基因工程的基本操作程序-高二生物寒假讲义+练习（选择性必修3）教师卷

第08讲基因工程的基本操作程序

【学习目标】

【基础知识】

一、目的基因的筛选和获取

1.筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一，如Bt

基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。

2.利用PCR获取和扩增目的基因

（1）获取目的基因的方法a.平合成（基因碱基序列是已知的）

b.PCRb.PCR技术扩增（已知基中两侧的碱基序列）

c.从基因文库中获取（原核生物）

（2）PCR技术

PCR的含义：是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理在体外提供参与DNA复制

的各种组分与反应条件，对目的基因的核甘酸序列进行大量复制的技术。

基本条件率所：需要在一定的缓冲溶液中进行，其中一般要添加Mg2+

一模板：已知两侧碱基序列的DNA母链

原料：4种脱氧核甘酸

耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）

引物：是2种与DNA母链的•段碱基序列互补配对的短单链核酸

反应过程变性：加热超过90℃,双链DNA解旋为单链

复性：温度下降至50℃左右，两种引物与互补单链DNA结合

延伸：温度上升到72℃左右，四种脱氧核甘酸在耐高温的DNA聚合酶作用下合成子链DNA

结果：两引物间固定长度的DNA序列呈指数扩增（即2D

鉴定PCR产物：用琼脂糖凝胶电泳来鉴定

注：1.含脱氧核甘酸链等长的DNA分子数为2n2n

2.第三轮出现两条链等长的DNA片段

3.两种引物之间需要满足的是：不能碱基互补配对，是防止引物之间结合形成双链，降低引物与DNA

模板链结合的效率。

归纳总结

1、苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（BI抗虫蛋白）为什么对人畜无害的原因：

B（抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞

也没有特异性受体，不能穿透细胞膜杀死细胞。

2、基因文库的概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌

分别含有这种生物的不同基因，成为基因文库。

3、cDNA概念：以mRNA为模板进行逆转录形成的DNA

6、cDNA文库和基因组文库的比较：

文库类型cDNA文库基因组文库

文库大小小大

基因中启动子无有

基因中内含子无有

基因多少某种基因的部分基因某种生物的全部基因

7、获取目的基因的三种方法：①人工合成获取；②从基因文库获取；③通过PCR技术获取

8、PCR技术：聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制

的各种组分和反应条件，对目的基因的核甘酸进行大量复制的技术。

9、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。①体内复制的引物为RNA单链;

②体外复制的引物一般为DNA单链

10、PCR反应的条件：需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供模板、引物、脱氧核甘酸、耐高温的DNA聚

合醒（Taq酶）；同时需要控制温度

11、运用PCR技术时，缓冲液中需要加入一定的理心，激活DNA聚合酶

10、DNA体内复制的条件:

11、DNA体外复制（PCR）的条件

12、PCR扩增的过程:

名称具体内容

变性目的基因DNA受热变性后形成单链

复性（退火）引物与单链相应互补序列结合

以单链DNA为模板，在DNA聚合酶将溶液中四种脱氧核甘酸根据碱基互补配对

延伸

原则合成新的子链

13、PCR扩增的结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，计算公式：2：,其中n为扩增循环的次数

14、扩增循环n次所需要的引物：计算公式：”2,至少需要经过3次扩增以后才能得到目的基因，且扩

增第3次后能得到2个目的基因

15、PCR产物鉴定方法：采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物

二、基因表达载体的构建

1.构建基因表达载体的目的a.让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代

b.使目的基因能够表达和发挥作用

2.基因表达载体的构成：目的基因+标记基因+启动子+终止子

启动子：位于DNA上.在基因的上游，是RNA聚合陋识别和结合的部位，

躯动基因转录出mRNA,有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动

子，当诱导物存在时:可以激活或抑制目的基因的表达。

终止子：也位于DNA上在基因的下游，终止转录

起始密码子和终止密码子：位于inRNAI'.,决定翻译的开始和结束

3.基因表达载体的构建过程（P80图36）

（1）首先用一定的限制酶切割载体

（2）然后用同种限制前或能产生相同末端的限制陋

切割含目的基因的DNA片段

（3）再利用DNA连接酶将含FK勺基因的DNA片段

拼接到载体的切口处

花粉管通道法（我国独创）如抗虫棉

导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术受体细胞多是受精卵

导入微生物细胞：常以大肠杆菌作为受体细胞

一般先用Ca"处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（即感受态），

然后再将重组的基因表达载体导入其中。

3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达

农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后能将Ti质粒上的TDNA（可转移的DNA）

转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。

归纳总结

1.转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.将目的基因导入受体细胞的方法:

生物类型方法受体细胞过程特点

植物受粉一段时间后剪去

柱头t滴加DNA溶液（含目

花粉管通道我国独创的一

转基因植物受精卵的基因）一目的基因借助花

法种方法

粉管通道进入受体细胞（胚

囊）T目的基因表达

将目的基因插入到农杆菌Ti

质粒的T-DNA片段上一

适用于双子叶

农杆菌转化体细胞或转入农杆菌-用农杆菌侵

转基因植物植物和裸子植

法受精卵染植物细胞一目的基因整

物

合到植物细胞染色体DNA

上一目的基因表达

提纯含目的基因的表达载

目的基因导入

体T取卵（受精卵）T显微注

转基因动物显微注射法受精卵动物细胞最有

射一胚胎早期发育，移植T

效的方法

获得具有新性状的动物

用Ca2+处理微生物细胞一

处于能吸收DNA分子的状

Ca2+处理微生物态（即感受态细胞）->基因表简便、经济、有

转基因微生物

法细胞达载体与感受态细胞混合效

T在一定温度下促进感受

态细胞吸收DNA分子

四、目的基因的表达与检测

1.分子水平的检测1）］通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因

2）利用PCR技术检测目的基因是否转录出了mRNA

3）用相应抗体进行抗原一抗体杂交检测目的基因是否翻译成蛋白质等

2.个体生物学水平的鉴定：抗虫.抗病接种试验等

总结基因工程的基本操作流程（P82图37）

归纳总结

类型检测内容方法结果显示

目的基因是否插入受体细胞

PCR技术

DNA±是否扩增出目的

分子水平基因

目的基因是否转录出mRNAPCR技术

的检测

抗原一抗体杂交（蛋白质是否显示出杂交

目的基因是否制译成蛋白质

*H-

和蛋白质之间）市

个体生物学水对转基因生物进行抗性是否赋予了预期

是否具有抗性及抗性程度

平的检测接种实验抗性

五、DNA片段的扩增及电泳鉴定

实验原理：

1.DNA片段的扩增：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解旋与结合。

2.琼脂糖凝胶电泳P54

（1）带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基因可以带上正电荷或负电荷。

（2）电泳：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。

（3）迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度.DNA分子的大小和构象有关。

（4）检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来

3.操作提示P85注意

（1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR试验中使用的微量离心管.枪头和蒸镭水等在使用前必须进行高

压灭菌处理。

（2）缓冲液和酶应分装成小份，并在20C储存。使用前所需试剂从冰箱拿出放在冰块上缓慢融化。

（3）添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。

（4）在进行操作时，一定要戴好一次性手套。

4.结果分析与评价

（1）未出现扩增条带的原因

a.TaqDNA聚合酶失活b.引物出现质量问题c.Mg2+浓度过低d.变性时的温度低，变性时间短

（2）出现非特异性扩增条带的主要原因

&模板DNA出现污染b.引物特异性不强（过短）或形成引物二聚体c.Mg2+浓度过高

d.复性时的温度过高

附图：

GATCCTT……目的・CC

-GAA……甚因…GgCTAG

GATCATCG-••,AATTG

_______

TAGC--TTAACCTAG

-AATTdtJATCCTT||ft«J-CCGATCATCG-

-TTAACCTAGGAA……CC…GGCTA6TAGC-

•AATTGOV±399-ftm•…VV9GATCATCG-

a.f--------「

•TTAACCTAGbO…阴U••…1LDDlVEyAGC…Q

【考点剖析】

考点一：目的基因的筛选与获取

1.2020年3月16日，中国科学家陈薇院上团队研制的重组新冠疫苗通过临床研究注册审评，获

批进入临床试验。重组新冠疫苗的制备流程如图。回答下列问题。

(1)步骤②需要作为原料。步骤③需要的工具陋主要是。

⑵被用作载体的Ad5应具有的特点是(答出1点即可)。

(3)步骤④是。

(4)重组疫苗注入志愿者体内后，S蛋白基因指导合成的S蛋白作为,刺激机体产生能与之相结合

的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临床试验的志愿者需要满足的条件

之一是(填“有''或"无")SARS-CoV-2感染史，理由

是。

（5）为探究疫苗的注射剂量对志愿者产生的免疫效果，需进一步试验，请写出试验思路:

【答案】（1）脱氧核甘酸Taq^（2）能自我复制（或有一个或多个限制前切割位点、有标记基因位点、对

受体细胞无害）（3）基因表达载体的构建（4）抗原无有SARS-CoV-2感染史的志愿者血清中存在一

定量的相应抗体，会对试验结果产生干扰（5）给不同组志愿者分别注射不同剂量的疫苗，一段时间后采集

血样并检测相应抗体的水平

【解析】（1）步骤②为逆转录过程，合成的产物是cDNA,因此需要脱氧核昔酸作为原料。步骤③为利用PCR

技术扩增获得S蛋白基因的过程，该过程需要的酶是，可酶（耐高温的DNA聚合酶）。（2）Ad5作为载体应具

有的特点是能自我复制、有多个限制能切割位点、有标记基因、在宿主细胞中可以存活并表达、对宿主细

胞无害等。（3）步骤④为构建目的基因表达载体的过程，即重组新冠疫苗的过程。（4）重组疫苗注入志愿者体

内后，S蛋白基因指导合成的S蛋白可作为抗原，刺激机体产生特异性免疫过程，使机体免疫系统产生能与

之相结合的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临床试验的志愿者需要满

足无SARS—CoV—2感染史的条件，即未感染过新冠病毒的志愿者，因为感染过新冠病毒的人体内含有相

应的记忆细胞，若注射疫苗，则会出现二次免疫的特征，即体内的记忆细胞会迅速增殖分化，产生大量的

浆细胞，浆细胞合成并分泌大量的抗体，从而导致无法检测出该疫苗的真正效果。（5）实验目的为探究疫苗

的注射剂最对志愿者产生的免疫效果，根据实验目的可知，该实验的自变量为疫苗的注射剂置，因变最为

抗体产生量，因此设计实验如下：将同性别且年龄相当的志愿者随机分成若干组，然后给不同组别的忐愿

者注射不同剂量的疫苗，一段时间之后，检测志愿者体内的抗体产生量，作好记录并进行比较、分析，从

而得出结论。

考点二：表达载体的构建

2.大肠杆菌p-半乳糖行酶（Z酶）可催化底物（X-gal）水解产生蓝色物质。在pUC18质粒中，以2编

码Z酶氨基端的一个片段（称为a-肽），该质粒结构及限制酶识别位点如图甲所示。已知a-肽、缺失a-肽的Z

酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存在时就会表现出Z酶活性。利用图乙中的DNA片段与pUC18质

