基于网络药理学解析玉屏风散治疗哮喘的多维度作用机制

基于网络药理学解析玉屏风散治疗哮喘的多维度作用机制一、引言1.1研究背景1.1.1哮喘的现状哮喘是一种全球性的公共卫生问题，严重影响着人们的健康和生活质量。据统计，全球约有3.58亿哮喘患者，且患病率呈上升趋势。在我国，20岁及以上人群哮喘患病率为4.2%，患者总数达4570万。哮喘不仅给患者带来身体上的痛苦，还造成了沉重的经济负担。其治疗费用高昂，且因误工、影响睡眠等间接成本也不容忽视，据估算，哮喘经济负担约占全国卫生总费用的1%-2%。哮喘的发病机制极为复杂，涉及气道免疫-炎症机制、神经调节机制以及遗传因素等多方面。气道免疫-炎症机制中，外源性变应原激活T细胞，进而激活B淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性细胞等，释放多种炎症因子如组胺、白三烯等，引发气道慢性炎症、气道高反应性以及气道重构。神经调节机制方面，哮喘患者体内β肾上腺素受体功能低下，对吸入组胺和乙酰甲胆碱气道反应性增高，导致神经调节失衡。同时，遗传因素在哮喘发病中也起到重要作用，研究表明哮喘具有家族聚集性。此外，环境因素如过敏原、空气污染、呼吸道感染等也可能触发哮喘症状。尽管目前哮喘的治疗取得了一定进展，但仍存在诸多挑战。部分患者对现有治疗方案反应不佳，且长期使用某些药物如吸入性糖皮质激素存在副作用风险。因此，寻找新的治疗方法和药物，深入探究哮喘的发病机制，对于提高哮喘的治疗效果、改善患者生活质量具有重要意义。1.1.2玉屏风散的研究进展玉屏风散作为一种经典的补益类中成药，由白术、炙黄芪、防风三种药物组成。其传统功效为益气固表、敛汗，是气虚卫外不固的常用方剂，也是体质虚弱者预防感冒的良方。玉屏风散具有益气实卫、固表止汗、扶正祛邪等类似屏障的功效，故而得名。在临床应用中，其适应证广泛，包括气短、神疲乏力、面色恍白、腠理不固、体虚多汗、汗出恶风、易反复感受风邪等。近年来，玉屏风散在哮喘治疗中的应用逐渐受到关注。多项临床研究表明，玉屏风散能够辅助治疗哮喘，改善患者的临床症状和肺功能。其作用机制可能与调节机体免疫功能、减轻气道炎症反应有关。例如，玉屏风散可以增强机体的免疫力，提高呼吸道防御机能，减少过敏原对气道的刺激，从而降低哮喘发作的频率和程度。同时，它还可能通过调节炎症因子的表达，减轻气道炎症，降低气道高反应性。然而，目前对于玉屏风散治疗哮喘的具体作用靶点和分子机制尚不完全明确，有待进一步深入研究。1.1.3网络药理学的优势网络药理学是一门新兴的交叉学科，基于系统生物学的理论，融合多向药理学、生物信息学、计算机科学等多学科的技术和内容。它具有整体性和系统性的特点，突破了传统“一药一靶一病”的研究模式，从整体上探索药物与疾病的相关性。在中药研究中，网络药理学的优势尤为显著。中药成分复杂，往往是多成分、多靶点、多途径协同发挥作用，传统研究方法难以全面阐释其作用机制。网络药理学通过构建“疾病-基因-靶点-药物”等多层次网络，能够将中药的化学成分、作用靶点以及疾病相关基因整合在一起，全面分析中药对疾病网络的干预与影响。它可以加速药物靶点的发现和确认，通过对网络中关键节点的分析，挖掘中药发挥药效的潜在活性成分和作用机制，为解决中药有效成分不清、作用机制不明等问题提供了新的思路。此外，网络药理学还可以对联合用药或多组分药物可能产生的不良作用进行分析，确保药物的安全性，促进中药新药的研发和中药的现代化进程。1.2研究目的和意义本研究旨在运用网络药理学的方法，全面系统地解析玉屏风散治疗哮喘的作用机制。通过构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，筛选出玉屏风散治疗哮喘的关键活性成分和作用靶点，进一步对这些靶点进行功能富集分析和通路富集分析，揭示其潜在的分子生物学机制，为玉屏风散在哮喘治疗中的临床应用和新药研发提供理论依据。本研究具有重要的理论意义和实际应用价值。在理论方面，有助于深入理解玉屏风散治疗哮喘的多成分、多靶点、多途径作用特点，丰富和完善中药治疗哮喘的理论体系，推动中医药理论与现代医学的融合。同时，也为其他中药方剂作用机制的研究提供了新的思路和方法，促进网络药理学在中医药领域的广泛应用和发展。在实际应用方面，明确玉屏风散治疗哮喘的有效成分和作用靶点，可为玉屏风散的质量控制和标准化研究提供科学依据，提高其临床疗效和安全性。此外，研究结果还可能为哮喘的治疗提供新的药物靶点和治疗策略，有助于开发新型的哮喘治疗药物，从而改善哮喘患者的治疗效果，减轻患者的痛苦和经济负担，具有显著的社会效益和经济效益。二、网络药理学研究方法2.1数据来源2.1.1中药数据库本研究主要借助中医药系统药理学数据库与分析平台（TraditionalChineseMedicineSystemsPharmacologyDatabaseandAnalysisPlatform，TCMSP）来获取玉屏风散的化学成分。TCMSP是一个整合了大量中药信息的专业数据库，涵盖了499味常用中药、3311个化学成分、1956个对应靶点以及473种疾病的相关数据。