DNA 甲基化在百草枯致神经细胞毒作用中的作用

摘要目的探讨百草枯(PQ)处理Neuro-2a细胞后对总体甲基化水平的影响，应用活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）预先处理理细胞后检测PQ处理的Neuro-2a细胞总体甲基化水平，以阐述活性氧在PQ引起的DNA甲基化改变中的作⽤，从而探讨百草枯对神经细胞的毒作用及其可能机制。方法(1)0、50μmol/L、100μmol/L、300μmol/LPQ处理Neuro-2a细胞24h后，流式细胞仪检测细胞总体甲基化水平。(2)0、50μmol/L、100μmol/L、300μmol/LPQ处理Neuro-2a细胞48h后，流式细胞仪检测细胞总体甲基化水平。(3)0、100μmol/LNAC预处理理Neuro-2a细胞2h后，分别⽤0、100μmol/L、300μmol/LPQ处理48h,流式细胞仪检测细胞总体甲基化水平。结果(1)PQ处理可引起Neuro-2a细胞总体甲基化水平升高。PQ处理24小时，与对照组相比，与对照组相比，50μMPQ处理的Neuro-2a细胞及100μMPQ处理的Neuro-2a细胞总体甲基化水平均升高，但差异无统计学意义()，300μMPQ处理的Neuro-2a细胞总体甲基化水平升高，差异有统计学意义()；PQ处理48小时，与对照组相比，50μMPQ处理的Neuro-2a细胞总体甲基化水平升高，但差异无统计学意义(),对照组相比，100μMPQ处理的Neuro-2a细胞和300μMPQ处理的Neuro-2a细胞的总体甲基化水平均升高，差异均有统计学意义()。(2)NAC预处理可减弱PQ引起的Neuro-2a细胞总体甲基化水平升高。与对照组相比，100μMNAC处理的Neuro-2a细胞总体甲基化水平升高，差异有统计学意义()。100μMNAC+100μMPQ组与对照组（0NAC+0PQ组）细胞总体甲基化荧光强度未见明显变化，差异无统计学意义（）。与100μMPQ组相比，100μMNAC+100μMPQ组Neuro-2a细胞总体甲基化水平降低，差异有统计学意义（）。与100μMPQ组相比，300μMNAC+100μMPQ组Neuro-2a细胞总体甲基化水平降低，但差异无统计学意义（）。结论（1）PQ可诱导Neuro-2a细胞中总体甲基化水平的改变，随着PQ浓度的增高，神经细胞的总体甲基化水平增高；（2）活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可抑制PQ所导致的神经细胞DNA甲基化水平的升高，表明PQ可能通过氧化应激作用引起DNA甲基化改变。关键词：百草枯帕金森病氧化应激DNA甲基化AbstractObjectiveToinvestigatetheeffectofparaquat(PQ)ontheoverallmethylationlevelofNeuro-2acells,andtodetectPQ-treatedNeuro-2acellsbypretreatmentofNeuro-2acellswithreactiveoxygenscavengerN-acetylacetylcysteine(NAC).TheoveralllevelofmethylationtoelucidatetheroleofreactiveoxygenspeciesinPQ-inducedchangesinDNAmethylation,therebyexploringthetoxiceffectsofparaquatonnervecellsanditspossiblemechanisms.Methods(1)FlowcytometrywasusedtodetecttheoverallmethylationlevelofNeuron-2acellsaftertreatmentwithparaquatatdifferentconcentrationsafter24hours.(2)FlowcytometrywasusedtodetecttheoverallmethylationlevelofNeuron-2acellsaftertreatmentwithparaquatatdifferentconcentrationsafter48hours.