免疫学实验操作规程

免疫学实验操作规程一、概述

免疫学实验是研究机体免疫系统结构与功能的重要手段，广泛应用于医学、生物学等领域。为确保实验结果的准确性和可重复性，必须严格遵循标准化的操作规程。本规程涵盖了免疫学实验的基本原则、常用技术及质量控制要点，旨在为实验操作提供系统指导。

二、实验准备

（一）试剂与耗材

1.试剂配制：

(1)标准缓冲液：如磷酸盐缓冲液（PBS），pH值调至7.4±0.1。

(2)蛋白浓度测定试剂盒：使用Bradford法或BCA法，确保样品浓度在0.1-1.0mg/mL范围内。

(3)抗体工作液：稀释浓度根据说明书调整，常用范围1:100-1:1000。

2.耗材准备：

(1)一次性吸头、离心管、微量移液器枪头。

(2)垂直电泳槽、酶标板、细胞培养皿。

（二）仪器校准

1.微量移液器：校准量程误差≤±2%。

2.酶标仪：使用标准品校准吸光度值，偏差≤±1%。

三、核心实验技术

（一）ELISA实验

1.试剂准备：

(1)包被抗体：4℃过夜包被，封闭液（如封闭抗体）37℃封闭2小时。

(2)底物显色：TMB/H2O2体系，避光反应30分钟。

2.操作步骤：

(1)加样顺序：依次加入标准品、样品、酶标抗体。

(2)波长设置：450nm读数，参考波长调至600nm。

（二）WesternBlot实验

1.蛋白制备：

(1)细胞裂解：加入RIPA裂解液，冰上孵育30分钟。

(2)离心取上清，BCA法测定浓度。

2.电泳与转膜：

(1)SDS分离，电压设定100V，电泳2-3小时。

(2)PVDF膜转膜，湿转条件60V，2小时。

（三）流式细胞术实验

1.细胞染色：

(1)使用预混荧光抗体，避光孵育30分钟。

(2)PBS洗涤2次，避免固定剂干扰。

2.数据采集：

(1)设定门控区域，分析细胞凋亡率等指标。

(2)每样本计数≥10,000个细胞。

四、质量控制

（一）阳性对照设置

1.每组实验必须包含已知阳性对照，如ELISA的标准品曲线。

2.WesternBlot需使用内参蛋白（如β-actin）校准。

（二）重复性验证

1.关键实验需进行至少3次重复，计算变异系数（CV）≤10%。

2.流式细胞术数据需通过FSC/SSC双参数散点图剔除异常值。

（三）污染防控

1.使用无菌吸头避免交叉污染。

2.荧光实验需设置同型对照，排除非特异性结合。

五、实验记录与废弃物处理

（一）记录要点

1.记录试剂批号、操作人、环境温湿度。

2.保存原始数据，如酶标板吸光度值列表。

（二）废弃物分类

1.化学试剂需按危险品规定处理。

2.细胞培养物需高压灭菌后排放。

六、注意事项

1.操作前需用70%酒精手部消毒。

2.荧光实验需使用暗视野显微镜。

3.高温操作需佩戴隔热手套。

本规程适用于常规免疫学实验室操作，具体实验可根据实验目的调整参数。

**一、概述**

免疫学实验是研究机体免疫系统结构与功能的重要手段，广泛应用于医学、生物学等领域。为确保实验结果的准确性和可重复性，必须严格遵循标准化的操作规程。本规程涵盖了免疫学实验的基本原则、常用技术及质量控制要点，旨在为实验操作提供系统指导。它不仅有助于减少实验误差，提高数据可靠性，还能确保实验操作人员的安全。本规程适用于细胞培养、分子检测、蛋白质分析、免疫细胞功能测定等常规免疫学实验室工作。

二、实验准备

（一）试剂与耗材

1.试剂配制：

(1)标准缓冲液：

-磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：称取8.0gNaCl、1.2gNa2HPO4·12H2O和1.4gKH2PO4，溶解于1L蒸馏水中，用HCl或NaOH调节pH至7.4±0.1，灭菌后4℃保存备用。

