1260-II高效液相色谱仪性能确认

1260-II高效液相色谱仪性能确认目录中文摘要1英文摘要2前言41材料51.1物料51.2仪器51.3试剂52方法步骤52.1系统适用性确认52.2重复性确认62.3线性与范围72.4进样残留72.5性能确认范围73结果73.1系统适用性确认73.2重复性确认83.3线性与范围113.4进样残留124讨论125结论13参考文献14致谢15中文摘要目的：高效液相色谱仪新购进之后，完成安装确认和运行确认，在正常的使用条件下，采用选定的标样进行性能确认试验，以证明仪器运行的可靠性、主要运行参数的稳定性以及结果的重复性，并能达到可接受的标准，确保仪器的正常使用。方法：应用高效液相色谱原理，以甲醇为空白溶液，使用外标法，以每1ml含大黄素160μg、大黄素甲醚80μg的对照品储备液为原溶液，加入甲醇稀释制成不同浓度的标准样品，再分别精密吸取不同浓度标样注入液相色谱仪，然后测定，把峰面积和保留时间记录下来[1,2]。再以重复性确认的各个标样浓度为纵坐标，以峰面积为横坐标来绘制标准曲线得到线性方程[1,2]。对高效液相色谱仪进行的系统适用性，重复性，线性与范围和空白残留进行验证。结果：大黄素和大黄素甲醚标样的理论塔板数以大黄素峰面积计算大于3000，分离度大于1.5[3]；5个不同浓度的标样连续进样5针，数据显示每个对照品峰面积的RSD值小于2.0%，保留时间的RSD值小于1.0%，进样残留为0[3]；大黄素的线性方程相关系数r是0.9999，大黄素甲醚的线性方程相关系数r是1[3]。结论：经验证，新购进的高效液相色谱仪各项性能良好，进样后得到的各项指标均符合标准，可用于实验室进行质量检测。关键词：液相色谱仪；性能确认；大黄素；大黄素甲醚ABSTRACTObjective:Forthenewlypurchasedhighperformanceliquidchromatography,aftercompletionofinstallationandoperationconfirmation.Underthenormalconditionsofuse,adoptselected

standard

sampleforperformance

validationtesttoprovethe

reliability

ofinstrumentoperation、thestabilityofmainoperatingparametersaswellastherepeatability

ofresults.Inthemeantime,achievingacceptable

standardstoensureproperuseofinstrument.Method:Methanol

solutionwasusedasa

blank

solution,usingreferencestocksolution(160μgemodin、80μgphyscionper1ml)astheoriginalsolution,dilutetheoriginalsolutionwithmethanol,makingstandardsamplesofvariousconcentrationfromreferencestocksolutionandthenabsorb10microliterseachstandardsamplesofdifferentconcentrationspreciselyandinjectintothehighperformanceliquid

chromatographyinturn,measure,recordpeakareaandretentiontime,measure,recordpeakareaandretentiontime.Inaddition,repeatabilityverificationconcentrationsofeachstandardsampleasY-axis,peakareaasX-axis.The

linear

rangewasthenplottedtogeneratea

linear

equationtoverifythesystem

suitabilityverification,repeatabilityverification,linearityand

rangeandsampleresidueofthehighperformanceliquid

chromatographybyperformanceliquid

chromatography.Results:Thestandardsampleofemodinandphyscion’stheoretical

platesnumberisgreaterthan3000,accordingtoemodin’scalculatingpeakarea,degree

of

separationisgreaterthan1.5;5standardsampleswithdifferentconcentrationsareinjectedfor5consecutivetimes,RSDvaluesforpeakareaandretentiontimeofeachreferencesubstancearelessthan2.0%andlessthan1.0%respectively,sampleresidueis0.Thelinearequationcorrelationcoefficientofmodinis0.9999,physcion’s1.Conclusion:Aftervalidation,

newly-arrivedhighliquid

chromatographyshowed

good

performances,alltheindexesobtainedaftersamplingareinconformitywiththestandardandcanbeusedforqualitytestinginlaboratory.Keywords:High-performanceliquid

