G1-Chi-73-VP7基因原核表达载体的构建与鉴定

1引言轮状病毒（Rotavirus,RV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae），是一种双链RNA病毒[1]。RV是引起五岁以下的幼儿以及幼龄动物腹泻的主要病原体[2]，每年由RV引起的婴幼儿腹泻的病例数不胜数，重症腹泻就多达200万，甚至每年有30-90万婴幼儿因RV感染而死亡[3]。且其感染具有全球性，几乎所有国家和地区都存在相关病例[4]。由此可见，RV感染是当前危害较大的病毒性传染病之一。其临床以腹泻、呕吐和低热为典型特征，患儿多有脱水现象，少数可能出现中耳炎、肠套叠、高热惊厥等反应，严重时可导致死亡[5]。自从Bishop[6]等人首次分离出RV颗粒以来，轮状病毒引起的腹泻在世界各地都有发生。轮状病毒的RNA基因组能够编码6种结构蛋白（VP1～VP4、VP6、VP7）和6种非结构蛋白（NSP1～NSP6），它们能决定病毒的免疫原性、更会影响病毒的结构以及功能[7]，目前轮状病毒已被分为A、B、C、D、E、F、G共7个组[8-13]。前三组既可以感染人也能够感染动物，而后四组只能感染动物[14]。其中，引起婴幼儿和新生动物重症腹泻的主要是A组轮状病毒[15]。图1轮状病毒结构模式图D1.轮状病毒粒子结构图;2.轮状病毒结构蛋白；D3.轮状病毒基因片段;4.轮状病毒非结构蛋白Figure1patternofstructureofrotavirus1.Particlestructureofrotavirus;2.Rotavirusstructuralprotein;3.Rotavirusgenefragment;4.Rotavirusunstructuredprotein根据轮状病毒某些结构蛋白的特异性不同，可将其分为14个不同的血清型[16]。在不同的地区和不同的国家，流行的轮状病毒毒株存在有很大的差异，甚至在同一地区的不同年份其流行株也会发生显著变化[17]。2001年以前，在中国的轮状病毒病例中，G1血清型占比高达65%~85%。2001年之后，G1血清型占比有所下降，但仍占有30%左右的比例，且在某些省份依旧为最流行的血清型[18]。从全球范围来看，G1血清型是也主要的流行型别之一[19]。RV在世界范围内对人类安全和养殖业造成了较大的危害[20]。在非洲和亚洲的某些地区，婴幼儿呕吐、腹泻大多是由RV引起的，每年因其感染而死亡的婴幼儿高达90万[21]，死亡率超过85%。幼龄动物也极易感染RV，发病率高达80%[22]。而事实证明，仅仅依靠提高生活卫生水平和简单的预防措施不能有效地防止RV感染并降低感染率，发病率也居高不下[23]。一些发达国家为预防和治疗RV感染投入高达数10亿美元对其进行研究和治疗，而效果依旧不太理想。由于对轮状病毒引起地重症腹泻缺乏特效药物,对感染病例临床只能采用补液等对症治疗等治疗方法[24]。虽然目前已发现有一些药物能够初步缓解RV感染引起的呕吐、腹泻等症状，但还没有研制出治疗轮状病毒感染的特效药物[25]。预防轮状病毒感染的主要手段是接种疫苗[26]。比利时GlaxoSmithKline公司基于轮状病毒广为流行的G1血清型研制出了Rotarix疫苗；美国Merck公司通过基因重组技术将人轮状病毒中编码VP4和VP7的基因导入WC3株得到Rotateq疫苗；中国兰州生物制品研究所根据青海绵羊感染的G1血清型RV研制出LLR疫苗；越南卫生部疫苗与生物制品研究中心研制出免疫原性与安全性与Rotarix相似的Rotavin-MI疫苗；印度Bharat生物技术国际有限公司研制出的Rotavac是一种包括血清型G1、G2、G3、G4和G9的人-牛重组RV五价减毒活疫苗；印度血清研究所有限公司与美国国家过敏和传染病研究所合作开发的Rotasiil是一种需口服冻干粉剂疫苗[27-29]。市面上出现的轮状病毒疫苗，主要分为动物的轮状病毒毒株、人和动物的重组株和从人轮状病毒毒株经过减毒之后而获得的[30]。注射RV疫苗可有效预防婴幼儿及幼龄动物RV感染[31]，目前全球已有多个国家将RV疫苗纳入计划免疫[32]。虽然已有多个国家研制并生产出有效的RV疫苗，但是疫苗价格、需接种的剂量、对不良反应的担忧以及不同地区流行株的差异问题还需要解决[33]。因此，本研究通过优化与合成G1-Chi-73-VP7基因、构建G1-Chi-73-VP7基因原核表达载体，探索其在原核细胞大肠杆菌中大量表达的条件，将为后续RV原核表达的研究提供基础与经验，具有一定的社会意义。2材料与方法2.1材料pMD19T-G1Rov-Chi-73-VP7由Takara公司合成；感受态细胞BL21(DE3)和Transetta(DE3)，载体pET28a由南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室、衡阳师范学院校企联合生物药物研发实验室构建保存；PVDF膜在上海莼试生物技术有限公司所购；脱脂奶为雀巢脱脂奶。IPTG购于Takara公司；蛋白Marker购自Thermo公司；卡那霉素购Solarbio公司；质粒DNA小剂量试剂盒、PCR清洁试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均从AxygenBiosciences公司所购；一抗Anti-GSTmAb（武汉三鹰，货号：66005-1-1g）、二抗Goat-Anti-mousepAb（武汉三鹰，货号：SA00001-1）；溴化乙锭（EB）、IPTG、考马斯亮蓝R250、内切酶BamHI和XhoI酶均从宝生物工程（大连）有限公司所购。