其数据来源广泛，包括中医药典籍、现代科学文献以及实验研究结果等，具有较高的可靠性和权威性。在该数据库中，通过输入玉屏风散的三味药材，即白术、炙黄芪、防风，以口服生物利用度（OralBioavailability，OB）≥30%和类药性（Druglikeness，DL）≥0.18作为筛选条件，这是因为OB反映了药物经口服后被吸收进入体循环的程度，较高的OB值意味着药物更易被人体吸收利用；DL则衡量了化合物与已知药物在结构和性质上的相似程度，满足这两个条件的成分更有可能是发挥药效的活性成分。经过筛选，得到玉屏风散中潜在的活性化学成分。此外，还参考了中医药整合药理学研究平台（TraditionalChineseMedicineIntegrativePharmacologyDatabaseandAnalysisPlatform，TCMIP）以及ETCM（/）数据库。TCMIP提供了中药化学成分、靶点、通路以及疾病等多维度的整合信息，通过与TCMSP数据相互验证和补充，进一步完善玉屏风散化学成分的收集。ETCM数据库则侧重于中药的现代研究成果，收录了众多中药化学成分的相关研究文献，有助于获取更全面的化学成分信息，为后续研究提供更坚实的数据基础。2.1.2疾病数据库为获取哮喘相关靶点信息，本研究运用了GeneCards、OMIM（OnlineMendelianInheritanceinMan）等数据库。GeneCards是一个综合性的人类基因数据库，整合了来自多个权威数据源的基因、蛋白质和疾病相关信息，提供了关于基因功能、表达模式、疾病关联等多方面的详细数据。在该数据库中，以“asthma”作为关键词进行检索，能够获取大量与哮喘相关的基因靶点，这些靶点信息经过严格的筛选和整理，具有较高的可信度。OMIM是一个在线人类孟德尔遗传数据库，专注于收集和整理单基因遗传病的相关信息，但其中也包含了许多与复杂疾病如哮喘相关的基因数据。通过在OMIM数据库中查询“asthma”，可以获取到与哮喘发病机制、遗传易感性等相关的关键基因靶点，这些靶点对于深入了解哮喘的病理生理过程具有重要意义。同时，还参考了DisGeNET数据库，该数据库整合了来自多个数据源的疾病-基因关联信息，涵盖了多种疾病类型，包括哮喘。通过对这些数据库的数据进行交叉比对和综合分析，确保所获取的哮喘相关靶点信息的全面性和准确性，为后续研究奠定坚实的基础。2.2研究流程2.2.1活性成分筛选运用中医药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为筛选条件，对玉屏风散中的白术、炙黄芪、防风三味药材的化学成分进行筛选。OB值反映了药物经口服后被吸收进入体循环的程度，较高的OB值意味着药物更易被人体吸收利用，从而发挥药效。DL值则衡量了化合物与已知药物在结构和性质上的相似程度，满足该条件的成分更有可能具备药物活性。经过筛选，得到了玉屏风散中潜在的活性化学成分。同时，为确保活性成分筛选的全面性和准确性，还参考了中医药整合药理学研究平台（TCMIP）以及ETCM数据库。TCMIP提供了更为丰富的中药化学成分、靶点及通路等信息，通过与TCMSP数据相互验证和补充，进一步完善了玉屏风散活性成分的收集。ETCM数据库则侧重于中药的现代研究成果，收录了众多关于中药化学成分的研究文献，有助于获取更全面的化学成分信息。最终，从玉屏风散中筛选出[X]个活性成分，这些活性成分将作为后续研究的基础，为揭示玉屏风散治疗哮喘的作用机制提供关键线索。2.2.2靶点预测与收集针对筛选得到的玉屏风散活性成分，利用TCMSP数据库中已有的靶点信息，获取其对应的作用靶点。对于TCMSP数据库中未收录靶点信息的活性成分，借助SwissTargetPrediction等数据库和相关软件进行反向分子对接预测。SwissTargetPrediction数据库基于分子结构相似性原理，通过计算活性成分与已知靶点配体的结构相似度，预测其可能作用的靶点。在哮喘相关靶点收集方面，以“asthma”作为关键词，在GeneCards、OMIM等数据库中进行检索。GeneCards整合了来自多个权威数据源的基因、蛋白质和疾病相关信息，提供了丰富的哮喘相关基因靶点。OMIM专注于收集单基因遗传病信息，但也包含了许多与复杂疾病如哮喘相关的基因数据。通过在这些数据库中查询，获取了大量与哮喘发病机制、遗传易感性等相关的基因靶点。同时，参考DisGeNET数据库，对收集到的哮喘相关靶点进行交叉比对和综合分析，确保靶点信息的全面性和准确性。最后，将玉屏风散活性成分靶点与哮喘相关靶点进行汇总，为后续研究提供充足的数据支持。2.2.3构建药物-靶点-疾病网络将玉屏风散活性成分及其对应的靶点信息，以及哮喘相关靶点信息整理成表格形式，导入Cytoscape软件中。在Cytoscape软件中，将活性成分设置为源节点，靶点设置为目标节点，疾病（哮喘）也设置为一个节点，通过连接这些节点构建药物-靶点-疾病网络。在构建过程中，根据成分与靶点之间、靶点与疾病之间的相互作用关系，确定节点之间的连线。构建完成后，利用Cytoscape软件中的插件，如NetworkAnalyzer等，对网络的拓扑学参数进行分析。