(3)Neuro-2acellswerepretreatedwithdifferentconcentrationsofNAC(N-AcetylCysteine),andthenexposedthecellsunderdifferentconcentrationsofPQ,flowcytometrywasusedtodetecttheoverallmethylationlevelofNeuron-2acellsaftertreatment.Results(1)PQtreatmentcancauseanincreaseintheoverallmethylationlevelofNeuro-2acells.AfterPQtreatmentfor24hours,thetotalmethylationlevelof50μMPQ-treatedNeuro-2acellsand100μMPQ-treatedNeuro-2acellswashigherthanthatofthecontrolgroup,butthedifferencewasnotstatisticallysignificant(),thetotalmethylationlevelofNeuro-2acellstreatedwith300μMPQwasincreased,thedifferencewasstatisticallysignificant();PQtreatmentwas48hours,comparedwiththecontrolgroup,50μMPQ-treatedNeuro-2acellswerenochangeintheoverallmethylationlevelofthecells,andthedifferencewasnotstatisticallysignificant().Theoverallmethylationlevelof100μMPQ-treatedNeuro-2acellsand300μMPQ-treatedNeuro-2acellswascomparedinthecontrolgroup,thedifferencewasstatisticallysignificant().(2)NACpretreatmentattenuatedtheincreaseinoverallmethylationlevelofNeuro-2acellsinducedbyPQ.Comparedwiththecontrolgroup,thetotalmethylationlevelofNeuro-2acellstreatedwith100μMNACwasincreased,andthedifferencewasstatisticallysignificant().Therewasnoapparentchangeintheoverallmethylationfluorescenceintensityof100μMNAC+100μMPQgroupandcontrolgroup,andthedifferencewasnotstatisticallysignificant().Comparedwiththe100μMPQgroup,theoverallmethylationlevelofNeuro-2acellsinthe100μMNAC+100μMPQgroupwassignificantlylower().Comparedwiththe100μMPQgroup,theoverallmethylationlevelofNeuro-2acellsinthe300μMNAC+100μMPQgroupwasdecreased,butthedifferencewasnotstatisticallysignificant().Conclusions(1)PQcaninducechangesintheoverallmethylationlevelinNeuro-2acells，astheconcentrationofPQincreases,theoverallmethylationlevelofnervecellsincreases;(2)Reactiveoxygenscavenger—N-acetylcysteine(NAC)inhibitstheincreaseinneuronalDNAmethylationlevelscausedbyPQ,suggestingthatPQmaycauseDNAmethylationchangesthroughoxidativestress.KeyWords：Paraquat;Parkinson’sdisease;OxidativeStress;DNAmethylation前言作为广泛使用的除草剂之一的百草枯(paraquat，PQ)，是世界上用量第⼆大的除草剂，广泛用于农业、园艺等领域，进入人体的途径主要有呼吸道吸入、皮肤接触或人进食表面残留该毒物的食物。[1]它能进入中枢神经系统从而造成损害，是因为它可通过中性氨基酸转运蛋白穿透血脑屏障，可高度选择性地损害中脑黑质多巴胺能神经元，是散发性帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)潜在的环境危险因素之一。[2]帕金森病是人群中第二常见的慢性神经退行性疾病，中脑黑质部位的多巴胺能神经元受损是该病的病理特征，导致多巴胺合成功能下降以及脑内多巴胺含量减少，进而引起相应的临床症状。其临床表现为局限于身体的一侧的肢体静止性震颤，症状包括运动迟缓，肌强直和步态不稳定。PD的病因和发病机制尚不清楚，主要为散发病例。实验研究表明，多巴胺合成和代谢酶缺乏，线粒体功能障碍，氧化应激，毒物反应基因表达的变化以及异常的细胞凋亡和炎症机制等都与帕金森病的发病机制有关。