不同浓度石墨烯对藜麦幼苗形态和生理特性的影响

不同浓度石墨烯对藜麦幼苗形态和生理特性的影响摘要：近年来，纳米炭材料石墨烯在作物生长上产生重要的积极影响。在本研究中，我们配制了含有不同质量浓度石墨烯（0，2，4，8，12和20mg/L）的MS培养基，研究石墨烯对藜麦幼苗形态（茎长、主根长度、根尖形态、根尖细胞形态）和生理特性（地上部分鲜重、叶绿素相对含量、相对电导率）的影响。结果表明在石墨烯质量浓度为8mg/L的MS培养基上生长的藜麦幼苗茎长、主根长度明显增加，说明特定浓度的石墨烯能够促进藜麦根茎生长；与对照相比，浓度为4mg/L和8mg/L石墨烯处理的藜麦幼苗地上部分鲜重没有显著差异；不同浓度石墨烯处理后的幼苗叶绿素相对含量均显著增加，12mg/L的石墨烯使幼苗叶片产生较高的相对电导率。另外，我们发现在添加石墨烯的MS培养基上生长的藜麦幼苗出现根尖膨大、根毛增加的现象，其中当石墨烯质量浓度为8mg/L时最为明显。根尖细胞形态发生不规则变化，细胞膨大，并且随着石墨烯质量浓度的增加变化更加明显。综上所述，一定浓度石墨烯对藜麦幼苗根茎生长具有促进作用。本研究可为纳米炭材料石墨烯应用于农业，促进增产提供理论上的指导。EffectsofDifferentConcentrationsofGrapheneonMorphologyandPhysiologicalCharacteristicsofQuinoaSeedlingsAbstract:Inrecentyears,thegrapheneascarbonnanometermaterialhasproducedimportantandpositiveeffectonthegrowthofcrops.Inthisstudy,wepreparedMSmediumcontainingdifferentconcentrationsofgraphene(0,2,4,8,12,and20mg/L)tostudytheeffectofgrapheneonthemorphology(stemlength,mainrootlength,roottipmorphology,roottipcellmorphology)andphysiologicalcharacteristics(freshweight,relativechlorophyllcontent,relativeconductivity)ofquinoaseedlings.TheresultsshowedthatthestemlengthandmainrootlengthofquinoaseedlingsgrownonMSmediumwithagrapheneconcentrationof8mg/Lincreasedsignificantly,indicatingthataspecificconcentrationofgraphenecanpromotequinoarootgrowth;Therewasnosignificantdifferenceinthefreshweightofthegroundpartsofquinoaseedlingstreatedwith4mg/Land8mg/Lgraphenecomparedwiththecontrol;Therelativecontentofchlorophyllintheseedlingstreatedwithdifferentconcentrationsofgrapheneincreasedsignificantly,and12mg/Lofgrapheneresultedinhigherrelativeconductivity.Inaddition,wefoundthatquinoaseedlingsgrownongraphene-addedMSmediumshowedroottipenlargementandroothairsincrease,ofwhichthemostobviouswaswhentheconcentrationofgraphenewas8mg/L.Themorphologyofroottipcellschangedirregularly,thecellsexpanded,andthechangesbecamemoreobviousastheconcentrationofgrapheneincreases.Insummary,acertainconcentrationofgraphenecanpromotethegrowthofquinoaseedlingrootsandstems.Thisresearchcanprovidetheoreticalguidancefortheapplicationofgrapheneinagriculturetopromoteproduction.