这些参数包括节点度（Degree）、中介中心性（BetweennessCentrality）、接近中心性（ClosenessCentrality）等。节点度反映了节点与其他节点连接的数量，度值越高，说明该节点在网络中的重要性越高，可能是发挥关键作用的成分或靶点。中介中心性衡量了节点在网络中最短路径上的出现频率，中介中心性高的节点在信息传递和网络连通性方面起着重要作用。接近中心性则表示节点与其他所有节点的平均距离，接近中心性高的节点能够快速地与网络中的其他节点进行信息交流。通过对这些拓扑学参数的分析，深入了解药物-靶点-疾病网络的结构特征，筛选出在网络中具有重要作用的关键活性成分和靶点。2.2.4蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建将玉屏风散活性成分与哮喘的交集靶点导入STRING数据库，设置物种为“Homosapiens”，置信度阈值设定为0.4（Mediumconfidence），以确保获取到具有一定可靠性的蛋白质相互作用关系。在该数据库中，通过对已有的蛋白质相互作用实验数据、文本挖掘结果以及同源蛋白预测等多种信息源的整合，生成蛋白质-蛋白质相互作用网络。生成网络后，将其下载并导入Cytoscape软件中进行进一步分析和可视化处理。在Cytoscape软件中，利用插件如CytoNCA等对PPI网络进行拓扑学分析，计算节点的度值、中介中心性等参数。根据这些参数，筛选出度值较高、中介中心性较大的核心靶点。这些核心靶点在PPI网络中处于关键位置，与其他靶点之间存在广泛的相互作用，可能在玉屏风散治疗哮喘的过程中发挥着核心调控作用。通过对核心靶点的研究，有助于深入揭示玉屏风散治疗哮喘的潜在分子机制。2.2.5基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析将玉屏风散活性成分与哮喘的交集靶点上传至DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）数据库，进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。GO分析从生物过程（BiologicalProcess，BP）、细胞组成（CellularComponent，CC）和分子功能（MolecularFunction，MF）三个层面，对基因的功能进行注释和分类。生物过程层面，主要涉及细胞代谢、信号传导、免疫调节等过程；细胞组成层面，关注基因产物在细胞内的定位，如细胞膜、细胞核、细胞器等；分子功能层面，则描述基因产物的生化活性，如酶活性、受体结合能力等。KEGG分析主要用于识别与输入基因相关的信号通路和代谢途径。KEGG数据库包含了大量的生物通路信息，通过富集分析，可以确定哪些信号通路在玉屏风散治疗哮喘的过程中被显著富集，从而揭示其潜在的作用机制。在分析过程中，设定P值阈值为0.05，将P值小于0.05的GO条目和KEGG通路视为具有统计学意义的显著富集结果。对富集结果进行整理和分析，绘制柱状图、气泡图等可视化图表，直观展示富集的GO条目和KEGG通路，为深入理解玉屏风散治疗哮喘的分子机制提供有力依据。三、玉屏风散治疗哮喘的活性成分与靶点分析3.1活性成分鉴定通过在中医药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）中，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为筛选条件，对玉屏风散中的白术、炙黄芪、防风三味药材进行检索，结合中医药整合药理学研究平台（TCMIP）以及ETCM数据库进行补充和验证，最终筛选出[X]个玉屏风散活性成分。这些活性成分涵盖了多种类型的化合物，包括黄酮类、萜类、酚类等，具有丰富的化学结构和多样的生物活性。在筛选出的活性成分中，槲皮素（Quercetin）是一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物，化学式为C₁₅H₁₀O₇，相对分子质量为302.24。其基本母核由2个苯环（A和B）通过一个含氧的芘环（C环）相连，共有5个羟基，呈现出独特的平面结构。槲皮素为黄色粉末（甲醇），其二水合物为黄色针状结晶，熔点在313-314℃，微溶于水，易溶于碱性水溶液、热乙醇、甲醇、醋酸乙酯、冰醋酸、吡啶等有机溶剂。研究表明，槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等多种生物活性。在抗氧化方面，其抗氧化能力是维生素E的50倍、维生素C的20倍，能有效清除超氧阴离子、羟自由基和单线态氧，通过与超氧阴离子络合、与铁离子络合、抑制脂质过氧化过程以及抑制醛糖还原酶等多种途径，提高机体抗氧化能力。在抗炎方面，槲皮素可以抑制炎症因子的释放，调节炎症相关信号通路，减轻炎症反应。山奈酚（Kaempferol）也是一种黄酮类化合物，化学式为C₁₅H₁₀O₆，相对分子质量为286.23。其单体纯品为黄色结晶状粉末，熔点为276-278℃，微溶于水，可溶于热乙醇、乙醚和DMSO等有机溶剂。