2.2方法 2.2.1G1-Chi-73-VP7基因的优化与合成首先利用DNAStar7.0软件和http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/网站对G1-Chi毒株的VP7基因进行密码子优化；G1-Chi-73-VP7优化后的序列如下：ATGTATGGTATTGAATATACTACTATTTTAATTTTCTTAATTTCTATTATTTTATTAAACTATATTTTAAAATCTGTTACTCGTATTATGGATTATATTATTTATCGTTTCTTATTAATTTCTGTTGCTTTATTCGCTTTAACTAAAGCTCAAAACTATGGTTTAAACATTCCAATTACTGGTTCTATGGATACTGTTTATTCTAACTCTACTCAAGAAGGTGTTTTCTTAACTTCTACTTTATGTTTATATTATCCAACTGAAGCTTCTAACCAAATTTCTGATGGTGAATGGAAAGATTCTTTATCTCAAATGTTCTTAACTAAAGGTTGGCCAACTGGTTCTGTTTATTTCAAAGAATATTCTAACATTGTTGATTTCTCTGTTGATCCACAATTATATTGTGATTATAACTTAGTTTTAATGAAATATGATCAAAACTTAGAATTAGATATGTCTGAATTAGCTGATTTAATTTTAAACGAATGGTTATGTAACCCAATGGATATTACTTTATATTATTATCAACAATCTGGTGAATCTAACAAATGGATTTCTATGGGTTCTTCTTGTACTGTTAAAGTTTGTCCATTAAACACTCAAACTTTAGGTATTGGTTGTCAAACTACTAACGTTGATTCTTTCGAAACTGTTGCTGAAAACGAAAAATTAGCTATTGTTGATGTTGTTGATGGTATTAACCACAAAATTAACTTAACTACTACTACTTGTACTATTCGTAACTGTAAAAAATTAGGTCCACGTGAAAACGTTGCTGTTATTCAAGTTGGTGGTTCTAACATTTTAGATATTACTGCTGATCCAACTACTAACCCACAAATTGAACGTATGATGCGTGTTAACTGGAAACGTTGGTGGCAAGTTTTCTATACTATTGTTGATTATATTAACCAAATTGTTCAAGTTATGTCTAAACGTTCTCGTTCTTTAAACTCTGCTGCTTTCTATTATCGTGTTTAG再用DNAStar7.0软件和/sumchan/caltor.html网站对优化后序列进行稀有密码子的核验；最后由Takara公司根据优化后的G1-Chi-73-VP7基因序列进行全基因合成。2.2.2G1-Chi-73-VP7基因的酶切与纯化（1）基因工程菌株的活化与质粒提取往50mL规格的灭菌LB培养基中加入氨苄青霉素（Amp）50µL，再将由Takara公司合成的pMD19T-G1Rov-Chi-73-VP7取50µL加入到50mL含Amp的LB培养基中，于37℃，230r/min的恒温振荡器过夜培养。待培养16~20h所培养的菌株达到乳白色的浑浊度后进行保菌，并采用Axyprep质粒DNA小剂量提取试剂盒进行质粒提取。完成质粒提取后，采用核酸电泳法测定所提取质粒的浓度（取1µL质粒进行电泳，同时采用标准用量的DNAMarker进行比对，粗略估算目标DNA的量）。在1.5mLEP管上标注“质粒名称+浓度+日期+任务”，送往nano公司核酸微量定量仪进行序列测定，。（2）G1-Chi-73-VP7基因的酶切将所制备的质粒pMD19T-G1Rov-Chi-73-VP7按照表1中的反应体系进行加样于1.5mLEP管中。表1酶切反应体系Table1Systemofenzymedigestion组分体积/μL质粒DNA10XhoⅠ1BamHⅠ110×BufferddH2O533总体系50轻弹EP管底6-8次，将反应物混均匀，并于低速离心机中3000g瞬时离心，然后将EP管置于酶切仪中37℃酶切1h。（3）G1-Chi-73-VP7基因的纯化制备新鲜的琼脂糖凝胶50×电泳液和0.8%的琼脂糖凝胶备用，所有的制胶板、电泳槽、梳子（用宽孔）全部清洗干净；将50×电泳液稀释成1×倒入电泳槽中，待琼脂糖凝胶凝固，将制胶板置于电泳槽中，每块胶的第一个孔点用移液枪点上5μL分子量为5000的Marker，每25μL酶切液中加入5μLBuffer，用移液枪混匀，点入琼脂糖凝胶其余孔内，开始电泳。采用琼脂糖凝胶电泳将目的条带分离后，将目的基因G1-Chi-73-VP7的条带切下，分别放入1.5mLEP管中，采用Axygen凝胶回收试剂盒和AxygenPCR清洁试剂盒纯化回收pMD19T-G1Rov-Chi-73-VP7中的G1-Chi-73-VP7基因。得到目的基因后，通过核酸电泳电泳测定其浓度（基因的浓度在100ng/μL以上）。2.2.3G1-Chi-73-VP7基因原核表达载体的构建与鉴定（1）目的基因与载体的连接往灭菌过的1.5mLEP管中加入4μLG1-Chi-73-VP7基因、1μL载体pET28a，最后加入5μL连接液SolutionI，用移液枪混匀，瞬时离心，置于连接仪中16℃，过夜（16h）。