[3,4]一些环境化合物和毒素可引起PD，如1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）和鱼藤酮。百草枯的化学结构与MPTP相似，尤其与MPP+的结构极为相似，已有实验表明通过对受试对象进行百草枯的染毒处理而构建帕金森病的模型。[5,6]DNA甲基化是哺乳动物基因表达调控的表观遗传学形式，在大脑中，DNA甲基化通常起到沉默基因表达的作用，是记忆获取和储存的重要中介。[1]研究表明，认知障碍与神经退行性变化有关，包括DNA甲基化和去甲基化，以及两种状态之间转换的快速失调。还有学者的研究表明，DNA甲基化与PD之间存在密切关系，而PQ是PD发病的重要环境危险因素之一，DNA甲基化和PQ暴露之间的关系目前尚未定论。细胞对各种有毒有害物质作用的防御障碍可以引起氧化应激导致的氧化损伤，诸多疾病的发病机制均涉及氧化应激。大多数学者认为百草枯进入细胞并参与一系列交替的氧化还原反应。在这个过程中，百草枯消耗细胞内多种酶，包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）和细胞色素P450还原酶，这直接导致超氧阴离子和过氧化氢的产生，并且通过歧化过氧化氢生成羟自由基。[7,8]而PQ所引起的氧化应激与PQ引起的细胞表观遗传的改变之间的关系及相互作用目前还不是很清楚。综上所述，基于本课题“百草枯处理Neuro-2a细胞后对总体甲基化水平的影响”，结合文献阅读以及一些其他研究成果，可以初步得到如下猜想：PQ的暴露可以引起神经细胞发生氧化应激作用，进而引起神经细胞总体的DNA甲基化水平发生增高，从而通过其他的一些途径引起神经细胞的损害，造成神经系统乃至机体的损伤，该猜想可用图1表示。图1DNA甲基化在百草枯所致神经细胞损害中的作⽤及其改变的可能机制本课题通过0、50μmol/L、100μmol/L、300μmol/L的百草枯染毒处理Neuron-2a细胞24小时，0、50μmol/L、100μmol/L、300μmol/L的百草枯染毒处理Neuron-2a细胞48小时及活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）0、100μmol/L干预Neuron-2a细胞2小时后再分别用100μmol/L、300μmol/L的百草枯处理48小时(NAC与PQ的组合共6种)，测定不同处理下每组细胞总体甲基化水平，探讨不同浓度百草枯、染毒时间对细胞DNA甲基化水平的影响,此外，还可探讨氧化应激作用在该过程中扮演的角色，以及在该过程中细胞总体甲基化水平改变的可能机制。本课题技术路线用框图表示如下：1材料与方法1.1研究材料1.1.1细胞系Neuro-2a细胞，购自上海中科院细胞库。1.1.2耗材75mm、100mm细胞培养瓶Falcon公司15ml、50ml离心管、1.5ml细胞冻存管Coring公司6孔板、一次性移液管Costar公司lml、200μl、10μlTip头Axygen公司1.5mlEP管Axygen公司1.1.3主要试剂DMEM液体培养基美国HyClone公司胎牛血清美国HyClone公司新生牛血清浙江天航生物科技股份有限公司青霉素,0.25%链霉素美国HyClone公司0.25%胰酶EDTA美国GIBCO公司ReleaseA北京庄盟国际生物基因科技有限公司百草枯，PQdichloridehydrate(99.2%w/w)美国SigMA公司4%多聚甲醛固定液Wabcan生物技术有限公司甲醇天津市恒兴化学试剂制造有限公司吐温20西陇科学股份有限公司氢氧化钠上海麦克林生物化学有限公司AlbuminBovineV北京索莱宝生物科技有限公司乙酰半胱氨酸(NAC)美国SIGMA公司Anti-5-MeCydantibody(MousemAb)Calbiochem公司FITCGoatAnti-MouseIgG(H+L)ABclonal公司1.1.4主要仪器设备HF-safe1200型生物安全柜香港力康科学仪器有限公司Forma系列CO2培养箱美国Thermo公司DK-8D电热恒温水槽上海精密实验设备厂GI54DWS自动压力蒸汽灭菌器玫微厦门仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌器上海博讯实业有限公司EASYpureII超纯水系统装置美国Barnsteaed公司4°C低温冰箱中国海尔集团-20°C超低温冰箱中国海尔集团-80°C超低温冰箱美国Thermo公司低速离心机德国Eppendorf公司GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱上海博迅实业有限公司SERIAL000582型制冰机厦门精艺兴业科技有限公司流式细胞仪FACSVerse美国BD公司1.1.5主要培养基及试剂配制(1)DMEM培养液:DMEM细胞培养基，另加青霉素100μmol/L、链霉素100g/L、胎牛血清10%配成。(2)甲醇：PBS混合液：按88%甲醇原液和12%0.1mol/L的PBS溶液体积比进行配制。