不同浓度石墨烯对藜麦幼苗形态和生理特性的影响引言藜麦（ChenopodiumquinoaWild），又称奎藜，源自安第斯地区土著人民种植的假谷物，它是一年生双子叶植物，具有小、圆形、扁平的形状，其颜色有白色、灰色、黑色、黄色和红色。藜麦是一种营养全面而均衡的食物，不仅富含优质蛋白质、多糖和不饱和脂肪酸等多种常量营养素，而且还包含维生素、矿物质和其他微量营养素，具有多种健康功效。此外，核黄素、叶酸和钙、镁、铁、锌等含量也高于其他谷物，并且还含有多种植物化学物质。除此之外，藜麦还具有预防和治疗乳糜泻、抗癌、抗氧化、防治高血脂、高血压、高血糖、体重减轻和消化等功能[1]。联合国粮农组织认为藜麦是唯一可以满足人体基本营养需求的食品，并正式建议藜麦为最适宜人类的完美全营养食品，将藜麦定为21世纪应对粮食安全谷物之一，2013年被指定为藜麦年[2]。藜麦也是一种经济作物，具有广泛的适应性，强抗性，耐寒性，耐盐性和耐旱性，可以在不利的生长环境（如高海拔）下种植，具有极高的经济价值[3]。石墨烯（Graphene）是一种二维炭纳米材料，内部碳原子的排列方式以sp2杂化轨道成键，它是一个六边形蜂巢晶格[4]。石墨烯具有优良的光学、电学和机械性能，被广泛用于材料学、微纳加工、能源、生物医学和药物输送[5-8]。由于近年来石墨烯制备技术和方法的不断提高，石墨烯已逐渐用于农业领域，研究石墨烯对作物生长以及植物响应的影响已成为一个新的研究热点。乔俊等发现不同质量浓度的氧化石墨烯（200mg/L、600mg/L）可以显著促进红豆种子的发芽[9]。王伟等以紫花苜蓿为研究对象，结果表明氧化石墨烯处理可提高种子发芽指数，但相反却抑制了幼苗的生长并降低了株高[10]。同样，Zhang等得出较低浓度的石墨烯处理过的种子比正常种子萌发更快、显示出明显的长茎和根，但生物量较低的实验结论[11]。其他研究表明0.1~1mg/L氧化石墨烯可促进组织培养的苹果植株的生根速率和不定根数。0.1mg/L对根系形态有正面影响，但对根系生长有负面影响[12]。Cheng等用25~100mg/L的氧化石墨烯溶液对甘蓝型油菜种子进行培养，观察到处理后的表现出更短的种子根长且根鲜重降低[13]。在探究石墨烯对树莓的影响时，胡晓飞等得出，树莓苗高、根长、根尖数和根比表面积均随着石墨烯浓度的增加先增加后减小，最佳石墨烯浓度为2mg/L[14]。另外，有研究表明用高浓度(>25mg/L)氧化石墨烯处理可显著抑制甘蓝型油菜的根长，但增加了茎长和地上鲜重，而高于50mg/L处理则显著抑制根鲜重[15]。总而言之，石墨烯对农作物种子发芽、幼苗根茎生长和生物量都有影响（包括正面和负面影响），这种作用很复杂，并且取决于剂量、浓度、暴露时间和物种等。藜麦是山西省具有很高的营养价值和经济价值的重要的杂粮作物。本研究基于不同质量浓度的石墨烯（0，2，4，8，12，20mg/L）的处理，以探索石墨烯对藜麦形态（茎长、主根长度、地上部分鲜重、根尖形态、根尖细胞形态）以及生理指标（叶绿素相对含量、相对电导率）的影响，以此来筛选对藜麦生长发育具有促进作用的石墨烯浓度范围，我们的研究可为纳米炭材料石墨烯在农业增产方面的应用提供新的思路和指导。材料和方法2.1材料待测的藜麦种子由山西省农业科学院玉米研究所提供。本研究中使用的石墨烯由山西大同大学炭材料研究所提供。通过使用电化学方法制备石墨烯并将亲水基团（COOH和C-OH）引入其表面，使石墨烯能更好地分散在水相中。原始石墨烯溶液PH值相对较低，呈弱酸性[16]。