山奈酚主要来源于姜科植物山柰的根茎，在各种水果、蔬菜及饮料中也广泛存在。它具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多种功效。在抗癌方面，研究报道高摄入山奈酚会降低晚期大肠腺瘤的复发，还能明显降低患胰腺癌的风险，最新研究表明其能抑制与儿童髓母细胞瘤生长和转移有关的肝细胞生长因子（HGF）及其受体酪氨酸蛋白激酶。在抗炎方面，山奈酚主要通过抑制炎症因子的表达来达到抗炎效果。除此之外，还筛选出了汉黄芩素（Wogonin）、刺芒柄花素（Formononetin）、异鼠李素（Isorhamnetin）等活性成分。汉黄芩素是一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒以及抗肿瘤等多种生物活性。刺芒柄花素属于异黄酮类化合物，具有雌激素样作用、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性。异鼠李素同样是黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、降血脂、降血糖等多种生理活性。这些活性成分的化学结构和性质各异，可能通过不同的作用机制协同发挥治疗哮喘的作用。3.2作用靶点预测通过TCMSP数据库获取了玉屏风散[X]个活性成分对应的靶点信息，对于数据库中未收录靶点的活性成分，利用SwissTargetPrediction数据库进行反向分子对接预测，共得到[X]个潜在作用靶点。在哮喘相关靶点收集方面，以“asthma”作为关键词，在GeneCards数据库中检索得到[X]个哮喘相关靶点，在OMIM数据库中得到[X]个相关靶点，同时参考DisGeNET数据库，对收集到的哮喘相关靶点进行交叉比对和综合分析，最终汇总得到[X]个哮喘相关靶点。将玉屏风散活性成分靶点与哮喘相关靶点进行汇总，利用韦恩图（VennDiagram）在线分析工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），对玉屏风散活性成分靶点和哮喘相关靶点进行交集分析。经过分析，得到玉屏风散治疗哮喘的潜在作用靶点[X]个。这些交集靶点是玉屏风散活性成分与哮喘疾病之间相互作用的关键节点，可能在玉屏风散治疗哮喘的过程中发挥着重要作用。例如，肿瘤坏死因子（TNF）是一种重要的炎症因子，在哮喘的发病过程中，TNF的表达升高，可诱导气道炎症细胞的浸润和活化，促进炎症因子的释放，导致气道炎症和气道高反应性。而玉屏风散中的某些活性成分可能作用于TNF靶点，调节其表达和活性，从而减轻哮喘的炎症反应。又如，白细胞介素-6（IL-6）也是一种与哮喘密切相关的细胞因子，它参与了哮喘的免疫调节和炎症反应过程。玉屏风散作用于IL-6靶点，可能对哮喘的治疗起到积极的作用。这些交集靶点为进一步深入研究玉屏风散治疗哮喘的分子机制提供了重要线索。3.3核心靶点筛选将玉屏风散活性成分与哮喘的交集靶点导入STRING数据库，构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。在构建过程中，设置物种为“Homosapiens”，置信度阈值设定为0.4（Mediumconfidence），以确保获取到具有一定可靠性的蛋白质相互作用关系。随后，将生成的PPI网络下载并导入Cytoscape软件中进行进一步分析和可视化处理。利用CytoNCA插件对PPI网络进行拓扑学分析，计算节点的度值、中介中心性等参数。通过分析，筛选出度值较高、中介中心性较大的核心靶点，如白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）等。IL-6是一种多效性的细胞因子，在哮喘的发病机制中起着关键作用。在哮喘患者体内，多种细胞如T淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞等受到刺激后会分泌IL-6。IL-6可以促进B淋巴细胞的增殖和分化，使其产生更多的免疫球蛋白E（IgE）。IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的受体结合，当再次接触过敏原时，会引发这些细胞的脱颗粒反应，释放组胺、白三烯等炎症介质，导致气道炎症和气道高反应性。此外，IL-6还能激活T淋巴细胞，促进Th17细胞的分化，Th17细胞分泌的白细胞介素-17（IL-17）等细胞因子进一步加剧气道炎症和气道重构。TNF同样是哮喘发病过程中重要的炎症介质。它主要由活化的单核巨噬细胞产生，在哮喘患者气道中，TNF的表达显著升高。TNF可以诱导气道上皮细胞、平滑肌细胞等产生多种炎症因子，如白细胞介素-8（IL-8）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等，吸引中性粒细胞、单核细胞等炎症细胞浸润到气道，加重气道炎症。同时，TNF还能促进气道平滑肌细胞的增殖和迁移，参与气道重构过程。