DB51-T 3309-2025 猕猴桃雄花粉脱除溃疡病菌生产技术规程

ICS65.020.20DB51.DB51/T3309—2025前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4雄株种植 5雄株管理 6雄株溃疡病防控 7雄花脱菌处理 8生产档案 附录A（规范性）猕猴桃雄花采集状态判别 4附录B（资料性）花粉活力检测方法 5附录C（资料性）花粉带猕猴桃溃疡病菌（活菌）检测方法 6附录D（资料性）猕猴桃雄花生产记录 8附录E（资料性）猕猴桃雄花花粉活力及脱菌处理记录 9参考文献 DB51/T3309—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由四川省农业农村厅提出、归口、解释并组织实施。本文件起草单位：四川农业大学、都江堰猕哆哆农业科技有限公司、都江堰市农业农村局、四川省农业科学院园艺研究所、广元市农业科学研究院、广元市林木种苗管理站。本文件主要起草人：龚国淑、姚凯凯、马苗苗、唐合均、周佳佳、陈华保、吴翠平、涂美艳、何成勇、王玲利、晏志强、康超勇、赵柳。DB51/T3309—20251猕猴桃雄花粉脱除溃疡病菌生产技术规程本文件规定了猕猴桃的雄株种植、雄株管理、雄株溃疡病防控、雄花脱菌处理和生产档案等方面的本文件适用于猕猴桃雄株种植与雄花脱菌处理。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T8321（所有部分）农药合理使用准则DB51/T2096红阳猕猴桃生产技术规程DB51/T3069猕猴桃主要病虫害绿色防控技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1猕猴桃溃疡病kiwifruitbacterialcanker由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonassyingaepv.actinidiae，简称Psa）引起的一种具有毁灭性的细菌性病害，主要危害主干、枝蔓、叶片和花蕾，具有隐蔽性、爆发性和极强传染性等特点。3.2猕猴桃雄花kiwifruitmaleflower雌蕊和子房退化，雄蕊发达，以产生和传播花粉为主的猕猴桃雄株上的单性花。3.3脱菌处理operationofkillingPseudomonassyringaepv.actinidiae在不影响花粉活力的前提下，利用臭氧对猕猴桃雄花携带的溃疡病菌进行灭活处理的操作。4雄株种植4.1种植模式包括以生产猕猴桃雄花制作花粉为主的雄株单一种植，和以自然授粉为主的雄株搭配种植。4.2品种与砧木选择4.2.1宜选择广适性好、花量大、出粉多、抗溃疡病强的美味猕猴桃或中华猕猴桃雄株品种。不同雌株品种宜搭配专用雄株。4.2.2宜选用抗逆性、嫁接亲和力强的专用砧木。4.2.3以雄花生产为主要用途的雄株单一种植园，宜采用多品种搭配种植策略，错峰收获雄花。2DB51/T3309—20254.3雄株单一种植4.3.1宜在海拔高度1000m及以下，年均温13℃~20℃,无霜期大于260d，年降雨量800mm～1800mm，10℃及以上积温4500℃~6000℃,绝对低温在-2℃及以上，背风向阳的丘陵或山地选址建园。土层深厚、透气良好，土壤pH值5.0～6.5，地下水位在1.0m以下，土壤种类以轻壤土、中壤土、砂壤土为宜。4.3.2风害较严重区域，主迎风面宜配置防风林或防风墙。4.3.3新建园栽植株距宜为1.5m～3.0m，行距宜为3.0m～3.5m。4.3.4藤蔓棚架宜选用T型架或水平棚架。4.4雄株搭配种植4.4.1雌株间搭配雄株自然授粉生产园，雌雄比例以5:1～8:1为宜，雄株均匀分布于雌株间。4.4.2架型以双层架为宜，主架与辅助棚架高差1m左右。5雄株管理5.1整形修剪5.1.1根据立地条件和栽植株行距选择合理树形，包括单主干单主蔓十侧蔓、单主干双主蔓二十侧蔓或单主干无主蔓多侧蔓等。5.1.2采花后及时重剪，以回缩为主；冬季轻剪，以短截为主。修剪过程中每剪一株树应用75%酒精对修剪工具、剪锯口进行消毒，修剪伤口宜涂抹保护剂、愈合剂。