-Tris缓冲液（pH7.5-8.0）：称取12.1gTris，溶解于1L蒸馏水中，用HCl调节pH，灭菌后室温保存。

(2)蛋白浓度测定试剂盒（例如Bradford法）：

-配制工作液：按说明书比例稀释浓缩液，避光保存于4℃。

-标准曲线绘制：使用已知浓度的BSA标准品（如1mg/mL），设置一系列稀释梯度（如0,20,40,60,80,100µL），加入Bradford试剂，37℃避光反应15-30分钟，酶标仪测定595nm吸光度值，绘制标准曲线。

(3)抗体工作液：

-直接免疫荧光（IF）：根据抗体说明书，用封闭液或PBS将抗体稀释至工作浓度（常用1:50-1:500），4℃封闭过夜或室温孵育1小时。

-流式细胞术（FCM）抗体：按推荐浓度用细胞培养基或FACS缓冲液稀释，避免使用含Ca2+/Mg2+的缓冲液。

2.耗材准备：

(1)一次性吸头：根据操作体积选择合适规格（如200µL,1000µL），使用前确认无破损。

(2)离心管：根据样本量选择管径（如0.5mL,1.5mL,2mL），确保管盖密封性，使用前检查是否有裂痕。

(3)微量移液器枪头：根据移液体积选择规格（如10-100µL,200-1000µL），确保无漏气。

(4)垂直电泳槽、转膜装置：检查槽体密封性，硅胶垫如有老化需更换。

(5)酶标板、细胞培养皿：使用前用70%乙醇润洗，紫外灯照射消毒30分钟，干燥备用。

（二）仪器校准

1.微量移液器：

-使用标准溶液（如蒸馏水或特定校准液）进行校准。

-校准量程误差应≤±2%，重复性测试（连续操作10次同一体积）CV≤5%。

-每次实验前检查吸头是否配套，操作后及时清洁。

2.酶标仪：

-使用校准品（如酶标仪自带的或已知吸光度的标准品）校准吸光度值。

-校准后，设置测定波长（如ELISA为450nm，WesternBlot为280nm/595nm）和参考波长（如600nm）。

-检查空白调零功能是否正常，偏差应≤±1%。

3.超净工作台/生物安全柜：

-每日实验前使用70%乙醇彻底擦拭台面及前窗。

-检查紫外线灯功能，定期（如每周）使用生物指示剂监测灭菌效果。

-操作时保持内循环风门关闭，避免气流干扰。

三、核心实验技术

（一）ELISA实验

1.试剂准备：

(1)包被抗体：

-将稀释好的抗体（如1:1000用5%脱脂奶粉封闭的PBS）加入酶标板孔中，每孔100µL。

-4℃冰箱过夜包被（或37℃封闭1小时，需同时设置37℃封闭的阴性对照）。

-用洗涤缓冲液（如PBS+0.05%Tween-20）洗涤3次，每次5分钟，拍干。

(2)封闭液：

-使用5%脱脂奶粉或封闭抗体，用封闭缓冲液（如含0.05%Tween-20的PBS）稀释至工作浓度。

-37℃封闭2小时，或4℃过夜。

-同样洗涤3次。

(3)生物素化二抗：

-根据抗体说明书稀释，用封闭缓冲液或ELISA缓冲液（如含0.05%Tween-20的Tris-HCl）调整工作浓度（如1:5000）。

-37℃孵育1小时，或4℃过夜。

-洗涤3次。

(4)SABC或辣根过氧化物酶（HRP）标记的streptavidin：

-按说明书稀释，37℃孵育30分钟。

-洗涤3次。

(5)底物显色：

-使用TMB/H2O2体系，加入底物工作液（按说明书用无过氧化物水的缓冲液稀释），避光反应30分钟。

-可用DAPI或H2O2终止反应（注意观察颜色变化）。

2.操作步骤：

(1)加样顺序：

-标准品（2-3个浓度梯度）→阴性对照（无靶标样本）→阳性对照（已知阳性样本）→实验样品。

-每孔加样100µL，避免气泡。

(2)波长设置：

-ELISA：设置主波长450nm，参考波长600nm。酶标仪预热30分钟。

-WesternBlot：设置主波长595nm（TMB）或OD280nm（HRP）。

(3)数据读取：

-记录各孔吸光度值，避免读数超范围。

-计算平均值，扣除空白孔（空白对照孔加所有试剂，不加样本/标准品）的吸光度值。

3.数据分析：

(1)标准曲线绘制：以标准品浓度对数为横坐标，对应吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线（常用四参数Logistic回归）。