此外，TNF还可以增强气道上皮细胞的通透性，使过敏原更容易进入气道，激发免疫反应。这些核心靶点在PPI网络中处于关键位置，与其他靶点之间存在广泛的相互作用，它们可能是玉屏风散治疗哮喘的关键作用靶点，通过对这些核心靶点的调控，玉屏风散可能发挥其治疗哮喘的作用。四、玉屏风散治疗哮喘的作用机制探讨4.1信号通路分析4.1.1PI3K-Akt信号通路PI3K-Akt信号通路在细胞的存活、增殖、代谢以及炎症反应等多种生理病理过程中发挥着关键作用，在哮喘发病机制中也占据重要地位。在哮喘患者的气道中，多种刺激因素如过敏原、炎症因子等可激活PI3K。PI3K被激活后，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作为第二信使，招募并激活蛋白激酶B（Akt）。活化的Akt通过磷酸化一系列下游底物，产生多种生物学效应。在哮喘发病过程中，Akt的活化可促进炎症细胞如嗜酸性粒细胞、肥大细胞等的存活和增殖。嗜酸性粒细胞在气道中的大量浸润是哮喘气道炎症的重要特征之一，Akt的激活可抑制嗜酸性粒细胞的凋亡，使其在气道中持续存在并释放多种炎症介质，如嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）、白三烯等，加重气道炎症。肥大细胞在受到过敏原刺激后，通过PI3K-Akt信号通路活化，释放组胺、白三烯等生物活性物质，引发气道平滑肌收缩、血管通透性增加等病理变化，导致哮喘症状的发作。此外，PI3K-Akt信号通路还参与调节气道平滑肌细胞的增殖和迁移。哮喘患者气道平滑肌细胞的增殖和迁移增加，导致气道壁增厚，管腔狭窄，这是气道重构的重要病理改变之一。Akt的活化可促进气道平滑肌细胞的增殖相关基因的表达，如细胞周期蛋白D1（CyclinD1）等，加速细胞周期进程，促进细胞增殖。同时，Akt还可调节细胞骨架相关蛋白的磷酸化，影响气道平滑肌细胞的迁移能力，进一步促进气道重构。玉屏风散可能通过调节PI3K-Akt信号通路来发挥治疗哮喘的作用。研究表明，玉屏风散中的活性成分如槲皮素、山奈酚等可能作用于PI3K-Akt信号通路的关键靶点，抑制PI3K的活性，减少PIP3的生成，从而阻断Akt的激活。例如，槲皮素可以与PI3K的催化亚基结合，抑制其酶活性，减少PIP3的产生，进而抑制Akt的磷酸化。Akt活性的降低，可减少炎症细胞的存活和增殖，抑制炎症介质的释放，减轻气道炎症。同时，抑制Akt的活化还可以抑制气道平滑肌细胞的增殖和迁移，延缓气道重构的进程。通过对PI3K-Akt信号通路的调节，玉屏风散可能从多个方面改善哮喘的病理生理过程，发挥其治疗哮喘的作用。4.1.2TNF信号通路肿瘤坏死因子（TNF）信号通路在哮喘炎症过程中扮演着关键角色。TNF是一种重要的促炎细胞因子，主要由活化的单核巨噬细胞产生。在哮喘患者的气道中，TNF的表达显著升高，其可通过与靶细胞表面的TNF受体（TNFR）结合，激活一系列下游信号分子，引发复杂的炎症反应。TNF与TNFR1结合后，可募集肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域蛋白（TRADD），进而招募受体相互作用蛋白1（RIP1）和TNF受体相关因子2（TRAF2），形成死亡诱导信号复合物（DISC）。DISC的形成可激活核因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。NF-κB是一种重要的转录因子，在静息状态下，它与抑制蛋白IκB结合，以无活性的形式存在于细胞质中。当DISC激活IκB激酶（IKK）后，IKK磷酸化IκB，使其降解，从而释放出NF-κB，NF-κB进入细胞核，与靶基因的启动子区域结合，促进多种炎症因子如白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等的转录和表达。这些炎症因子吸引中性粒细胞、单核细胞等炎症细胞浸润到气道，加重气道炎症。同时，MAPK信号通路包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，它们被激活后可磷酸化下游的转录因子，如c-Jun、ATF-2等，调节炎症相关基因的表达，进一步促进炎症反应。此外，TNF信号通路还可诱导气道上皮细胞、平滑肌细胞等产生一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）等炎症介质，这些介质可导致气道平滑肌舒张或收缩功能异常，增加气道高反应性。玉屏风散可能通过多种方式干预TNF信号通路来治疗哮喘。研究发现，玉屏风散中的活性成分如汉黄芩素、刺芒柄花素等可能抑制TNF的表达和释放，减少其与TNFR的结合，从而阻断TNF信号通路的激活。汉黄芩素可以抑制单核巨噬细胞中TNF-α的mRNA表达，降低TNF-α的分泌水平。同时，玉屏风散中的某些成分可能作用于TNF信号通路的下游分子，抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活。通过抑制NF-κB的活化，减少炎症因子的转录和表达，降低炎症细胞的浸润和活化。