(3)PBS-BSA溶液：0.1mol/L的PBS溶液、1%BSA配成。(4)PBST溶液：0.1mol/L的PBS溶液、0.1%吐温-20配成。(5)PBST-BSA溶液：0.1mol/L的PBS溶液、1%BSA、0.1%吐温-20配成。1.2实验方法1.2.1Neuro-2a细胞的培养与传代显微镜下观察细胞形态和生长状况→用1ml移液枪吸尽旧的培养液用培养基用0.1mol/L的PBS溶液洗一~两次→加入含10%胎牛血清和双抗的新DMEM培养液→反复吹打细胞，直到细胞全部悬浮起来→吸出全部，加入新的培养瓶中→最后再补充加入一定量新的培养液，放入培养箱(37°C，5%CO2)1.2.2细胞总甲基化水平的测定（1）将细胞接种至六孔板待其融合度达80%左右时，不同浓度PQ(n=3)分别处理Neuro-2a细胞，染毒剂量分别为0、50μmol/L、100μmol/L、300μmol/L，其中一组染毒24小时，另一组染毒48小时；（2）胰酶消化，300g离心，收集细胞；（3）用PBS(1%BSA+0.1%Tween-20)洗细胞2次；（4）用4%多聚甲醛37°C，固定细胞10min；（5）4°C，10min冷却样品；（6）加入9体积-20°C预冷的甲醇：PBS混合液(88%甲醇+12%PBS体积比)，室温下PBS-BSA洗2次；（7）37°C，2mol/LHCl至少30min，然后加入0.1mol/L的硼酸溶液(pH=8.5)5min;ReleaseA(10μg/ml)，37°C作用1h；（8）PBST-BSA洗2次；（9）PBST-BSA稀释的10%小牛血清封闭20min；（10）用PBST-BSA(含1%)稀释5-mC抗体(终浓度为5μg/ml)，于37°C孵育1小时；（11）PBS清洗3次，每次5min；（12）加入PBST稀释的二抗(终浓度为4μg/ml)于37°C孵育30min;（13）PBST清洗3次，每次5min；（14）流式细胞仪检测，激发波长530nm，发射波长590nm；（15）将细胞接种至六孔板待其融合度达80%左右时，不同浓度NAC(n=3)分别处理Neuro-2a细胞，干预剂量分别为0、100μmol/L、500μmol/L，48小时后检测细胞内总体甲基化水平；（16）重复（2）-（14）；（17）将细胞接种至六孔板待其融合度达80%左右时，不同浓度PQ和NAC(n=4)分别处理Neuro-2a细胞，干预剂量分别为100μMNAC+100μMPQ、100μMNAC+300μMPQ、500μMNAC+100μMPQ、500μMNAC+300μMPQ，48小时后检测细胞内总体甲基化水平；（18）重复（2）-（14）。1.2.3实验结果分析所有数据采用IBMSPSS22.0统计包进行统计分析。各指标数据经过正态性检验和方差齐性检验，单因素方差分析(One-WayANOVA),采用LSD-t检验法进行两两比较，若不具备正态性和（或）方差齐性，则先进行数据变换使之符合正态性和（或）方差齐性，再按照上述方法进行统计分析，否则采用基于秩次的非参数检验进行统计分析，采用Dunnet’T3检验法进行两两比较。析因设计实验结果用析因设计方差分析(UnivarJateAnalysisofVariance)进行分析。检验水准α=0.05，并进行剂量-效应模型的构建。2结果2.1DNA甲基化在百草枯致神经细胞毒作用中的作用经过Neuro-2a细胞的常规培养，选择状态较好、融合度较高的细胞对其进行PQ和(或)NAC的处理，处理完成后收集细胞进行预处理，流式细胞仪检测各组细胞总体甲基化荧光强度，整理数据进行分析，分别评价不同染毒时间、不同剂量的PQ对Neuro-2a细胞总体甲基化水平的影响。2.1.1PQ处理24小时后神经细胞DNA甲基化水平变化分析流式细胞术测定PQ处理24小时后Neuro-2a细胞总体甲基化荧光强度表示，与对照组相比，50μMPQ处理的Neuro-2a细胞及100μMPQ处理的Neuro-2a细胞总体甲基化水平均升高，但差异无统计学意义()。与对照组相比，300μMPQ处理的Neuro-2a细胞总体甲基化水平升高，差异有统计学意义（）。(A)a)对照组b)50μMPQ组c)100μMPQ组d)300μMPQ(B)图1PQ处理24小时对Neuro-2a细胞总体DNA甲基化的影响。(A)流式细胞仪检测PQ处理24小时后Neuro-2a细胞总体甲基化荧光强度代表图；（B）不同浓度PQ处理对Neuro-2a细胞总体DNA甲基化的影响：与对照组相比，●表示，表示。2.1.2PQ处理48小时后神经细胞DNA甲基化水平变化分析流式细胞术测定PQ处理48小时后Neuro-2a细胞总体甲基化荧光强度表示，与对照组相比，50μMPQ处理的Neuro-2a细胞总体甲基化水平升高，但差异无统计学意义，。与对照组相比，100μMPQ处理的Neuro-2a细胞及300μMPQ处理的Neuro-2a细胞总体甲基化水平均升高，差异均有统计学意义，。(A)a)对照组b)50μMPQ组c)100μMPQ组d)300μMPQ(B)图2PQ处理48小时对Neuro-2a细胞总体DNA甲基化的影响。