(2)样本浓度计算：根据样本吸光度值在标准曲线上查出浓度，或使用软件自动计算。

(3)IC50/EC50计算（如适用）：通过GraphPad等软件绘制抑制曲线，计算半数抑制浓度。

（二）WesternBlot实验

1.蛋白制备：

(1)细胞裂解：

-收集细胞（如1×10^6个），用预冷的裂解缓冲液（如RIPA缓冲液，含PMSF、蛋白酶抑制剂）重悬。

-冰上孵育30分钟，用细胞刮刀刮下细胞，收集裂解液。

-4℃，12000rpm离心15分钟，取上清。

(2)蛋白浓度测定：

-使用BCA或Bradford法测定裂解液蛋白浓度，用裂解缓冲液或上样缓冲液（含β-巯基乙醇）稀释至合适浓度（如20-50µg/mL）。

2.电泳与转膜：

(1)SDS分离：

-配制凝胶：称取丙烯酰胺（如29:1或37.5:1丙烯酰胺/亚甲基双丙烯酰胺）、分离胶和浓缩胶缓冲液，按说明书步骤制备。

-调节pH值（分离胶通常8.5-9.0），加入TEMED和氨基硫酸铵，混匀，立即灌胶。

-安装梳子，待凝胶凝固（约30分钟）。

-上样：每孔上样20µL蛋白样品（含上样缓冲液），加标准蛋白Marker作为分子量参考。

-电泳：预电泳（如浓缩胶10V/cm，5分钟），然后按电压/时间分离（如100V，1-2小时）。

(2)转膜：

-准备转膜装置：铺好PVDF膜（用甲醇激活20分钟，再用PBS润洗3次），放置滤纸（浸湿PBS），然后是凝胶，再依次放置滤纸和PVDF膜。

-转膜条件：使用半干或全干转膜系统，设置电压（如恒压100V）和时间（如1-2小时，根据蛋白大小调整）。

-转膜后用封闭液（如5%脱脂奶粉/PBS）封闭1小时，或4℃过夜。

3.抗体孵育：

(1)一抗孵育：

-将稀释好的抗体（如1:1000用封闭液稀释）加入孵育盒，4℃孵育过夜（或37℃孵育1小时，需同时设置37℃孵育的阴性对照）。

(2)二抗孵育：

-用洗涤缓冲液（如TBST，含0.05%Tween-20）洗涤3次，每次10分钟。

-加入稀释好的二抗（如1:5000用封闭液稀释），37℃孵育1小时。

-洗涤同上。

4.底物显色与成像：

(1)ECL化学发光：

-用洗涤缓冲液洗涤3次。

-加入ECL底物液，避光反应1-5分钟。

-使用化学发光成像系统（如ChemiDoc）采集图像，曝光时间根据信号强度调整。

(2)免疫荧光（IF）成像（若在WB后进行）：

-用PBS洗涤3次。

-加入荧光二抗（如AlexaFluor488/594，1:1000稀释），37℃孵育1小时。

-洗涤后，封片（如使用抗荧光淬灭封片剂）。

-使用荧光显微镜采集图像。

5.定量分析：

(1)使用ImageJ等软件进行条带灰度值分析。

(2)校正内参（如GAPDH、β-actin），计算目标蛋白相对表达量。

（三）流式细胞术实验（FCM）

1.细胞准备：

(1)细胞收集：用胰蛋白酶（含EDTA）消化细胞，离心收集，用FACS缓冲液（如PBS+0.5%FBS）重悬。

(2)细胞计数与稀释：使用细胞计数板或细胞计数仪计数，调整细胞浓度至1×10^6/mL。

2.细胞染色：

(1)阻断非特异性结合：加入固定液（如4%多聚甲醛）或冷甲醇，室温孵育20分钟。

(2)清洗：用FACS缓冲液洗涤1次。

(3)染色：

-若检测细胞表面标志物：加入预混荧光抗体（如CD3-PE/CD4-FITC），37℃避光孵育30分钟。

-若检测细胞内标志物：需加入穿孔剂/透化剂（如Cytofix/Cytoperm），孵育后清洗，再加入荧光抗体，避光孵育30分钟。

(4)清洗：用FACS缓冲液洗涤1-2次。

3.数据采集：

(1)设定门控：根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）参数，选择目标细胞群体（如淋巴细胞）。