粒进行基因工程操作。

⑴限制海能催化双链DNA分子中（填化学键名称）的断裂。本实验可使用限制酶处理

PUCI8质粒和图乙中的DNA片段，再通过DNA连接能连接，获得含目的基因的重组质粒。

（2）用重组质粒转化大肠杆菌，然后将大肠杆菌接种到含氨节青霉素的固体培养基上进行培养，由于未发生

转化的大肠杆菌没有该质粒，因而不具有，在该培养基上不能生长。从功能上划分，该培养基属

于培养基。

(3)当上述培养基中含有X-gal时，生长出的菌落有蓝色和白色两种类型，其中含有重组质粒的大肠杆菌的

菌落颜色为，这是因为___________________________________

为保证能通过菌落颜色辨别出含有重组质粒的大肠杆菌，本实验作为受体细胞的大肠杆菌中Z梅基因应满

足的条件是o

【答案】(1)磷酸二酯键Sall

(2)氨羊青霉素抗性选择

(3)白色目的基因与质粒连接后使灰Z被破坏，不能合成a-肽编码a-肽的DNA序列缺失，其他序列正

常

【解析】(1)限制酶能催化双链DNA分子中特定部位磷酸二酯键的断裂，将DNA断开。从图中可知，酹

“泳山［可破坏目的基因，而质粒和目的基因两侧都有酶SRI识别位点，因此本实验可使用限制酶Sal1处

理pUC18质粒和图乙中的DNA片段。

(2)重组质粒上有氨茉青霉素抗性圣因，由于未发生转化的大肠杆菌没有该质粒，因而不具有氨苇青霉素抗

性，在含氨羊青霉素培养基上不能生长。从功能上划分，该培养基属于选择培养基，选择了含重组质粒的

大肠杆菌。

(3)从图中可知，重组质粒是用能SRI分别处理过的质粒和目的基因片段形成的，重组质粒的/acZ基因被

破坏，不能合成供半乳糖昔陋0髀)，不能催化底物(X-gal)水解产生蓝色物质，故呈菌落白色,已知a-肽、

缺失a-肽的Z的片段单独存在时均无Z酹活性，共同存在时就会表现出Z酶活性，为保证能通过菌落颜色

辨别出含有重组质粒的大肠杆菌，木实验作为受体细胞的大肠杆菌中Z酶基因应满足的条件是编码a-肽的

DNA序列缺失，其他序列正常。

考点三、目的基因导入受体细胞

3.乙烯具有促进果实成熟的作用，ACC氧化陋和ACC合成前是番茄细胞内合成乙烯的两个关键

酶。利用反义基因技术(原理如图1),可以抑制这两个基因的表达，从而使番茄具有耐储存、宜运输的优点。

图2为融合ACC氧化晦基因和ACC合成能基因的反义基因表达载体的结构示意图。

图1反义基因技术

图2反义基因表达载体

⑴图2中的2A11为特异性启动子，则2A11应在番茄的(填滞官名称)中表达。

(2)从番茄成熟果实中提取作为模板，利用反转录法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，对

它们进行拼接构成融合基因并扩增。

⑶合成出的ACC氧化酶基因两端分别含限制能/%〃出I和X/%I的酶切位点,ACC合成前基因两端含5ZcI

和X儿I的陋切位点，用限制陋对上述两个基因进行切割后，再将它们拼接成融合基因，相应的

Ti质粒和融合基因均使用限制酶进行切割，以确保融合基因能够插入载体中。

（4）为了实现图I中反义基因的效果，应将融合基因（填"正向”或“反向”）插入启动子2Ali的下游即

可构成反义融合基因。

（5）在检测番茄细胞中是否存在反义融合基因时，（填"能”或"不能”）用放射性物质标记的ACC氧化

（合成）酶基因片段作探针进行检测，理由

是。

【答案】⑴果实⑵RNA（3）XbaII和SacI（4）反向⑸不能番茄细胞内本来就存在ACC

氧化（合成）酶基因，能与ACC氧化（合成）酶基因探针发生分子杂交

【解析】（1）番茄食用的是果实，因此，启动子2Ali应在番茄的果实中表达。（2）从番茄成熟果实中提取RNA

作为模板，利用反转录法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因。（3）使用限制酶X乩I对合成出的ACC

氧化酶基因和ACC合成酶基因进行切割后，两种基因有相同的黏性末端，可将二者拼接形成融合基因。相

应的Ti质粒和融合基因均使用限制酶&加H【和SacI进行切割，然后再连接，可以确保融合基因能够插

入载体中。（4）为了实现图1中反义基因的效果，应将融合基因反向插入启动子2Ali的下游。（5）番茄细胞

内本来就存在ACC氧化（合成）酶基因，能与ACC氧化（合成）的基因探针发生分子杂交，因此，不能用放射

性物质标记的ACC氧化（合成）酹基因作为探针进行检测.

四、目的基因的检测与鉴定

例4.通过把编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入醉母菌细胞中，使之充分表达，再经纯化

可制得乙型肝炎疫苗。回答下列问题：

（1）人体接种乙型肝炎疫苗后，该疫苗可作为刺激机体发生特异性免疫反应。乙型肝炎疫苗先后需

要接种多次，其目的是o

（2）如果己知乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列，则可以推测出相应目的基因的核甘酸序列，但推测出的

目的基因核甘酸序列并不是唯一的，其原因是。

（3）将编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因导入酵母菌细胞之前需要构建基因表达载体，这一过程中需要的工

具酶主要有。构建的基因表达载体中，编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因应该

位于之间。

（4）将编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因导入酵母菌细胞时，使该基因在酵母菌细胞中得以稳定遗传的关键