（2）目的基因转化从-80℃冰箱中取100μL感受态细胞BL21(DE3)，手握住迅速解冻，至管中还有小部分呈冰晶状态时，立即置冰上。将100μL感受态细胞分装成两管，50μL/管，本次使用50μL；在超净台中，向50μL感受态细胞BL21(DE3)中加入过夜的连接液10μL（或质粒DNA），用灭菌枪头轻柔地将其混匀，冰上放置30min。（提前开启水浴锅预热到42℃）；将样品管迅速放置到提前预热到42℃水浴锅中热击90秒后，迅速将其放于冰上5-10min；在超净台中，向管中加入800μL的液体LB培养基（无任何抗生素）；将其放置到230r/min的摇床中，37℃培养1.5h，使重组表达菌株恢复到正常生长状态；将上述菌液10000r/min离心1min，超净台中，弃掉上清700μL，剩余的160μL将管底菌体吹均匀，分成两份分别涂布于含Kana的筛选平板上（其中一块板加40μL，另外一块加115μL），正面（盖子面）向上，于放置37℃静置0.5h；等到培养基完全将菌液吸收后，将培养皿倒置，并置于37℃的培养箱中静置培养16～20h；次日观察菌落、挑取单菌落进行鉴定。（3）阳性克隆的筛选与鉴定往4mL/管规格的灭菌LB培养基中，按照4µL/管的量加入Kana；在生长有BL21(DE3)-pET28a-G1-Chi-73-VP7重组菌菌落的培养皿上分别用mark笔圈出要挑取的菌落4个；用灭菌枪头轻轻挑取1个菌落（注意不要戳到琼脂），将枪头直接放入其中一个装有LB培养液（Kana抗性）试管中；按照上个步骤将其他3个菌落分别接种到其他3个装有LB培养液（Kana抗性）试管中；用火焰上灭菌的镊子夹取橡胶塞，盖上上述4个试管，每个管子上面编号1-4号，并标记BL21(DE3)-pET28a-G1-Chi-73-VP7；将上述接种好的培养管，以45°～60°斜角放置在37℃摇床中，230r/min，培养16～20h。待培养16~20h所培养的菌株达到乳白色的浑浊度后进行保菌，并采用Axyprep质粒DNA小剂量提取试剂盒进行质粒提取，将制备的质粒BL21(DE3)-pET28a-G1-Chi-73-VP7按照表2中的反应体系进行加样于1.5mLEP管中。表2酶切反应体系Table2Generalsystemofenzymedigestion组分体积/μL质粒DNA7.0XhoⅠ0.25BamHⅠ0.2510×Buffer2.0ddH2O10.5总体系20.0轻弹EP管底6-8次，将反应物混均匀，并于低速离心机中3000g瞬时离心，然后将EP管置于酶切仪中37℃酶切20min。取10μL酶切产物与提取的质粒BL21(DE)3-pET28a-G1-Chi-73-VP7一起进行核酸电泳，根据分子量大小检测重组载体是否为阳性载体，对应的菌种是否为阳性菌株。2.2.4重组G1-Chi-73-VP7蛋白的诱导表达与SDS检测（1）首次活化分别吸取重组蛋白表达菌株菌液重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-G1-Chi-73-VP7、BL21(DE3)-pET28a各4μL分别接种于4mL(1:1000)含有Kanar（终浓度为200µg/mL）的液体LB培养基中，分别在管壁做好标记，于37℃，摇床中230r/min振荡培养16～18h。（2）二次活化次日，按照1:5的接种比例接种，分别将上述菌液400μL菌液分别接种于两管2mL含Kana（终浓度为200µg/mL）的液体LB培养基中，于37℃，230r/min的摇床中振荡培养2.5h；（3）IPTG诱导向其中一半试管中（BL21(DE3)-pET28a-G1-Chi-73-VP7共4管，空载体BL21(DE3)-pET28a一管）加入终浓度为1mmol/L的IPTG(1:100)，剩余的试管中（BL21(DE3)-pET28a-G1-Chi-73-VP7共4管,对照BL21(DE3)-pET28a一管）不加诱导剂IPTG作为对照组。于37℃，摇床中230r/min诱导4h。（4）SDS检测将1mL诱导好的菌液加入到一个1.5mLEP管中，将EP管置于高速离心机中，12000r/min离心1min，弃掉上清后，再向该EP管加入1mL菌液，12000r/min离心1min，弃掉上清，如此重复，将一个试管中的菌液浓缩到一个1.5mLEP管中，做好标记；向EP管中加入蛋白抽提液，用移液枪吹匀，12000r/min离心1min，吸取上清，保存。按照说明书用蛋白抽提液提取蛋白，14000r/min离心10min，用移液枪将上清蛋白液转移到一个新的1.5mLEP管中，分别标记为“BL21(DE3)-pET28a-G1-Chi-73-VP7-S”“BL21(DE3)-pET28a-S”，-80℃保存备用；管底沉淀即为包涵体蛋白（IB），每管用100μL的PBS悬起，标记为“BL21(DE3)-pET28a-G1-Chi-73-VP7-IB”“BL21(DE3)-pET28a-IB”，-80℃保存备用。取上清蛋白液、包涵体蛋白液各20µL，分别加入20µL5×LoadingBuffer(加了B-巯基乙醇)沸水中煮10min，取10µL蛋白样用于蛋白电泳，检测是否含有目的蛋白。2.2.5重组G1-Chi-73-VP7蛋白的诱导表达与Westernblot鉴定（1）转膜蛋白样品经SDS电泳后，剪裁下目的条带附近的蛋白胶，再剪下略大于蛋白胶的PVDF膜，15V电压转膜20min左右，下将蛋白条带转印到PVDF膜上。