(2)参数设置：选择合适的荧光通道（如PE通道设为585/40，FITC通道设为488/20），调整电压和补偿。

(3)采集：设置采集细胞数（如1×10^5-1×10^6），开始采集数据。

4.数据分析：

(1)使用FlowJo等软件进行数据整理和门控。

(2)分析指标：如细胞凋亡率（AnnexinV-FITC/PI双染）、细胞亚群比例（如CD4+/CD8+比例）、细胞增殖（如Ki67表达）。

(3)绘制图表：如直方图、散点图、饼图等，展示分析结果。

四、质量控制

（一）阳性对照设置

1.必须包含阳性对照：

(1)ELISA：使用已知浓度的标准品或阳性样品作为对照，验证检测系统灵敏度。

(2)WesternBlot：使用已知表达蛋白的样品或标准品，确认抗体有效性和蛋白条带清晰。

(3)FCM：使用已知阳性细胞（如表达特定抗体的细胞系）或标准品，确认染色和仪器功能正常。

2.阴性对照设置：

(1)ELISA：不加靶标或用靶标抗体与无关蛋白孵育，排除非特异性结合。

(2)WesternBlot：使用未处理或非目标蛋白样品，确认背景干净。

(3)FCM：使用未染色或只染二抗的细胞，排除非特异性荧光。

（二）重复性验证

1.关键实验需重复：

(1)同一实验至少进行3次独立重复，计算变异系数（CV）。

(2)CV应≤10%（对于定量实验），若超过需查找原因并重做。

2.数据一致性检查：

(1)比较不同批次标准品曲线的斜率和截距，确保一致性。

(2)FCM数据中，阳性对照和阴性对照的统计数据（如中位数荧光强度MFI）应符合预期。

（三）污染防控

1.试剂交叉污染：

(1)不同实验的抗体、底物等试剂需分开放置，标签清晰。

(2)微量移液器吸头严禁混用。

2.细胞交叉污染：

(1)不同细胞系或样本需使用不同处理皿或离心管。

(2)操作时保持生物安全柜内空气流动方向正确。

3.菌落污染：

(1)细胞培养需在超净台内操作。

(2)定期更换培养箱内的滤网和空气。

4.光学干扰：

(1)荧光实验中，避免光源直接照射非目标区域。

(2)使用合适的滤光片。

五、实验记录与废弃物处理

（一）记录要点

1.实验记录本或电子记录系统需包含以下信息：

(1)实验日期、时间、操作人。

(2)实验名称、目的、原理。

(3)试剂名称、批号、配制日期、浓度。

(4)仪器型号、校准日期。

(5)关键操作参数（如孵育温度/时间、电泳电压/时间、抗体稀释倍数）。

(6)阳性对照和阴性对照结果。

(7)实验现象、问题及解决方案。

(8)原始数据摘要（如吸光度值列表、图像文件名）。

2.数据保存：

(1)原始数据（如酶标板读数、电泳凝胶照片、FCM数据文件）需归档保存至少2年。

(2)分析结果应与原始数据关联，方便追溯。

（二）废弃物分类

1.化学试剂：

(1)强酸、强碱、有机溶剂（如乙醇、丙酮）需按危险品规定处理。

(2)含有放射性同位素的废弃物需特殊处理。

2.细胞培养物：

(1)使用过的细胞培养基、细胞裂解液等需先高压灭菌（121℃，15分钟）。

(2)消毒后，根据实验室规定排放至下水道或集中处理。

3.耗材：

(1)一次性吸头、离心管、培养皿等需分类收集，作为医疗废弃物处理。

(2)玻璃器皿需清洗后高压灭菌再回收。

4.废弃物标识：

(1)所有废弃物容器需明确标识其内容物和危险性质。

(2)严格按照实验室废弃物处理流程进行操作。

六、注意事项

1.个人防护：

(1)操作前需穿戴实验服、手套，必要时佩戴护目镜或面屏。

(2)涉及有毒试剂（如甲醛、PMSF）时，需佩戴防毒面具。

2.试剂操作：

(1)强酸、强碱、易燃易爆试剂需在指定区域操作。

(2)荧光抗体需避光保存和使用。

3.高温操作：

(1)使用电泳仪、烘箱等设备时，需注意防止烫伤。

(2)加热样品前需检查容器是否密封完好。

4.仪器使用：

(1)操作大型仪器（如酶标仪、流式细胞仪）前需接受专业培训。

(2)定期检查设备功能，发现异常及时报修。

5.实验室环境：

(1)保持实验台面清洁干燥，试剂瓶标签清晰。

(2)定期清洁超净工作台和生物安全柜的滤网。

本规程为通用操作指南，具体实验可能需要根据实验目的和所用试剂/仪器进行适当调整。操作人员应熟悉相关试剂和仪器的安全说明，并遵守实验室的通用安全规则。

一、概述

免疫学实验是研究机体免疫系统结构与功能的重要手段，广泛应用于医学、生物学等领域。为确保实验结果的准确性和可重复性，必须严格遵循标准化的操作规程。本规程涵盖了免疫学实验的基本原则、常用技术及质量控制要点，旨在为实验操作提供系统指导。