5.2肥水管理5.2.1幼树期肥水管理遵循勤施薄施原则。进入大量产花年份后，每年采花后至7月初宜以高氮型复合肥为主，7月中旬至9月下旬宜以均衡型复合肥为主，10月施基肥一次，以腐熟有机肥为主。施肥方法、用量根据树龄、树势和产花量按照DB51/T2096的相关规定执行。5.2.2高温干旱应及时灌溉，积水严重应及时排涝。5.3病虫害防控冬季休眠期至萌芽前，结合修剪和清园，全园喷施1次3°Bé~5°Bé石硫合剂。猕猴桃溃疡病防控按6.1、6.2执行，其他病虫害防控按照DB51/T3069的相关规定执行。6雄株溃疡病防控6.1药剂选择猕猴桃溃疡病宜选用中生菌素、春雷霉素、春雷·王铜、噻菌铜、噻霉酮等进行防治。农药使用应符合GB/T8321的规定。6.2施药时间与方法6.2.1绒球期均匀喷施主干及侧枝，以枝干表面均匀形成一层水膜为宜。6.2.2现蕾期至采花前，全园喷施药剂1次～2次，间隔时间宜为7d～10d，重点喷施雄花蕾及花梗，以雄花蕾表面均匀形成一层水膜为宜。6.2.3全园雄花采摘完成，重剪后，全园施药1次。DB51/T3309—202536.2.4落叶前，全园施药1次～2次，间隔时间宜为7d～10d。7雄花脱菌处理7.1雄花采集期7.1.1宜在猕猴桃雄花处于铃铛状且萼片完全开裂，花瓣处于含苞待放且尚未见花药时的大蕾期采集，所采集的雄花状态应符合附录A中图A.1的规定。7.1.2雄花宜在晴天采摘，自采摘离树到加工场所应保持新鲜状态。7.2脱菌处理7.2.1采用鼓风干燥或自然阴干雄花，充分除去表面水分，以手感无水渍为宜。7.2.2将表面干燥的雄花装入带有臭氧发生器的密闭容器内，花量以达容器1/3为宜。7.2.3在臭氧浓度为600mg/m3～630mg/m3下密闭处理10min～15min，处理过程中应连续缓慢转动容器；经处理后的雄花立即转入花粉生产环节。7.3脱菌处理效果检测7.3.1花粉活力检测见附录B。7.3.2花粉带猕猴桃溃疡病菌活菌检测见附录C。8生产档案8.1雄花生产记录雄花生产应包括肥水管理、修剪管理、猕猴桃溃疡病防治、采花管理等，见附录D。8.2脱菌处理记录脱菌处理记录应包括雄花产地来源、品种名称、采集日期、臭氧浓度、处理时间、花粉活力等信息，见附录E。8.3档案保存上述材料应归档并妥善保存2年以上。各环节应及时做好登记和相应负责人签字。DB51/T3309—20254（规范性）猕猴桃雄花采集状态判别用于臭氧脱菌处理的猕猴桃雄花应符合图A.1的规定。半开放（见图A.2）和全开放（见图A.3）猕猴桃雄花均不符合规定。图A.1含苞待放铃铛状的猕猴桃雄花图A.2半开放的猕猴桃雄花图A.3全开放的猕猴桃雄花DB51/T3309—20255（资料性）花粉活力检测方法B.1仪器、试剂与耗材仪器：显微镜、0.001g电子天秤、电磁炉、生化培养箱；试剂：蔗糖、硼酸、琼脂；耗材：烧杯、量筒、吸管、玻棒、载玻片、培养皿、离心管。B.2检测样品抽取B.2.1抽样数量花粉瓶10瓶（件）以下，逐瓶抽取；10瓶至100瓶，随机选10瓶抽取；100瓶以上，按照该批花粉总瓶数的平方根数抽取，见公式（B.1）。式中：N——每批花粉总瓶（件）数。n——应抽取瓶（件）数（取整数，小数部分向上约）。B.2.2抽样方法将花粉瓶充分振荡，混匀容器内的花粉，用无菌药匙从瓶中取2g花粉放入无菌离心管内，即为1份待检测花粉。取每瓶（件）花粉时应更换药匙。B.3培养基制备将蔗糖100g、硼酸0.15g、琼脂10g和蒸馏水1000mL倒入烧杯中，放在电磁炉上加热并不断搅拌，直至完全溶解。用吸管或玻棒吸取4～5滴融化的培养基，滴在平放的载玻片中央，使其自然扩散成均匀薄层，静置冷却凝固后备用。B.4花粉接种与培养用无菌牙签轻轻蘸取每份待检测花粉，均匀撒布于载玻片培养基表面，然后将接种好的载玻片置于铺有湿润滤纸的培养皿内。每个样品设3次重复。将接种好的培养皿放入25℃生化培养箱，暗培养4h后观察。B.5花粉活力测定与统计取出载玻片，于10×10倍显微镜下观察。每个重复随机选取5个花粉分布均匀，且布满画面的视野拍照并计数。以花粉芽管长度≥花粉粒直径视为萌发。花粉活力以萌发率表示，见公式（B.2）。B.2）B.6结果判定样品其他质量指标均符合要求的前提下，且萌发率≥60%，判该批次花粉为合格品；否则判为不合格。