（2）封闭新配置2%脱脂奶粉-PBS与封闭盒中，脱脂奶粉-PBS覆盖整张膜，于4℃环境中封闭过夜。（3）洗膜完成封闭后，将脱脂奶粉-PBS倒掉，加入PBST后将封闭盒置于摇床，45-57r/min，5min，洗涤3次。（4）一抗反应将Anti-GSTmAb（武汉三鹰，货号：66005-1-1g）加到2%脱脂奶粉-PBS中以1:3000稀释，总体积以覆盖整张膜为宜，置于摇床中54r/min，37℃，1h。（5）洗膜倒掉加了Anti-GSTmAb（武汉三鹰，货号：66005-1-1g）的2%脱脂奶粉-PBS，加入PBST置于摇床上，45r/min，洗涤3次，5min/次。（6）二抗反应将Goat-Anti-mousepAb（武汉三鹰，货号：SA00001-1）加到用2%脱脂奶粉-PBS中以1:3000稀释，总体积覆盖整张膜为宜，置于摇床中54r/min，37℃；1h后倒掉加了Goat-Anti-mousepAb（武汉三鹰，货号：SA00001-1）的2%脱脂奶粉-PBS，置于摇床上54r/min，用PBST洗涤3次，5min/次；最后一次不用立即倒掉PBST溶液，先配好显色液。（7）显色根据说明书进行配制显色液1mL；倒掉PBST溶液，用枪吸显色液往膜上轻轻吹，反复操作，直到目的条带显色，用自来水冲洗终止反应。2.2.6包涵体蛋白的大量诱导表达、纯化与鉴定（1）收集浓缩菌体将重组蛋白表达菌株菌液取20μL加入到20mL含有终浓度为100μg/mL的Kana的新鲜LB培养基中，同时分别取5μL菌液加入含5mLLB的试管中（含有终浓度为100µg/mL的Kana），于37℃，230r/min的摇床中过夜培养（16-18h）。次日，将20mL首次活化菌液加入到含有终浓度为100µg/mL的Kana80mLLB培养基中，继续置于摇床中37℃，230r/min培养4h。4h后，往锥形瓶中加入100μLIPTG（终浓度为1mmoL/L），并将锥形瓶置于37℃，230r/min的摇床诱导培养6h。试管内菌液不诱导。离心法收集每只锥形瓶中的菌体，每100mL菌液浓缩于1个50mL的离心管中，离心参数：8000r/min，4℃离心5min。每管分别加入20mL的PBS，漩涡振荡1min（或者用移液枪吹打悬浮菌体），使菌体悬起，之后将其于高速离心机中8000r/min离心10min，弃上清。（2）蛋白纯度检测往离心管中分别加入20mL的PBS，将菌体漩涡振荡1min，悬起，分别进行冰上超声，30min，每管合计1h；将超声裂解产物4℃，10000r/min离心15min，分离上清，装一个新管中标好。将第一次超声后的沉淀，用15mLPBS将菌体悬起，漩涡振荡1min，进行冰上超声，每距离5s超声5s，合计30min。将第二次超声裂解产物4℃，10000r/min离心15min，分装上清装新管，，沉淀即为要收集的包涵体蛋白。采用15mL包涵体溶解液将上述包涵体蛋白溶解，进行冰上超声，每距离5s超声5s，合计30min，以完全溶解至液体清亮为宜。置于-80℃冰箱中保存。取20μL蛋白样品，分别加20μL10×LoadingBuffer，沸水煮10min，取10μL样品进行SDS分析。3结果3.1目的基因G1-Chi-73-VP7的浓度检测3.1.1质粒pMD19T-G1Rov-Chi-73-VP7的酶切鉴定质粒pMD19T-G1Rov-Chi-73-VP7经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在分子量大小为2700bp和1011bp处有清晰的条带且没有杂带（图2）。表明目的基因G1-Chi-73-VP7已经被完全切开，可以进行后续切胶回收操作。图2质粒pMD19T-G1Rov-Chi-73-VP7的酶切鉴定M.DL5000Marker;1.pMD19T-G1Rov-Chi-73-VP7质粒的酶切产物Figure2IdentificationofplasmidpMD19T-G1Rov-Chi-73-VP7byenzymedigestionM.DL5000Marker;1.ThedigestedproductofpMD19T-G1Rov-Chi-73-VP7plasmid3.1.2目的基因的浓度鉴定图2中胶块经Axygen凝胶回收试剂盒和AxygenPCR清洁试剂盒纯化回收得到目的基因G1-Chi-73-VP7，将1μL目的基因混合5μLBuffer，经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，在分子量大小为1011bp处有清晰较亮的条带且没有杂带（图3）。表明目的基因G1-Chi-73-VP7的浓度在100ng/μL以上，可继续将目的基因与载体pET28a连接，构建重组表达菌株。图3目的基因G1-Chi-73-VP7的浓度鉴定M.DL5000Marker;1.目的基因G1-Chi-73-VP7Figure3IdentificationofconcentrationofG1-Chi-73-VP7targetgenesM.DL5000Marker;1.G1-Chi-73-VP7targetgenes3.2重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7的酶切鉴定对得到的的重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7进行质粒提取，将提取的质粒使用BamHI和XhoI将目的基因G1-VP7与载体pET28a切开，酶切产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，在分子量大小分别为4900bp和1011bp处有清晰的条带且没有杂带（图4）。