(A)流式细胞仪检测PQ处理48小时后Neuro-2a细胞总体甲基化荧光强度代表图；（B）不同浓度PQ处理对Neuro-2a细胞总体DNA甲基化的影响：与对照组相比，●表示，表示。2.2氧化应激在百草枯致神经细胞DNA甲基化水平改变中的作用经过Neuro-2a细胞的常规培养，选择状态较好、融合度较高的细胞对其进行PQ和(或)NAC的处理，处理完成后收集细胞进行预处理，流式细胞仪检测各组细胞总体甲基化荧光强度，整理数据进行分析，分别评价PQ、NAC对Neuro-2a细胞总体甲基化水平的影响以及PQ和NAC的交互作用。2.2.1NAC处理后神经细胞DNA甲基化水平变化分析流式细胞术分别测定0NAC和100μMNAC处理Neuro-2a细胞2小时后常规培养48小时的总体甲基化荧光强度表示，与对照组相比，100μMNAC处理的Neuro-2a细胞总体甲基化水平升高，差异有统计学意义()。(A)a)0NAC组b)100μMNAC组(B)图3NAC处理2小时常规培养48小时对Neuro-2a细胞总体DNA甲基化的影响。(A)流式细胞仪检测NAC处理2小时常规培养48小时后Neuro-2a细胞总体甲基化荧光强度代表图；（B）不同浓度PQ处理对Neuro-2a细胞总体DNA甲基化的影响：与对照组相比，●表示。2.2.2NAC与PQ联合处理后神经细胞DNA甲基化水平变化分析流式细胞术分别测定100μMNAC+100μMPQ、100μMNAC+300μMPQ处理Neuro-2a细胞48小时后总体甲基化荧光强度，单因素方差分析表示，100μMNAC+100μMPQ组与对照组（0NAC+0PQ组）细胞总体甲基化荧光强度未见明显变化，差异无统计学意义（）。析因设计方差分析表示，NAC与PQ之间存在交互作用，与100μMPQ组相比，100μMNAC+100μMPQ组Neuro-2a细胞总体甲基化水平降低，差异有统计学意义（）。(A)a)对照组b)100μMNAC+100μMPQ组c)100μMPQ组(B)图4100μMNAC处理2小时后PQ处理48小时对Neuro-2a细胞总体DNA甲基化的影响。(A)流式细胞仪检测100μMNAC预处理2小时后100μMPQ处理48小时的Neuro-2a细胞总体甲基化荧光强度代表图；（B）不同浓度PQ处理对Neuro-2a细胞总体DNA甲基化的影响：与对照组相比，●表示；与100μMPQ组相比，#表示。3讨论帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)的病因和发病机制目前仍不清楚，且大多数为散发病例，一系列的神经退行性病变是PD的主要临床表现。我国虽已于2016年7月1日停止百草枯(paraquat，PQ)其水剂在国内销售和使用，但其作为全世界广泛应用的除草剂，至今国内外依然有PQ中毒的报道，同时环境中的PQ也是散发性PD潜在的环境危险因素之⼀。因此，PQ对神经系统的毒性作用机制研究可以为PD的病因以及治疗研究提供思路。本研究表明，PQ可诱导Neuro-2a细胞细胞总体DNA甲基化水平上升，且随着PQ暴露剂量越高，甲基化水平上升越高。先前研究表明氧化应激作用可能是PQ致神经细胞损害的途径之一，因此本研究应用N-乙酰半胱氨酸（NAC）进行进一步研究，探讨其单独作用时是否对Neuro-2a细胞细胞总体DNA甲基化水平产生影响以及在Neuro-2a细胞细胞总体DNA甲基化水平改变过程中，NAC与PQ存在交互作用。本研究应用0、50μM、100μM、300μMPQ处理Neuro-2a细胞24小时,流式细胞术测细胞总体DNA甲基化荧光强度，根据样本值观察得出不同浓度的PQ处理均可引起Neuro-2a细胞总体DNA甲基化水平的上升，但进行方差分析表明，只有高剂量组(300μM组)与对照组的差异具有统计学意义（），而低剂量组(50μM组)、中剂量组(100μM组)与对照组的差异均无统计学意义（），分析可能低剂量组和中剂量组的细胞总体甲基化水平确有升高，但由于样本量的原因导致统计效能较低。本研究应用0、50μM、100μM、300μMPQ处理Neuro-2a细胞48小时,流式细胞术测细胞总体DNA甲基化荧光强度，根据样本值观察得出不同浓度的PQ处理均可引起Neuro-2a细胞总体DNA甲基化水平的上升，但进行方差分析表明，中剂量组(100μM组)、高剂量组(300μM组)与对照组的差异均具有统计学意义（），而低剂量组(50μM组)与对照组的差异无统计学意义（），分析原因同上，实验中每一剂量组可设置较多而合理的平行对照，以提高统计学的检验效率。本研究数据表明PQ暴露引起了Neuro-2a细胞总体甲基化水平升高。在大脑中，DNA甲基化，通常起作用沉默基因表达的作用，是一个重要的记忆获取和存储调节者。[7,9,10]研究表明,利用百草枯处理Neuro-2a细胞能够建立帕金森病(PD)的细胞模型，而PD主要的临床表现为一系列的神经退行性病变。百草枯是PD发病的重要环境因素[2,11,12]，暴露时间越长，发病率越高[13]。提示可以用同