抑制MAPK信号通路的激活，可减少炎症相关基因的表达，减轻炎症反应。此外，玉屏风散还可能调节气道上皮细胞、平滑肌细胞等对TNF的反应性，降低炎症介质的产生，减轻气道高反应性。通过对TNF信号通路的多环节干预，玉屏风散发挥其减轻哮喘气道炎症的作用。4.1.3IL-17信号通路IL-17信号通路与哮喘的气道炎症和重塑密切相关。IL-17是由Th17细胞分泌的一种促炎细胞因子，在哮喘患者的气道中，Th17细胞数量增加，IL-17的表达显著升高。IL-17通过与靶细胞表面的IL-17受体（IL-17R）结合，激活下游信号通路，发挥其生物学效应。IL-17与IL-17R结合后，可招募IL-17受体相关蛋白（Act1），形成IL-17-IL-17R-Act1复合物。该复合物可激活核因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，还可激活C/EBP家族转录因子。NF-κB被激活后，进入细胞核，促进多种炎症因子如IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等的转录和表达。这些炎症因子吸引中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞浸润到气道，加剧气道炎症。MAPK信号通路的激活可调节炎症相关基因的表达，进一步促进炎症反应。C/EBP家族转录因子的激活可促进基质金属蛋白酶（MMPs）等的表达，MMPs可降解细胞外基质，导致气道结构破坏，参与气道重构过程。此外，IL-17还可促进气道上皮细胞分泌趋化因子，如CXCL1、CXCL5等，这些趋化因子可特异性地招募中性粒细胞到气道，加重气道炎症。同时，IL-17还能促进气道平滑肌细胞的增殖和迁移，增加胶原蛋白等细胞外基质的合成，导致气道壁增厚，管腔狭窄，促进气道重构。玉屏风散可能通过调节IL-17信号通路来改善哮喘的气道炎症和重塑。研究表明，玉屏风散中的活性成分可能抑制Th17细胞的分化和IL-17的产生，减少IL-17与IL-17R的结合，从而阻断IL-17信号通路的激活。玉屏风散中的某些成分可以调节辅助性T细胞（Th）亚群的平衡，抑制Th17细胞的分化，降低IL-17的表达水平。同时，玉屏风散可能作用于IL-17信号通路的下游分子，抑制NF-κB、MAPK和C/EBP家族转录因子的激活。通过抑制这些信号通路的激活，减少炎症因子和趋化因子的表达，降低炎症细胞的浸润和活化，减轻气道炎症。此外，抑制C/EBP家族转录因子的激活，可减少MMPs等的表达，抑制气道平滑肌细胞的增殖和迁移，减少细胞外基质的合成，从而延缓气道重构的进程。通过对IL-17信号通路的调节，玉屏风散发挥其治疗哮喘的作用，改善哮喘患者的气道炎症和气道重构等病理变化。4.2生物学过程分析4.2.1炎症反应调节在哮喘的发病过程中，炎症反应起着核心作用，涉及多种炎症细胞和炎症因子的参与。当机体接触过敏原后，气道中的肥大细胞、嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞等炎症细胞被激活，释放出一系列炎症因子，如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-8（IL-8）等。这些炎症因子相互作用，形成复杂的炎症网络，导致气道炎症、气道高反应性以及气道重构。玉屏风散中的多种活性成分对炎症因子具有显著的调节作用。槲皮素作为玉屏风散的主要活性成分之一，具有强大的抗炎活性。研究表明，槲皮素可以通过抑制核因子-κB（NF-κB）信号通路的激活，减少炎症因子的转录和表达。在哮喘模型中，槲皮素能够降低哮喘小鼠肺组织中TNF、IL-6、IL-1β等炎症因子的水平，减轻气道炎症。具体机制为，槲皮素可以与NF-κB的p65亚基结合，抑制其磷酸化和核转位，从而阻断NF-κB与炎症相关基因启动子区域的结合，减少炎症因子的产生。山奈酚也具有明显的抗炎作用。它可以抑制脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞中炎症因子的释放，通过调节丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，抑制细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK的磷酸化，减少炎症相关基因的表达。在哮喘治疗中，山奈酚可能通过抑制炎症细胞的活化和炎症因子的释放，减轻气道炎症，降低气道高反应性。汉黄芩素同样具有抗炎特性。它可以抑制巨噬细胞中一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）的产生，这两种物质是重要的炎症介质，参与哮喘的炎症反应。汉黄芩素通过抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧化酶-2（COX-2）的表达，减少NO和PGE2的合成。同时，汉黄芩素还可以调节细胞因子的分泌，抑制TNF、IL-6等促炎细胞因子的表达，促进白细胞介素-10（IL-10）等抗炎细胞因子的产生，从而调节炎症反应的平衡。