二、实验准备

（一）试剂与耗材

1.试剂配制：

(1)标准缓冲液：如磷酸盐缓冲液（PBS），pH值调至7.4±0.1。

(2)蛋白浓度测定试剂盒：使用Bradford法或BCA法，确保样品浓度在0.1-1.0mg/mL范围内。

(3)抗体工作液：稀释浓度根据说明书调整，常用范围1:100-1:1000。

2.耗材准备：

(1)一次性吸头、离心管、微量移液器枪头。

(2)垂直电泳槽、酶标板、细胞培养皿。

（二）仪器校准

1.微量移液器：校准量程误差≤±2%。

2.酶标仪：使用标准品校准吸光度值，偏差≤±1%。

三、核心实验技术

（一）ELISA实验

1.试剂准备：

(1)包被抗体：4℃过夜包被，封闭液（如封闭抗体）37℃封闭2小时。

(2)底物显色：TMB/H2O2体系，避光反应30分钟。

2.操作步骤：

(1)加样顺序：依次加入标准品、样品、酶标抗体。

(2)波长设置：450nm读数，参考波长调至600nm。

（二）WesternBlot实验

1.蛋白制备：

(1)细胞裂解：加入RIPA裂解液，冰上孵育30分钟。

(2)离心取上清，BCA法测定浓度。

2.电泳与转膜：

(1)SDS分离，电压设定100V，电泳2-3小时。

(2)PVDF膜转膜，湿转条件60V，2小时。

（三）流式细胞术实验

1.细胞染色：

(1)使用预混荧光抗体，避光孵育30分钟。

(2)PBS洗涤2次，避免固定剂干扰。

2.数据采集：

(1)设定门控区域，分析细胞凋亡率等指标。

(2)每样本计数≥10,000个细胞。

四、质量控制

（一）阳性对照设置

1.每组实验必须包含已知阳性对照，如ELISA的标准品曲线。

2.WesternBlot需使用内参蛋白（如β-actin）校准。

（二）重复性验证

1.关键实验需进行至少3次重复，计算变异系数（CV）≤10%。

2.流式细胞术数据需通过FSC/SSC双参数散点图剔除异常值。

（三）污染防控

1.使用无菌吸头避免交叉污染。

2.荧光实验需设置同型对照，排除非特异性结合。

五、实验记录与废弃物处理

（一）记录要点

1.记录试剂批号、操作人、环境温湿度。

2.保存原始数据，如酶标板吸光度值列表。

（二）废弃物分类

1.化学试剂需按危险品规定处理。

2.细胞培养物需高压灭菌后排放。

六、注意事项

1.操作前需用70%酒精手部消毒。

2.荧光实验需使用暗视野显微镜。

3.高温操作需佩戴隔热手套。

本规程适用于常规免疫学实验室操作，具体实验可根据实验目的调整参数。

**一、概述**

免疫学实验是研究机体免疫系统结构与功能的重要手段，广泛应用于医学、生物学等领域。为确保实验结果的准确性和可重复性，必须严格遵循标准化的操作规程。本规程涵盖了免疫学实验的基本原则、常用技术及质量控制要点，旨在为实验操作提供系统指导。它不仅有助于减少实验误差，提高数据可靠性，还能确保实验操作人员的安全。本规程适用于细胞培养、分子检测、蛋白质分析、免疫细胞功能测定等常规免疫学实验室工作。

二、实验准备

（一）试剂与耗材

1.试剂配制：

(1)标准缓冲液：

-磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：称取8.0gNaCl、1.2gNa2HPO4·12H2O和1.4gKH2PO4，溶解于1L蒸馏水中，用HCl或NaOH调节pH至7.4±0.1，灭菌后4℃保存备用。

-Tris缓冲液（pH7.5-8.0）：称取12.1gTris，溶解于1L蒸馏水中，用HCl调节pH，灭菌后室温保存。

(2)蛋白浓度测定试剂盒（例如Bradford法）：

-配制工作液：按说明书比例稀释浓缩液，避光保存于4℃。

-标准曲线绘制：使用已知浓度的BSA标准品（如1mg/mL），设置一系列稀释梯度（如0,20,40,60,80,100µL），加入Bradford试剂，37℃避光反应15-30分钟，酶标仪测定595nm吸光度值，绘制标准曲线。