表明目的基因G1-Chi-73-VP7和载体pET28a连接成功，挑取的菌株为目的重组菌株。图4重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7的酶切鉴定M.DL5000Marker;1.质粒pET28a-G1-Chi-73-VP72.质粒pET28a-G1-Chi-73-VP7的酶切产物Figure4IdentificationofrecombinantexpressionstrainBL21(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7byenzymedigestionM.DL5000Marker;1.G1-Chi-73-VP7plasmid;2.ThedigestedproductofpET28a-G1-Chi-73-VP7plasmid3.3重组G1-Chi-73-VP7蛋白的SDS检测重组菌株BL21(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7以及空载体BL21(DE3)-pET28a经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导4h后，收集浓缩菌体，提取蛋白并进行SDS检测。由图5可以看出，与空载体和未经诱导的对照组对比，在分子量大小为38kDa左右的未见清晰的蛋白条带，故该蛋白在上清与包涵体中均未表达或表达量极低。图5重组G1-Chi-73-VP7蛋白的SDS检测M.蛋白Marker;1.经诱导BL21(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白上清;2.未经诱导的BL21(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白上清;3.经诱导的BL21(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体包涵体;4.未经诱导的BL21(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白包涵体;5.经诱导的BL21(DE3)-pET28a菌体蛋白上清;6.未经诱导的BL21(DE3)-pET28a菌体蛋白上清7.经诱导的BL21(DE3)-pET28a菌体蛋白包涵体;8.未经诱导的BL21(DE3)-pET28a菌体蛋白包涵体Figure5IdentificationofrecombinantG1-Chi-73-VP7proteinbySDSM.ProteinMarker;1.InducedBL21(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7bacterialproteinsupernatant;2.UninducedBL21(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7bacterialproteinsupernatant;3.InducedBL21(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7.bacterialproteininclusionbody;4.UninducedBL21(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7.bacterialproteininclusionbody;5.InducedBL21(DE3)-pET28abacterialproteinsupernatant;6.UninducibleBL21(DE3)-pET28abacterialproteinsupernatant;7.InducedBL21(DE3)-pET28abacterialproteininclusionbody;8.UninducedBL21(DE3)-pET28abacterialproteininclusionbody3.4重组表达菌株Transetta(DE3)-pET28a-G1-VP7的酶切鉴定由于对重组表达菌株BL21(DE)3-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7多次诱导后提取蛋白，进行SDS检测，仍未发现目的蛋白表达，可能因为选用的感受态细胞或载体不适合目的蛋白的表达，故将质粒pET28a-G1-Chi-73-VP7重新导入新的感受态细胞Transeta(DE3)，得到的重组表达菌株Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7。对重组表达菌株Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7进行质粒提取，将提取的质粒使用BamHI和XhoI进行双酶切，酶切产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，在分子量大小分别为4900bp和1011bp处有清晰的条带且没有杂带（图6）。