2.2实验方法2.2.1石墨烯处理制备含有不同质量浓度石墨烯（0，2，4，8，12，20mg/L）的MS培养基，消毒藜麦种子并在不同浓度石墨烯的MS培养基上分别播种，每6～7粒种子播种在一个组培瓶中，每种浓度重复3瓶，并置于人工智能气候箱（温度24℃，湿度60%，光照强度33%）中培养14d[16]。2.2.2形态及鲜重测定用剪刀从MS培养基中将藜麦幼苗的地上部分轻轻剪下，用万分之一分析天平称量地上部分鲜重后，然后用钢尺测量茎长。用自来水将根部冲洗干净，保持根系完整性，再用钢尺测量主根的长度。2.2.3叶绿素相对含量测定叶绿素相对含量通过便捷式叶绿素测定仪（SPAD-502Pluse）进行测量（以SPAD为计量单位）。由于测量部位对SPAD值读数影响较大，因此测量位置应保持大致相同（较大的藜麦叶片）并避开叶脉[17]。2.2.4相对电导率测定使用微机型DDS-22C电导率仪（杭州陆恒生物科技有限公司）测量相对电导率。用直径为0.5cm的打孔器收集相同数量的藜麦叶片，加入25ml蒸馏水，并将其在20~25℃下放置3h以测其电导率（C1）。然后煮沸30min，冷却至室温，再测其电导率（C2）。每组重复3次并取平均值。计算公式：相对电导率=C1/C2*100%[18]。2.2.5根尖形态的观察用镊子从含有不同浓度石墨烯的MS培养基中取出藜麦幼苗，用蒸馏水轻轻冲洗干净藜麦幼苗根部，然后用刀片切取1cm长的根尖放在载玻片上，盖上盖玻片，放在载物台上，使用倒置荧光显微镜（德国LEICADMi8）观察并收集图像。2.2.6根尖细胞形态的观察从对照和石墨烯（8mg/L和12mg/L）处理后的藜麦幼苗上收集根尖。将根尖样品在2.5%戊二醛中固定2小时，然后在临界点干燥器中脱水。解剖后，将样品喷金30S。根据以前发表的方法[19]，采用扫描电子显微镜（日本，HITACHISU8100）观察和收集图像信息。2.3数据处理数据处理和分析采用SPSS22.0和Origin8.0软件，图中每个数值用平均值±标准差（n＝20）表示。结果和分析3.1不同浓度石墨烯对藜麦幼苗茎长和主根长度的影响茎是植物体的重要营养器官，在根与叶之间起输导和支持作用。根系作为影响植物生长的重要器官，其主要功能是吸收水分、养分等溶质溶液，它的分布特征和发育情况与作物地上部分的生长状况、生产能力和作物水平密切相关。藜麦种子在含有不同质量浓度石墨烯（0，2，4，8，12，20mg/L）的MS培养基培养14d后，测量茎长和主根长度。从图1可以看出，在石墨烯质量浓度为8mg/L和12mg/L的MS培养基上生长的藜麦幼苗茎长明显大于对照组，8mg/L的石墨烯对藜麦幼苗主根生长有显著促进作用，主根长度大约为对照组的1.3倍。图1不同浓度石墨烯处理下藜麦幼苗茎长及主根长度3.2不同浓度石墨烯对藜麦幼苗地上部分鲜重的影响地上部分鲜重可以用来衡量生物量大小。如图2所示，在石墨烯质量浓度为4，8mg/L的MS培养基上生长的藜麦地上部分鲜重与对照组相比无显著差异，但是当石墨烯质量浓度为12mg/L时，藜麦地上部分鲜重明显低于对照组。图2不同浓度石墨烯处理下藜麦幼苗地上部分鲜重3.3不同浓度石墨烯对藜麦叶绿素相对含量的影响叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，其含量是表征植物生长状况、光合作用效率和营养状况的重要指标[20]。如图3所示，在石墨烯质量浓度为4，8，12mg/L的MS培养基上生长的藜麦叶绿素相对含量均显著高于对照组，其中石墨烯质量浓度为4mg/L时效果最为明显，叶绿素相对含量约为对照组的1.6倍。图3不同浓度石墨烯处理下藜麦叶绿素相对含量3.4不同浓度石墨烯对藜麦相对电导率的影响细胞膜为植物细胞提供了一个相对稳定的内部环境，以维持正常的生理代谢活动。相对电导率是一个直观数值，它能反映生物膜在植物体内透性的变化，是反映植物细胞膜受胁迫的重要指标之一[21，22]。如图4所示，在石墨烯质量浓度为4mg/L和8mg/L时，藜麦相对电导率无明显变化，而当石墨烯质量浓度为12mg/L时，其相对电导率显著高于对照组，说明细胞质膜受损。图4不同浓度石墨烯处理下藜麦相对电导率3.5不同浓度石墨烯对藜麦幼苗根尖形态的影响根尖是根系中生命活动最活跃的部分。根主要根毛从吸收水分和无机盐。