是0

【答案】（1）抗原使人体产生更多的抗体和记忆细胞（2）决定氨基酸的密码子具有简并性（或决定一种氨

基酸的密码子往往不是只有一种）（3）限制解和DNA连接酹启动子和终止子（4）确保编码乙型肝炎病毒

表面抗原的基因插入到酵母菌细胞的染色体DNA上

【解析】（1）乙型肝炎疫苗可作为抗原引起人体产生特异性免疫反应。乙型肝炎疫苗需先后接种多次的目的

是使人体产生更多的抗体和记忆细胞，以发挥最大的免疫效果。（2）由于mRNA上的密码子具有简并性，根

据蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA的核昔酸序列不是唯一的，所以推测出的基因的核首段序列不是唯

一的。（3）在构建基因表达载体过程中，需要用限制酶切割目的基因片段与载体，再用DNA连接酶把目的基

因与载体连接起来。构建的基因表达载体中，启动子和终止子分别是基因表达中转录起始和终止的调控序

列，目的基因需要插在后动子和终止子之间。（4）真核细胞分裂时细胞质DNA随机分配，应将目的基因插入

到酵母菌细胞的染色体DNA上，以确保目的基因在酵母菌细胞中稳定遗传。

1.（2021湖北,16）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配

对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中

有效的是（）

A.增加模板DNA量B.延长热变性的时间

C.延长延伸的时间D.提高复性的温度

【答案】D

【解析】

【分析】多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，PCR过程一般经历下述三循环：

95℃下使模板DNA变性、解链t55c下兔性（引物与DNA模板链结合）-72c下引物链延伸（形成新的

脱氧核甘酸链）。

【详解】A、增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；

BC、延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有

效减少反应非特异性条带，BC错误；

D、非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的

温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。

2.（2020北京生物高考题）12.为了对重金属污染的土壤进行生物修亚，研究者将从杨树M克隆的重金属转

运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。

①③

左边界一►—►右边界

腼内源DNA杨树内源

—|—启动字—HMA3基因T终止子—|—DNA

・②■④

（注：①、②、③、④表示引物）

为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR

扩增时，应选择的引物组合是（）

A.①也B.GX2）C.③+②D.③+④

【答案】B

【解析】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检

测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和

HMA3基因序列，应选择的引物经合是①+②，即B正确，ACD错误。

3.12021湖北，16）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全

配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施

中有效的是（）

A.增加模板DNA量B.延长热变性的时间

C.延长延伸的时间D.提高复性的温度

【答案】D

【解析】增加模板DNA的量可■以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；延长热变性的时

间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性

条带，BC错误；非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通

过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。

4.（2020•北京）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）

基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。

左边屈T>右边界

・M内内・DNA

—Ha动手HHMQ茶因H终止于H—

（注：①、②、③、④表示引物）

为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3垠因，同时避免内源HMA3基因的十扰，在进行

PCR扩增时，应选择的引物组合是（)

A.①+③B.①+②C.③+@D.③+@

【答案】B

【解析】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效后动子连接，导入杨树基因组中，若

要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子

序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。

5.12019•北京）筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培

养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈（如图：，实验结果见下表。

菌种菌落直径：C（mm）透明圈直径：H（mm）H/C

细菌I5.111.22.2

细菌II8.113.01.6

A.培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质

B.筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布

C.以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外

D.H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异

【答案】C

【解析】筛选淀粉分解菌的培养基中，除淀粉提供碳源外，还需要氮源、水、无机盐等营养物质，A正

确；筛选分离淀粉分解菌时需要将菌液进行一定程度的稀释才能涂布培养，B正确；据图分析可知，两

个菌落均产生了透明圈，说明两种细菌均能将淀粉酶分泌至细胞外，C错误；据表分析可知，H/C值越

大，分解淀粉能力越强，该值的大小反映了两种细菌分解淀粉能力的差异，D正确。

6.（2017•北京）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1）,拟将其与质粒（图

2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是（)

BamHI

&oRI尸启动子

,终止子

EcoRIEroRI启动子ga

质粒

潮抵泰

基因|

IC抗性荔氏'终止子

ffll图2

A.用限制性核酸内切酶EcoRI和连接能构建重组质粒

B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞

C.在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞

D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上

【答案】C

【解析】据图分析可知，在目的基因的两端、启动子和终止子之间都有限制性核酸内切酶EcoRI的切割

位点，因此可以用限制性核酸内切酶EcoRI切割目的基因和运载体，之后再用DNA连接酶连接形成基

因表达载体，A正确；将目的基因导入到植物细胞，常用农杆菌转化法，可以将目的基因C导入到农杆

菌的Ti质粒的T-DNA段，之后再用含C基因的农杆菌侵桀菊花愈伤组织，将C基因导入细胞中染色

体上的DNA上，B正确；图2中显示标记基因是潮霉素抗性基因，应该在培养基中添加潮霉素•，筛选被

转化的农杆菌，C错误；要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用分子杂交

技术，D正确。

7.12021•北京）新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐，接种疫苗是控制全球

疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多种，其中我国科学家已研发出的腺病毒载体重组新冠病毒疫苗（重