通过对这些活性成分的研究可知，玉屏风散可能通过多成分协同作用，从多个环节抑制炎症因子的产生和释放，调节炎症相关信号通路，从而发挥其抗炎作用，减轻哮喘患者的气道炎症，改善哮喘症状。4.2.2免疫调节哮喘是一种免疫介导的慢性炎症性疾病，其发病与机体的免疫调节失衡密切相关。在哮喘患者体内，Th1/Th2细胞失衡是重要的免疫病理特征之一。正常情况下，Th1细胞主要分泌干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子，参与细胞免疫，抵抗细胞内病原体感染；Th2细胞主要分泌白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）、白细胞介素-13（IL-13）等细胞因子，参与体液免疫，在过敏反应中发挥重要作用。在哮喘患者中，Th2细胞功能亢进，分泌大量Th2型细胞因子，促进B淋巴细胞产生免疫球蛋白E（IgE）。IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力受体结合，使这些细胞致敏。当再次接触过敏原时，过敏原与致敏细胞表面的IgE结合，引发肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放组胺、白三烯等炎症介质，导致气道炎症和气道高反应性。此外，调节性T细胞（Treg）在维持免疫耐受和免疫平衡中起着关键作用。Treg细胞可以通过分泌白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等抑制性细胞因子，抑制效应T细胞的活化和增殖，调节免疫反应。在哮喘患者中，Treg细胞数量减少或功能缺陷，导致免疫耐受失衡，免疫反应过度激活，加重哮喘的炎症反应。玉屏风散对免疫细胞和免疫分子具有显著的调节作用。研究表明，玉屏风散可以调节Th1/Th2细胞平衡，抑制Th2细胞的过度活化，减少Th2型细胞因子的分泌。玉屏风散中的黄芪、白术等成分可以促进Th1细胞的分化和功能，增加IFN-γ的分泌，从而抑制Th2细胞的优势状态，调节免疫平衡。黄芪多糖是黄芪的主要活性成分之一，它可以通过激活Toll样受体4（TLR4）信号通路，促进树突状细胞的成熟和活化，增强树突状细胞对Th1细胞的诱导作用，从而调节Th1/Th2细胞平衡。同时，玉屏风散还可以增加Treg细胞的数量，增强其功能。玉屏风散中的活性成分可能通过调节相关信号通路，促进Treg细胞的分化和增殖，提高Treg细胞分泌抑制性细胞因子的能力。白术内酯Ⅰ可以通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路，促进Treg细胞的增殖和功能，抑制Th17细胞的分化，从而调节免疫平衡，减轻哮喘的炎症反应。此外，玉屏风散还可以调节B淋巴细胞的功能，减少IgE的产生。它可能通过抑制Th2细胞因子对B淋巴细胞的刺激作用，降低B淋巴细胞向浆细胞的分化，减少IgE的合成和分泌。玉屏风散中的活性成分可能作用于B淋巴细胞表面的受体或相关信号通路，抑制IgE的产生，从而减轻过敏反应，缓解哮喘症状。通过对免疫细胞和免疫分子的调节，玉屏风散可以改善哮喘患者的免疫调节失衡状态，增强机体的免疫防御能力，减轻免疫介导的气道炎症，发挥其治疗哮喘的作用。4.2.3气道重塑抑制气道重塑是哮喘的重要病理特征之一，它是指在长期慢性炎症的刺激下，气道结构发生改变，包括气道平滑肌细胞增生、肥大，成纤维细胞增殖，细胞外基质沉积，基底膜增厚，气道壁增厚等。这些病理改变导致气道管腔狭窄，气流受限，肺功能下降，且气道重塑一旦形成，往往难以逆转，严重影响哮喘患者的预后。在气道重塑过程中，气道平滑肌细胞（ASMCs）和成纤维细胞起着关键作用。ASMCs的增殖和迁移能力增强，导致气道平滑肌增厚，收缩性增强，这是气道高反应性的重要病理基础。多种生长因子和细胞因子参与ASMCs的增殖和迁移调控，如血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子-β（TGF-β）等。PDGF可以与ASMCs表面的受体结合，激活下游的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路，促进细胞增殖和迁移。成纤维细胞在气道重塑中主要负责细胞外基质的合成和分泌。在炎症因子和生长因子的刺激下，成纤维细胞被激活，转化为肌成纤维细胞，合成和分泌大量的胶原蛋白、纤连蛋白等细胞外基质成分，导致基底膜增厚和气道壁纤维化。TGF-β是促进成纤维细胞活化和细胞外基质合成的关键细胞因子，它可以通过激活Smad信号通路，调节相关基因的表达，促进成纤维细胞的增殖和分化，增加细胞外基质的合成。玉屏风散对气道平滑肌细胞和成纤维细胞具有明显的调节作用。研究表明，玉屏风散中的活性成分可以抑制气道平滑肌细胞的增殖和迁移。黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分之一，它可以抑制PDGF诱导的ASMCs增殖和迁移。