(3)抗体工作液：

-直接免疫荧光（IF）：根据抗体说明书，用封闭液或PBS将抗体稀释至工作浓度（常用1:50-1:500），4℃封闭过夜或室温孵育1小时。

-流式细胞术（FCM）抗体：按推荐浓度用细胞培养基或FACS缓冲液稀释，避免使用含Ca2+/Mg2+的缓冲液。

2.耗材准备：

(1)一次性吸头：根据操作体积选择合适规格（如200µL,1000µL），使用前确认无破损。

(2)离心管：根据样本量选择管径（如0.5mL,1.5mL,2mL），确保管盖密封性，使用前检查是否有裂痕。

(3)微量移液器枪头：根据移液体积选择规格（如10-100µL,200-1000µL），确保无漏气。

(4)垂直电泳槽、转膜装置：检查槽体密封性，硅胶垫如有老化需更换。

(5)酶标板、细胞培养皿：使用前用70%乙醇润洗，紫外灯照射消毒30分钟，干燥备用。

（二）仪器校准

1.微量移液器：

-使用标准溶液（如蒸馏水或特定校准液）进行校准。

-校准量程误差应≤±2%，重复性测试（连续操作10次同一体积）CV≤5%。

-每次实验前检查吸头是否配套，操作后及时清洁。

2.酶标仪：

-使用校准品（如酶标仪自带的或已知吸光度的标准品）校准吸光度值。

-校准后，设置测定波长（如ELISA为450nm，WesternBlot为280nm/595nm）和参考波长（如600nm）。

-检查空白调零功能是否正常，偏差应≤±1%。

3.超净工作台/生物安全柜：

-每日实验前使用70%乙醇彻底擦拭台面及前窗。

-检查紫外线灯功能，定期（如每周）使用生物指示剂监测灭菌效果。

-操作时保持内循环风门关闭，避免气流干扰。

三、核心实验技术

（一）ELISA实验

1.试剂准备：

(1)包被抗体：

-将稀释好的抗体（如1:1000用5%脱脂奶粉封闭的PBS）加入酶标板孔中，每孔100µL。

-4℃冰箱过夜包被（或37℃封闭1小时，需同时设置37℃封闭的阴性对照）。

-用洗涤缓冲液（如PBS+0.05%Tween-20）洗涤3次，每次5分钟，拍干。

(2)封闭液：

-使用5%脱脂奶粉或封闭抗体，用封闭缓冲液（如含0.05%Tween-20的PBS）稀释至工作浓度。

-37℃封闭2小时，或4℃过夜。

-同样洗涤3次。

(3)生物素化二抗：

-根据抗体说明书稀释，用封闭缓冲液或ELISA缓冲液（如含0.05%Tween-20的Tris-HCl）调整工作浓度（如1:5000）。

-37℃孵育1小时，或4℃过夜。

-洗涤3次。

(4)SABC或辣根过氧化物酶（HRP）标记的streptavidin：

-按说明书稀释，37℃孵育30分钟。

-洗涤3次。

(5)底物显色：

-使用TMB/H2O2体系，加入底物工作液（按说明书用无过氧化物水的缓冲液稀释），避光反应30分钟。

-可用DAPI或H2O2终止反应（注意观察颜色变化）。

2.操作步骤：

(1)加样顺序：

-标准品（2-3个浓度梯度）→阴性对照（无靶标样本）→阳性对照（已知阳性样本）→实验样品。

-每孔加样100µL，避免气泡。

(2)波长设置：

-ELISA：设置主波长450nm，参考波长600nm。酶标仪预热30分钟。

-WesternBlot：设置主波长595nm（TMB）或OD280nm（HRP）。

(3)数据读取：

-记录各孔吸光度值，避免读数超范围。

-计算平均值，扣除空白孔（空白对照孔加所有试剂，不加样本/标准品）的吸光度值。

3.数据分析：

(1)标准曲线绘制：以标准品浓度对数为横坐标，对应吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线（常用四参数Logistic回归）。

