PCR技术发展历程综述

PCR技术发展历程综述

摘要：PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶

催化下。以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点。通过变性、退火、延伸

等步骤，体外复制出与母桂模板DNA互补的子链DNA的过程。本文简要叙述

了PCR技术的发展历程及现在所发展起来的相关技术。

关键词：PCR技术变性退火延伸

1.PCR技术的发展简史

1971年Khorana等最早提出PCR理论：“DNA变性解链后与相应引物杂交，

用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA基因”。因当时基因序列分

析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核仃酸引物合成仍处于手

工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Sm此等已发现了DNA

限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana等的早期设想被忽视。1985

年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶工Klenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基

因成功，1985年10月25日申请了PCR的专利,1987年7月28日批准(专利

号4,683,202),Mullis是第一发明人；1985年12月20日在Science杂志上发

表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者。

但当时Mullis所使用的大肠杆菌聚合酶1的片段Klenow存在一些缺陷：

Klenow酶不耐热，在对DNA模板进行热变性时，会导致此酶的钝化，因此需要

每完成一个扩增周期增加一次酶。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进

行PCR,提高扩增DNA片段的均性，1988年Saiki等从温泉中分离的种水

生嗜热杆菌中提取到一种耐热DNA聚合酶，使扩增反应的特异性和效率大大提

高，并简化了操作程序，最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应

用和普及。现已被广泛应用于农学、植物病理学、生物学等领域的研究。最初的

PCR技术相当不成熟，但在随后的几十年里，PCR技术被不断改进，它从一种定

性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增

长达几十个kb的DNA片断。短短几十年，该技术已经成为最常用也最重要的

份子牛.物学技术之一，其应用范围从基本的基因扩增，扩展到基因克隆、基因改

造、传染病源分析、遗传指纹鉴定等，甚至扩展到许多非生物领域。

2.PCR技术的原理

PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列，人工合成与该DNA2条

链末端互补的2段寡核背酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作

用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3

个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94c的

条件下变性解链；第2步是退火，即人工合成的2个寡核甘酸引物与模板

DNA链3,端经降温至55C退火；第3步是延伸，即在4种dNTP底物同

时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5,3方向延伸

与模板互补的新链。经过这个循环后，合成为了新链，可将其作为DNA模板

继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，普

通单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增I00万~200万倍。PCR反

应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的

长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免

假阴性或者假阳性等情况的产生。

3.PCR技术进步关键

3.1热循环仪

市场上有众多的产品，在质量和技术上首推PE及MJreasearch。总的发展

趋势是1)无油操作，要求的反应体积小，PE2400可做小至5uL的反应;2)