DB51/T3309—20256（资料性）花粉带猕猴桃溃疡病菌（活菌）检测方法C.1仪器、试剂与耗材仪器：高压灭菌锅、电子天秤、超净工作台、PCR仪、离心机、凝胶成像系统、电泳仪、电泳槽、移液器、电磁炉、生化培养箱等；试剂：胰化蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂、琼脂糖、TAE电解液、PCR试剂、核酸染料等；耗材：烧杯、三角瓶、量筒、玻棒、培养皿、离心管、PCR管、吸头等。C.2检测样品抽取检测样品抽取同附录B中B.2。C.3LB培养基制备按酵母提取物5g、胰化蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂粉12g，蒸馏水1000mL配比配制，用NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌。C.4样品前处理C.4.1样品悬液制备在超净工作台内，称取待检测雄花粉1g，加入装有9mL无菌双蒸水的离心管中（内有适量玻璃珠）。旋紧管盖，立即置于振荡器上充分震荡2min，使花粉完全分散于水中，制成1:10（w/v）的样品悬液。C.4.2样品稀释无菌环境下吸取样品悬液1mL，加入9mL无菌双蒸水中，充分混匀，按10倍梯度连续稀释，制备10⁻1、10⁻²、10⁻³......（必要时继续稀释）系列样品稀释液。C.5平板培养与观察C.5.1LB平板涂布根据花粉带菌量，选择合适的浓度梯度，在无菌条件下吸取0.1mL不同梯度的样品稀释液，均匀涂布于LB固体培养基表面，每个梯度设3个重复。待平板上的样品液完全吸收后，25℃倒置培养48h。C.5.2Psa菌落的观察待LB平板上细菌菌落的大小和特征稳定后，与Psa的菌落形态特征进行比较，并统计不同梯度下的疑似菌落数。Psa典型菌落呈圆形、乳白色、表面光滑、边缘整齐（见图C.1）。DB51/T3309—20257图C.1Psa在LB固体培养基上菌落形态（正面）C.6PCR检测以每个平板疑似Psa的菌落数≤30个的全选，30个～250个则随机挑取30个的原则，对疑似菌落进行PCR检测。PCR检测所用引物对、反应体系及反应程序如下：Psa特异性引物对：F1/R2（正向引物：5'-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3'、反向引物：5'-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3，扩增片段长度为280bp）；用无菌ddH2O将合成的引物干粉稀释成10μmoL/L储存液。PCR扩增反应体系：2×TaqMasterMix12.5μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，加ddH2O补足到25μL，用无菌牙签挑取待检单菌落少许作为模板，混匀瞬时离心后进行PCR反应。PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物检测：PCR反应结束后，取5μLPCR产物于2%琼脂糖凝胶中电泳（120V，30min电泳结束后在凝胶成像系统下观察并成像，比对是否有目标条带。用已知的Psa标准菌株作为阳性对照；无菌ddH2O作为空白对照。C.7结果判定与阳性对照比对，若待检花粉在280bp处无目标条带，则判定该样品不携带活Psa，否则判定为携带活Psa。DB51/T3309—20258（资料性）猕猴桃雄花生产记录猕猴桃雄花生产记录见表D.1。表D.1猕猴桃雄花生产记录表DB51/T3309—20259（资料性）猕猴桃雄花花粉活力及脱菌处理记录猕猴桃雄花花粉活力及脱菌处理记录见表E.1。表E.1猕猴桃雄花花粉活力及脱菌处理记录表DB51/T3309—2025参考文献[1]KoukounarasA.Advancedgreenhousehorticulture:newtechnologiesandcultivationpractices[J].Horticulturae,2021,7(1):1.[2]龚国淑,李庆,张敏,等.猕猴桃