(2)样本浓度计算：根据样本吸光度值在标准曲线上查出浓度，或使用软件自动计算。

(3)IC50/EC50计算（如适用）：通过GraphPad等软件绘制抑制曲线，计算半数抑制浓度。

（二）WesternBlot实验

1.蛋白制备：

(1)细胞裂解：

-收集细胞（如1×10^6个），用预冷的裂解缓冲液（如RIPA缓冲液，含PMSF、蛋白酶抑制剂）重悬。

-冰上孵育30分钟，用细胞刮刀刮下细胞，收集裂解液。

-4℃，12000rpm离心15分钟，取上清。

(2)蛋白浓度测定：

-使用BCA或Bradford法测定裂解液蛋白浓度，用裂解缓冲液或上样缓冲液（含β-巯基乙醇）稀释至合适浓度（如20-50µg/mL）。

2.电泳与转膜：

(1)SDS分离：

-配制凝胶：称取丙烯酰胺（如29:1或37.5:1丙烯酰胺/亚甲基双丙烯酰胺）、分离胶和浓缩胶缓冲液，按说明书步骤制备。

-调节pH值（分离胶通常8.5-9.0），加入TEMED和氨基硫酸铵，混匀，立即灌胶。

-安装梳子，待凝胶凝固（约30分钟）。

-上样：每孔上样20µL蛋白样品（含上样缓冲液），加标准蛋白Marker作为分子量参考。

-电泳：预电泳（如浓缩胶10V/cm，5分钟），然后按电压/时间分离（如100V，1-2小时）。

(2)转膜：

-准备转膜装置：铺好PVDF膜（用甲醇激活20分钟，再用PBS润洗3次），放置滤纸（浸湿PBS），然后是凝胶，再依次放置滤纸和PVDF膜。

-转膜条件：使用半干或全干转膜系统，设置电压（如恒压100V）和时间（如1-2小时，根据蛋白大小调整）。

-转膜后用封闭液（如5%脱脂奶粉/PBS）封闭1小时，或4℃过夜。

3.抗体孵育：

(1)一抗孵育：

-将稀释好的抗体（如1:1000用封闭液稀释）加入孵育盒，4℃孵育过夜（或37℃孵育1小时，需同时设置37℃孵育的阴性对照）。

(2)二抗孵育：

-用洗涤缓冲液（如TBST，含0.05%Tween-20）洗涤3次，每次10分钟。

-加入稀释好的二抗（如1:5000用封闭液稀释），37℃孵育1小时。

-洗涤同上。

4.底物显色与成像：

(1)ECL化学发光：

-用洗涤缓冲液洗涤3次。

-加入ECL底物液，避光反应1-5分钟。

-使用化学发光成像系统（如ChemiDoc）采集图像，曝光时间根据信号强度调整。

(2)免疫荧光（IF）成像（若在WB后进行）：

-用PBS洗涤3次。

