苗与移栽

炼苗

选择生长健壮的组培苗，打开封口膜，放在自然光、室温下2d～3d。

基质

土:草碳:蛭石3:2:1混合。高压灭菌后装入花盆备用。

移栽

取出组培苗，洗掉培养基，栽入花盆，浇水，放入温室，适当保温，常规管理。待苗长至20cm～

30cm移栽至大田。

4

DB15/T2594—2022

A

A

附录A

（规范性）

基本培养基成分

基本培养基成分见表A.1。

表A.1基本培养基成分

类型组分MS培养基改良SH培养基MSO培养基

KNO31900.02830.01900.0

NH4NO31650.0463.01650.0

大量元素MgSO4·7H2O370.0185.0370.0

KH2PO4170.0400.0170.0

CaCl2·2H2O440.0166.0440.0

MnSO4·4H2O22.300----22.300

ZnSO4·7H2O8.6008.6008.600

H3BO36.200----6.200

微量元素KI0.830----0.830

Na2MoO4·6H2O0.2500.2500.250

CuSO4.5H2O40.0250.0250.025

CoCl2.6H2O0.0250.0250.025

Na2-EDTA37.3037.3037.30

铁盐

FeSO4.7H2O27.8027.8027.80

甘氨酸2.000--------

盐酸吡哆辛0.5009.5001.000

盐酸硫铵素0.1009.90010.000

有机物

烟酸0.500----1.000

肌醇100.000----100.000

尼克酸----4.500----

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B

B

附录B

（规范性）

激素的配制

激素的配制见表B.1。

表B.1激素的配制

类别名称配制方法灭菌方式存储方式

2，4-二氯苯氧乙酸

用适量无水乙醇溶解后加入去离冷藏（4℃），

（2，4-D）

生长素高温灭菌

子水定容。