表明挑取的菌株为目的重组菌株，可以继续诱导其表达、提取蛋白并进行鉴定。图6重组表达菌株Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7的酶切鉴定M.DL5000Marker;1.质粒pET28a-G1-Chi-73-VP72.质粒pET28a-G1-Chi-73-VP7的酶切产物Figure5IdentificationofrecombinantexpressionstrainTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7byenzymedigestionM.DL5000Marker;1.G1-Chi-73-VP7plasmid;2.ThedigestedproductofpET28a-G1-Chi-73-VP7plasmid3.5重组G1-Chi-73-VP7蛋白的SDS检测重组菌株BL21(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7经终浓度为1mmol/L和0.5mmol/L的IPTG诱导4h后，收集、浓缩菌体，提取蛋白并进行SDS检测（图7）。与未经诱导的对照组对比，在第4泳带38kDa附近有疑似目的条带，目的蛋白可能表达，需进一步进行WesternBlot鉴定。图7重组G1-Chi-73-VP7蛋白的SDS检测M.蛋白Marker;1.经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白包涵体;2.经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白上清;3.经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白LB;4.经终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白包涵体;5.经终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白上清;6.经终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白LB;7.未经诱导的Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白包涵体;8.未经诱导的Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白上清Figure7IdentificationofrecombinantG1-Chi-73-VP7proteinbySDSM.ProteinMarker;1.InducedbyIPTGwithafinalconcentrationof1mmol/LTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7bacterialproteininclusionbody;2.InducedbyIPTGwithafinalconcentrationof1mmol/LTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7bacterialproteinsupernatant;3.InducedbyIPTGwithafinalconcentrationof1mmol/LTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7bacterialproteinLB;4.InducedbyIPTGwithafinalconcentrationof0.5mmol/LTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7bacterialproteininclusionbody;5.InducedbyIPTGwithafinalconcentrationof0.5mmol/LTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7bacterialproteinsupernatant;6.InducedbyIPTGwithafinalconcentrationof0.5mmol/LTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7bacterialproteinLB;7.UninducedTranseta(DE3)-pET28abacterialproteininclusionbody;8.UninducedTranseta(DE3)-pET28abacterialproteinsupernatant3.6重组G1-Chi-73-VP7蛋白的WesternBlot鉴定重组菌株Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7经不同终浓度的IPTG诱导后，进行Western-Blot检测。图8显示，PVDF膜上没有目的条带，说明目的蛋白未表达或表达量过低。可继续诱导100mL重组表达菌株Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7大量表达并鉴定。