-加入荧光二抗（如AlexaFluor488/594，1:1000稀释），37℃孵育1小时。

-洗涤后，封片（如使用抗荧光淬灭封片剂）。

-使用荧光显微镜采集图像。

5.定量分析：

(1)使用ImageJ等软件进行条带灰度值分析。

(2)校正内参（如GAPDH、β-actin），计算目标蛋白相对表达量。

（三）流式细胞术实验（FCM）

1.细胞准备：

(1)细胞收集：用胰蛋白酶（含EDTA）消化细胞，离心收集，用FACS缓冲液（如PBS+0.5%FBS）重悬。

(2)细胞计数与稀释：使用细胞计数板或细胞计数仪计数，调整细胞浓度至1×10^6/mL。

2.细胞染色：

(1)阻断非特异性结合：加入固定液（如4%多聚甲醛）或冷甲醇，室温孵育20分钟。

(2)清洗：用FACS缓冲液洗涤1次。

(3)染色：

-若检测细胞表面标志物：加入预混荧光抗体（如CD3-PE/CD4-FITC），37℃避光孵育30分钟。

-若检测细胞内标志物：需加入穿孔剂/透化剂（如Cytofix/Cytoperm），孵育后清洗，再加入荧光抗体，避光孵育30分钟。

(4)清洗：用FACS缓冲液洗涤1-2次。

3.数据采集：

(1)设定门控：根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）参数，选择目标细胞群体（如淋巴细胞）。

(2)参数设置：选择合适的荧光通道（如PE通道设为585/40，FITC通道设为488/20），调整电压和补偿。

(3)采集：设置采集细胞数（如1×10^5-1×10^6），开始采集数据。

4.数据分析：

(1)使用FlowJo等软件进行数据整理和门控。

(2)分析指标：如细胞凋亡率（AnnexinV-FITC/PI双染）、细胞亚群比例（如CD4+/CD8+比例）、细胞增殖（如Ki67表达）。

(3)绘制图表：如直方图、散点图、饼图等，展示分析结果。

四、质量控制

（一）阳性对照设置

1.必须包含阳性对照：

(1)ELISA：使用已知浓度的标准品或阳性样品作为对照，验证检测系统灵敏度。

(2)WesternBlot：使用已知表达蛋白的样品或标准品，确认抗体有效性和蛋白条带清晰。

(3)FCM：使用已知阳性细胞（如表达特定抗体的细胞系）或标准品，确认染色和仪器功能正常。

2.阴性对照设置：

(1)ELISA：不加靶标或用靶标抗体与无关蛋白孵育，排除非特异性结合。

(2)WesternBlot：使用未处理或非目标蛋白样品，确