黄芪甲苷通过抑制MAPK信号通路中ERK1/2的磷酸化，阻断细胞周期进程，抑制ASMCs的增殖。同时，黄芪甲苷还可以调节细胞骨架相关蛋白的表达和分布，抑制ASMCs的迁移。对于成纤维细胞，玉屏风散中的活性成分可以抑制其活化和细胞外基质的合成。白术内酯Ⅲ可以抑制TGF-β诱导的成纤维细胞活化，减少胶原蛋白和纤连蛋白的合成。白术内酯Ⅲ通过抑制Smad信号通路中Smad2/3的磷酸化，阻断TGF-β的信号传导，从而抑制成纤维细胞的活化和细胞外基质的合成。此外，玉屏风散还可能通过调节炎症反应和免疫功能，间接抑制气道重塑。减轻气道炎症可以减少炎症因子对气道平滑肌细胞和成纤维细胞的刺激，降低其活化和增殖程度。调节免疫平衡可以减少免疫介导的组织损伤和修复异常，从而抑制气道重塑的发生和发展。通过对气道平滑肌细胞、成纤维细胞等的调节，以及对炎症反应和免疫功能的间接影响，玉屏风散发挥其抑制气道重塑的作用，延缓哮喘病情的进展，改善患者的肺功能和预后。五、验证与展望5.1实验验证5.1.1细胞实验设计细胞模型选择人气道上皮细胞（如16HBE细胞）和小鼠巨噬细胞（如RAW264.7细胞）。16HBE细胞是一种常用的气道上皮细胞系，具有典型的气道上皮细胞特征，能够较好地模拟气道上皮的生理和病理过程，在哮喘研究中，可用于研究气道炎症、气道高反应性以及气道重塑等相关机制。RAW264.7细胞是一种巨噬细胞系，巨噬细胞在哮喘的免疫炎症反应中起着关键作用，它可以吞噬病原体、分泌炎症因子，调节免疫反应，通过对RAW264.7细胞的研究，能够深入了解哮喘炎症过程中免疫细胞的功能和作用机制。实验分组设置为正常对照组、模型组、玉屏风散低剂量组、玉屏风散中剂量组、玉屏风散高剂量组以及阳性对照组。正常对照组给予常规细胞培养液培养；模型组用脂多糖（LPS）刺激细胞，以诱导炎症反应，模拟哮喘的炎症状态。LPS是一种细菌内毒素，能够激活巨噬细胞等免疫细胞，使其分泌大量炎症因子，如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）等，从而引发炎症反应，与哮喘气道炎症的发生机制相似。玉屏风散低、中、高剂量组在给予LPS刺激的同时，分别加入不同浓度的玉屏风散含药血清。含药血清的制备方法为：选取健康的SD大鼠，灌胃给予玉屏风散水煎液，按照临床等效剂量的不同倍数设置低、中、高剂量组，连续灌胃一定天数后，腹主动脉取血，分离血清，得到玉屏风散含药血清。阳性对照组加入已知具有抗炎作用的药物，如地塞米松，作为阳性对照，以验证实验的可靠性。检测指标主要包括炎症因子的表达水平，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞培养上清液中TNF、IL-6、白细胞介素-1β（IL-1β）等炎症因子的含量。ELISA是一种常用的免疫检测技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，能够准确地检测细胞培养上清液中炎症因子的含量，反映细胞的炎症状态。同时，利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测炎症相关基因的mRNA表达水平，如诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧化酶-2（COX-2）等。qRT-PCR可以通过检测基因的mRNA表达量，了解基因的转录水平，从而深入探究玉屏风散对炎症相关基因表达的影响机制。此外，还可以采用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测相关信号通路蛋白的表达和磷酸化水平，如核因子-κB（NF-κB）信号通路中的p65蛋白、IκB蛋白等。Westernblot能够检测蛋白质的表达水平和修饰状态，通过分析信号通路蛋白的表达和磷酸化水平，明确玉屏风散对相关信号通路的调控作用。5.1.2动物实验设计动物模型选用OVA诱导的哮喘小鼠模型。具体建立方法为：选取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，适应性饲养1周后进行实验。在第0天和第14天，小鼠腹腔注射OVA（20μg）与氢氧化铝（1mg）的混合液，进行致敏。氢氧化铝作为佐剂，能够增强OVA的免疫原性，促进小鼠机体产生免疫反应。从第21天开始，小鼠置于雾化箱中，每天雾化吸入1%OVA溶液20min，连续7d，进行激发。在激发过程中，OVA作为过敏原，刺激小鼠气道，引发气道炎症、气道高反应性等哮喘症状，成功建立哮喘小鼠模型。实验步骤如下：将小鼠随机分为正常对照组、模型组、玉屏风散低剂量组、玉屏风散中剂量组、玉屏风散高剂量组以及阳性对照组，每组10只。正常对照组给予生理盐水腹腔注射和雾化吸入；模型组给予OVA腹腔注射和雾化吸入；玉屏风散低、中、高剂量组在OVA致敏和激发的同时，每天分别灌胃给予不同剂量的玉屏风散水煎液。阳性对照组在OVA激发期间，每天腹腔注射地塞米松（1mg/kg）。实验过程中，密切观察小鼠的行为学变化，如呼吸频