图8重组G1-Chi-73-VP7蛋白的WesternBlot检测M.蛋白Marker;1.经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白包涵体;2.经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白上清;3.经终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白包涵体;4.经终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白上清Figure8IdentificationofrecombinantG1-Chi-73-VP7proteinbyWesternBlotM.ProteinMarker;1.InducedbyIPTGwithafinalconcentrationof1mmol/LTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7bacterialproteininclusionbody;2.InducedbyIPTGwithafinalconcentrationof1mmol/LTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7bacterialproteinsupernatant;3.InducedbyIPTGwithafinalconcentrationof0.5mmol/LTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7bacterialproteininclusionbody;4.InducedbyIPTGwithafinalconcentrationof0.5mmol/LTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7bacterialproteinsupernatant3.7G1-Chi-73-VP7包涵体蛋白的鉴定将活化后的100mL重组菌株Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7经IPTG诱导后，收集浓缩菌体，用20mLPBS悬起菌体后进行超声破碎，收集一超上清蛋白、二超上清蛋白和包涵体蛋白，并进行SDS检测（图9）。和未经诱导的对照组对比，在分子量大小为38kDa左右的未见清晰的蛋白条带，故目的蛋白G1-VP7在上清与包涵体中均未表达。图9重组G1-Chi-73-VP7蛋白的SDS检测M.蛋白Marker;1.诱导的Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体第一次超声破碎后的上清蛋白;2.诱导的Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体第二次超声破碎后的上清蛋白;3.未诱导Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体的上清蛋白;4.诱导Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白包涵体;5.未诱导Transeta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7菌体蛋白包涵体Figure9IdentificationofrecombinantG1-Chi-73-VP7proteinbySDSM.ProteinMarker;1.InducedTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7cellsupernatantproteinafterfirstultrasoniccrushing;2.InducedTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7cellsupernatantproteinaftersecondultrasoniccrushing;3.UninducedTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7cellsupernatantprotein;4.InducedTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7bacterialproteininclusionbody;5.UninducedTranseta(DE3)-pET28a-G1Rov-Chi-73-VP7bacterialproteininclusionbody4讨论RV感染性腹泻是由RV引起的五岁以下幼儿及幼龄动物中常见的消化系统疾病，以呕吐、腹泻、发热等为主要临床表现，发病率、死亡率高为特点[34]。RV给人类的生命健康和养殖业造成了较大的影响。预防RV感染最有效的方法是研制安全、高效的RV疫苗。本研究通过构建大肠杆菌表达载体、以轮状病毒G1-Chi-73编码的VP7为基础探索其表达条件，将为研制有效的轮状病毒疫苗与抗体制剂提供有益的素材。本研究旨在以合成的pMD19T-G1Rov-Chi-73-VP7质粒为材料，利用基因工程技术探索G1-Chi-73-VP