为进一步说明石墨烯对藜麦幼苗根系有促进作用，我们通过光学显微镜观察了经过不同质量浓度石墨烯处理的藜麦幼苗根尖形态，发现在石墨烯的参与下，藜麦幼苗均出现不同程度的根尖膨大、根毛增加现象，其中石墨烯质量浓度为8mg/L时最为明显（图5）。图5不同浓度石墨烯处理下藜麦幼苗根尖形态3.6不同浓度石墨烯对藜麦根尖细胞形态的影响我们通过扫描电子显微镜进一步观察了藜麦幼苗的根尖细胞形态。比较发现，添加石墨烯的藜麦根尖细胞形态发生不规则变化，细胞膨大，并且随着石墨烯质量浓度的增加这种变化更加明显（图6）。图6不同浓度石墨烯处理下藜麦幼苗根尖细胞形态。（A，D，G）、（B，E，H）和（C，F，I）分别为对照组、8mg/L石墨烯处理、12mg/L石墨烯处理的藜麦幼苗根尖不同放大倍数下的扫描电镜照片。讨论与结论纳米碳材料石墨烯应用研究的飞速发展，使其在越来越多的领域中显示出广泛的应用价值和良好的特性。随着藜麦在我国某些地区的引进和种植，藜麦已逐渐成为中国粮食中的重要组成部分，并在我国农业经济的发展中发挥着重要作用[23]。在本研究中，我们探索了不同浓度石墨烯对藜麦幼苗形态特征（主根长度、地上部分鲜重、根尖形态、根尖细胞形态、茎长）和生理指标（叶绿素相对含量、相对电导率）产生的影响，结果发现，在特定浓度下石墨烯对藜麦幼苗形态特征、生长发育状况以及某些生理指标的影响均表现为促进作用。石墨烯质量浓度为8mg/L的MS培养基上生长的藜麦幼苗茎长和主根长度明显高于对照组，表明一定浓度的石墨烯会引起藜麦根茎的生长发育。然而，在石墨烯质量浓度为4，8mg/L的MS培养基中生长的藜麦幼苗地上部分鲜重与对照组相比无明显差异，并在12mg/L时显著下降。至于石墨烯或氧化石墨烯促进植物种子萌发、根系生长的原因，我认为这与石墨烯表面的亲水、疏水基团的桥接作用有关。通过实验得出可能的原因是诱导作物体内水通道蛋白的表达，从而促进根对水分的吸收[8]。Zhang等发现石墨烯可穿透种子外皮，破坏外壳，渗入根尖细胞，使水更容易进入[10]。另有人认为20mg/L氧化石墨烯通过ABA和IAA途径促进野生番茄根系生长[24]。除此之外，近来有研究还证实了20mg/L氧化石墨烯通过提高ABA含量，降低IAA含量促进野生番茄根系生长，而50mg/L对甘蓝型油菜根系生长产生抑制[13]，其原因我们认为可能与氧化石墨烯浓度有关。陈凌云却得出GO富集在小麦根部，导致根的显微结构、超微结构变化，并诱发了根部的氧化应激[25]。在石墨烯质量浓度为4mg/L的MS培养基上的叶绿素相对含量显著高于对照组，表明一定程度能增强光合作用，有利于养分的积累。石墨烯质量浓度为12mg/L时，其相对电导率显著高于对照组，说明细胞质膜受到损伤。根据分析认为原因是石墨烯可以吸附培养基中游离的无机盐离子，并在培养基内部形成一定的电位差[8]。遵循从高到低的电势能规律可以有效地促进植物根尖吸收营养物质[14]。与此相反，段成伟却得出石墨烯通过影响暗棕壤土壤养分的变化，从而影响长白落叶松幼苗的养分吸收，导致叶片出现失绿现象[26]。另外，Parvin等的结果显示石墨烯对甘蓝、番茄有较强的毒性，对红色菠菜毒性较弱，而对生菜几乎没有毒性[27]，表现出明显的物种差异，其中的机理和机制还有待进一步研究和探索。在石墨烯的参与下，藜麦幼苗出现根尖膨大、根毛增加现象，胡晓飞等通过扫描电子显微镜发现添加了石墨烯的树莓组培苗的不定根表面根毛更加发达[14]，与本文的研究结构具有一定的相似性，从侧面印证了文中结论。另外，氧化石墨烯(grapheneoxide，GO)是石墨烯重要的衍生物，由于含氧基团的修饰，其表面较石墨烯更亲水[28]。因此，下一步中，我们可以尝试研究不同浓度氧化石墨烯及其他石墨烯衍生物对植物生长的影响，为提高作物产量提供更多的指导。总之，石墨烯与藜麦幼苗根系生长、部分形态特征及生理指标有着非常密切的关系，影响的大小取决于其剂量或浓度，特定浓度石墨烯的应用能够有效促进藜麦的生长发育，增强光合效率。在该实验中，促进藜麦幼苗生长的石墨烯的最适浓度为8mg/L。本研究为进一步探索石墨烯对作物生长的影响提供了重要信息，对藜麦的引种和栽培具有重要意义。

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