组疫苗）是一种基因工程疫苗，其基本制备步骤是：将新冠病毒的S基因连接到位于载体上的腺病毒基因

组DNA中，重组载体经扩增后转入特定动物细胞，进而获得重组腺病毒并制成疫苗。

（1）新冠病毒是RNA病毒，一股先通过得到cDNA,经获取S基因，前切后再连接

到载体.

（2）重组疫苗中的S基因应编码—o

A.病毒与细胞识别的蛋白

B.与病毒核酸结合的蛋白

C.催化病毒核酸复制的酶

D.帮助病毒组装的蛋白

（3）为保证安全性，制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因：使其在人体中无法增殖，但重组疫苗仍然

可以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答。该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗---

诱发特异性免疫反应。

（4）重组疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病揖DNA,但其DNA

不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因。

【答案】（1）逆转录PCR扩增（2）A

（3）（重组腺病毒）进入细胞表达抗原

（4）重组腺病毒DNA在人体细胞中持续表达抗原，反复刺激机体免疫系统

【解析】（1）新冠病毒是RNA病毒，其遗传物质是RNA,若要得到与其对应的cDNA,则要进行逆转

录。用cDNA扩增出目的基因一S基因需要利用PCR扩增技术。

（2）重组疫苗作为抗原需要被人体免疫系统识别，而重组疫苗中的S基因是从新冠病毒中提取的，所以

重组疫苗中的S基因应编码病毒与细胞都能识别的蛋白，A正确，BCD错误。

故选Ao

（3）重组疫苗对人体来说属于外来异物，即抗原，故人体接种疫苗后，重组腺病毒进入人体细胞，其在

人体细胞内表达出抗原，引发机体产生特异性免疫■■细胞免疫和体液免疫，因此该疫苗发挥作用的过

程是：接种疫苗一（重组腺病毒）进入细胞-表达抗原一诱发特异性免疫反应。

（4）接种疫苗后，由于长时间内接种者体内仍能检测到重组腺病毒DNA,而DNA会不断表达出S蛋

白，S蛋白作为抗原刺激机体，故机体会反狂针对抗原产生特异性免疫应答。

8.[2019•北京）光合作用是地球二最重要的化学反应，发生在高等植物、藻类和光合细菌中。

（1）地球上生命活动所需的能量主要来源于光反应吸收的.在碳（暗）反应中，RuRP族化的（R酹）

催化CCh与RuBP（C5）结合，生成2分子C3.影响该反应的外部因素，除光照条件外还包括—（写出

两个）：内部因素包括—（写出两个）。

（2）R酶由8个大亚基蛋白（L）和8个小亚基蛋白（S）组成c高等植物细胞中L由叶绿体基因编码并在

叶绿体中合成，S由细胞核基因编码并在—中由核糖体合成后进入叶绿体，在叶绿体的—中与L组装成

有功能的酶。

（3）研究发现，原核生物蓝藻（蓝细菌）R酶的活性高于高等植物。有人设想通过基因工程技术将蓝藻R

酶的S、L基因转入高等植物，以提高后者的光合作用效率。研究人员将蓝藻S、L基因转入某高等植物（甲）

的叶绿体DNA中，同时去除甲的L基因。转基因植株能够存活并生长。检测结果表明，转基因植株中的R

酶活性高于未转基因的正常植株。

①由上述实验能否得出“转基因植株中有活性的R酶是由蓝藻的S、L组装而成”的推测？请说明理

由0°

②基于上述实验，下列叙述中能够体现生物统一性的选项包括

a.蓝藻与甲都以DNA作为遗传物质

b.蓝藻与甲都以R酶催化CO2的固定

c.蓝藻R酶大亚基蛋白可在甲的叶绿体中合成

d.在蓝藻与甲的叶肉细胞中R的组装的位置不同

【答案】（I）光能温度、CO?浓度色素含量及种类、酶的含量及活性

（2）细胞质基质基质

（3）①不能，因为转基因植株仍包含甲植株的S基因，不能排除转基因植株中R酶由蓝藻的L蛋白和甲植

株的S蛋白组成

2、基因工程技术的基本步骤:

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动了、终止了•和标记

基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方

法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将

目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-

■DNA分子杂交技术；②检测FI的基因是否转录出了mRNA■­分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译

成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）地球上生命活动所需的能量主要来源于光反应吸收的光能。在碳（暗）反应中，RuBP粉化酶（R酷）

催化CO2与RuBP（C5）结合，J成2分子C3.影响该反应的外部因素，除光照条件外还包括温度、CO2

浓度等；内部因素包括色素含量及种类、酶的含量及活性等。

（2）R酶由8个大亚基蛋白（L）和8个小亚基蛋白（S）组成c高等植物细胞中L由叶绿体基因编码并在

叶绿体中合成，S由细胞核基因编码并在细胞质基质中由核糖体合成后进入叶绿体，在叶绿体的中与L组装

成有功能的酶。

（3）①由上述实验不能得出“转基因植株中有活性的R酶是由蓝藻的S、L组装而成”的推测，因为转基因

植株仍包含甲植株的S基因，不能排除转基因植株中R酶由蓝藻的L蛋白和甲植株的S蛋白组成。

②蓝藻与甲都以DNA作为遗传物质，能体现生物统一性，a正确；蓝藻与植株甲都以R酶催化CO2的固定，

能体现生物统一性，b正确；蓝藻R酶大亚基蛋白可在甲的叶绿体中合成，能体现生物统一性，c正确：在

蓝藻与植株甲的叶肉细胞中R酶组装的位置不同，这是基因的选择性表达结果，不能体现生物统一性，d

错误。

9.（2021天津）16.乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但

不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下

图I为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。

（I）乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为o

（2）获得转基因酿酒酵母菌株的过程如卜.：

①设计引物扩增乳酸脱氢能编码序列。

为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG,且能通过

双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5,端序列应考虑和。

②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定,扩增重组质粒。重组质粒上有,

所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物和的转录系统识别并启动转录，因此重组质

粒上的乳酸脱氢酶编码序列（能/不能）在大肠杆菌中高效表达。

③提取重组质粒并转入不能合成尿喀咤的酿酒酵母菌株，在的固体培养基上筛选出转基因酿酒

酵母，并进行鉴定。

（3）以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步

提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是____________（单选）。

A.进一步优化发酵条件B.使用乳酸菌LDH基因自身的启动子

C.敲除酿酒酵母的丙酮酸脱废酶基因D.对转基因酿酒酵母进行诱变育种

【答案】（1）细胞质基质

（2）①.包含BamHI的识别序列将GTG改为ATG原核生物复制原点④.不能

⑤.缺失尿喘噬（3）B

【解析】（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记

基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方

法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将

FI的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因DNA

分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术：③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗

原抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。

（2）①设计引物1的5,端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物

偏好的ATG,以便F1的基因在酵母细胞中更好的表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含

BamHI的识别序列。

②将重组质粒导入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存

在物种特异性，重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠

杆菌中不能高效表达。

③在缺乏尿嗓咤的选择培养基上，不能合成尿喙嘘的酿酒酵母菌株不能生存，导入垂组质粒的酿酒酵母菌

株因为获得了尿喘咤合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。

（3）进一步优化发酵条件，使其更有利于乳酸菌的繁殖，可以星高其乳酸产量，A正确；由于启动子存在

物种特异性，使用乳酸菌LDH基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B错误；敲除酿酒醉母的丙酮酸

脱发酶基因，使酵母菌不能酿酒，从而提高乳酸产量，C正确；对转基因酿酒醉母进行诱变育种，可能会出

现乳酸菌的高产菌株，D正确。

10.（2021福建）21.微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植

物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。问

答下列问题：

（1）根据枣树的MTcDNA的核昔酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A

位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为。

图1

（2）本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性

末端的前切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体Eo载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序

列如图乙所示。

①选用酶将载体P切开，再用（填FDNA或"E-coli81DNA”）连接酶将MT基因

与载体P相连，构成重组载体P'。

②教体P’不具有表达MT基因和o选用