升降温速度快，PE9700可达到35C/s,温控精度及静态样品温度均衡性高，

这一点是通过控制反应管内的温度，而非加热块的温度来实现的；3)界面友好,

操作灵便，显示直观，允许多用户。此外，还有几种特殊用途的PCR仪：大容

量PCR仪,TheTetrad(MJResearch)可同时做1536个反应，适合于高通量实

验室的要求；实时定量PCR,ABIPRISMTM5700(PE)能对PCR过程做到实时

定量监控，闭管操作，无污染，无须扩增后处理.；梯度PCR仪，例如，

Eppendorf的产品，可在一个反应槽内，一次实验之中快速地测定最佳变性温

度和退火温度，节省时间，减轻实验强度;PCR仪的加热部份和控制部份分离，

RemoteAlphaDockTMSystem(RADMJResearch)的这两部份可以分开远达3m

节省实验室空间，便于进行自动化操作。同时有多种形式的加热部份可供选择，

可以满足不同的要求。

3.2引物设计与合成

引物的设计可通过计算机和网络来实现。网上有许多提供免费在线引物设计

服务的网址和软件，例如在线版的Primer3.0,以及Primer5.0等软件，设计好的

引物则彻底由专业公司来合成，合成的引物普通进行PAGE纯化，而且可以根

据实验的要求对引物采取不同的修饰处理。

3.3DNA聚合酶系

已经发展出了多种具有各种不同特性的聚合酶和酹反应体系(表1)。结合

优化的缓冲液条件,DNA聚合酶已具有更高的特异性，敏感性，可以扩增出更长

的产物，并且可成功地用于富含GC的模板的扩增。目前已开辟出了一系列可满

足不同需求的DNA聚合酶试剂盒，简化了PCR操作，提高了实验的重现性。

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4.PCR相关技术

4.1常规RT-PCR技术

由于目前常利用cDNA来研究基因的功能，而cDNA是由mRNA反转录而

成。所以采用反转录-聚合酶链反应(reverseIranscripliun-polynierasechainreauliun,

RT-PCR)可扩增大量cDNA。主要包括两个步骤,一个是反转录，另一个就是PCR,

首先提取RNA并纯化,以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或者随机引物利

用逆转录酶反转录成cDNA第一链。然后以第一链cDNA为模板进行PCR扩增，

而获得目的基因或者检测基因表达。

反应过程的第一步是从细胞中提RNA,并分离出mRNA。第二步以mRNA

为模板，在反转录酶的催化下合成cDNA。第三步以cDNA为模板，用PCR对靶序

列进行扩增。最后用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。该技术主要用于分析

基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

42多重PCR(mutiplexPCR)技术

量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、份了生物学和其他基础研究领域。

实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，

实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃。

荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，

借助于荧光信号，积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板

进行定量分析。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增

反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件

下才干进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进

程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断。一个PCR循环反应结束之后，定

量PCR仪可以采集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量

的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线。荧光信号在指数扩增阶段，

PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定

量分析。

此外还有多种PCR相关的技术，如不对称PCRMSP甲基化特异PCR,免疫

PCR,锚定PCR,PACE-cDNA末端的快速扩增……可根据研究目的不同作相应的

选择。

5展望

PCR作为一项“革命性的技术”，不仅推动了遗传与份子生物学的发展.而且，

在其它领域科学家的努力与创新下。其不断与该领域的核心技术相结合，极大地

推动了此领域的发展。传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以

来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧

光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生

物、非致病微生物及环微生物检测中具有重要作用；未来的研究主要集中在去除

食品抑制因上干扰、改进样品前处理技术等方面，总之，随着科学技术的不断进

步.PCR技术势必得到新的发展，以之为基础的新技术将不断浮现。

参考文献

1.曹雪燕，张晓东，等.聚合酶链式反应（PCR）研究新发展.自然科学进

展.2022.17(5).

2.陶生策，张治平，张先恩.PCR技术研究发展.生物工程发展.2001.21(4)

3.黄留玉.PCR最新技术原理、方法及应用［M］.北京：化学工业出版社.2005.

4.孟祥文，李璞.AP-PCR技术及其应用目.国外医学遗传学分册.1995.18(3)：

117-120.

5.陈尚武.不同种类的PCR技术及其应用［J］.贵阳医学院校报.1993.14(3)：113-116

6.金宇良.PCR技术的研究发展.现代农业科技.2022.10

7.常世敏.PCR在食品微生物检测中的应用［J］.邯郸农业高等专科学校学报，

2004,21(4)：23-25.

8.叶倩.PCR技术综述.科技创新导报.2022.5

9.唐永凯，俞菊华，徐跑，等.实时荧光定量PCR技术及其在水产上的应用［J］.

中国农学通报，2022(21)：422-426.

10.吴学贵.LPS刺激点带有斑鱼免疫相关基因的克隆与组织表达差异性分析［D］.

海口：海南大学，2022.

11.侯立华，黄新，朱水芳，等.双色荧光多重PCR技术及在禽流感病毒检测中

的应用［5.生物技术通报，2022(1)：168-172.

12.张杰道.生物化学实验技术PCR技术及应用［M］.北京：科学出版社，2005：

12-18

13.邵军军.常惠芸，谢庆阁.原位PCR技术及其应用［J］.中国兽医科学与技

术.2003.33(6)：32-35.

14.谢辉.章伟文.陈宏。等.原位反转录PCR技术及其应用的研究发展［J］.医

学理论与实践，2003o16(4)：402—403.

15.彭年才.牵明.苗宝刖.用于食品微生物快速检测的实时定量PCR仪及ATP

仪的研制和应用.20I0年第三届国际食品安全高峰论坛磴立集.2022：20-22.

16.赵敏.多基因PCR及其应用［J］.国外医学流行病学传染宿学分册.1995.22(6)：

270-272.

17.高玉龙.焦芳婵.徐照丽.等.多重PCR在烟草转基因检测中的应用［J］.生

物技术通报，2022.(2)；140-142.

18.李竹红，刘德培.梁植权.改进的反向PCR技术克隆转移基因的旁侧序列