chromatography;Performance

validation;Emodin;Physcion.1260-II高效液相色谱仪性能确认实验室的运行对于一个医药企业的运行有至关重要的作用，不管是在药品的研发、生产还是销售过程都必不可少，关于药品原材料的质量检测，生产过程出现的质量问题，或者研发用药物的分析研究，药品相关项目的定性定量分析，药品成品的检测都需要实验室的实验数据，为企业生产过程中的质量把控提供证据保障。为了获取数据来确保产品适合其预定用途，制药工业应用了各式各样的分析仪器，持续地获得适合其意图的可靠和有效的数据就是分析员的目标[4]。实验结果的准确性取决于具体的应用，使用者验证其方法、校准其仪器，并进行额外的仪器检查，以便帮助确保所获得的数据是可靠的[4]。一直以来，实验室对高精密仪器购进都十分慎重，其性能的好坏决定它的使用价值。其中高效液相色谱仪作为物质检测与含量测定的通用仪器，在分析中，使用已确认的仪器有助于提高对生成数据有效性的信任度，因而对新购进的仪器的系统适应性、重复性、线性与范围和进样残留进行性能的确认[5]，各项指标都达到可接受标准的要求，才能确保仪器的正常使用。高效液相色谱仪(HPLC)是一种应用高效液相色谱的原理的实验分析仪器，由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪组成，主要用于分析受热不稳定的、高沸点且不易挥发的和分子量大的有机化合物[6]。其工作内容如下图：图1中药大黄为蓼科植物虎杖的干燥根茎和根[2,7]，有解毒、清湿热、泻火、祛瘀、凉血、攻积滞之效[7]芦荟大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚为大黄中主要的游离型蒽醌类[7,8,9]。作为大黄中主要的游离性蒽醌类[7,8,9]，大黄素和大黄素甲醚在结晶形态及有机溶剂的溶解度上各有差别。大黄素为橙黄色长针状结晶，而大黄素甲醚则为金黄色针状结晶[10]。在丙酮和甲醇溶液中，大黄素分别呈现为橙色和黄色结晶，而大黄素甲醚不溶于这两种溶液。大黄素几乎不溶于水，但大黄素甲醚有少量可溶在水中并在强酸条件下发生水解。最后，大黄素可在乙醇及碱溶液中溶解，大黄素甲醚则可在苯和氯仿中溶解。公司生产的精肝颗粒产品的主要组成成分中有大黄，药品生产过程中大黄的含量测定是药品质量检测中的评定标准之一，其中就包括检测大黄素的含量，以大黄素作为对照较具代表性；中国药典中大黄的含量测定需要测定总蒽醌和游离蒽醌，应用大黄素及大黄素甲醚作为标准样品进行高效液相色谱仪性能确认试验，标准品中既包含了含量测定中所需的两种主要成分，在避免多种物质同时检测简化操作的同时满足了仪器性能分析的需要，也节约了化学品的消耗，节省公司资源。实验数据结果表明，运用大黄素与大黄素甲醚混合标准溶液检测高效液相色谱的性能得出的数据重现性好，准确度高；实验过程中没有太多的干扰因素，偏差较小，线性与范围符合要求。1材料1.1物料对照品大黄素（购自中国食品药品检定研究院），标示含量：98.7%，批号：110756-201512，内部编号：1804008；对照品大黄素甲醚（购自中国食品药品检定研究院），标示含量：99.0%，批号：110758-201616，内部编号：1607007。1.2仪器高效液相色谱仪（型号：安捷伦1260-II）校准有效期至2021年07月09日电子天平（型号：MS205DN）校准有效期至2020年06月14日色谱柱（产自安捷伦）1.3试剂色谱级甲醇、色谱级盐酸、8%盐酸、2.5mol/L硫酸、0.1%磷酸（分析纯）[1,2,8,9]2方法步骤2.1系统适用性确认2.1.1色谱条件色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，4.6mm*150，5μm[1,2,5,7]；以甲醇：0.1%磷酸（80:20）为流动相[9]；检测波长为254nm[1,2,5,7]。2.1.2空白溶液以甲醇作为空白溶液。2.1.3标样制备量取标样5（每1ml含有大黄素160ug、大黄素甲醚80μg的对照品储备液）5ml置于10ml的容量瓶中，加入甲醇稀释到刻度，振摇均匀，即得标样3（每1ml含有大黄素80μg，大黄素甲醚40μg的混合溶液）[9]。2.1.4测试方法依次精密吸取空白溶液、标样3、空白溶液各10μl，注射进入液相色谱仪。在序列的开始和结束各进1针空白溶液，标样连续进样5针，记录峰面积和保留时间[2,8,9]。2.2重复性确认2.2.1色谱条件色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，5μm*150，4.6mm[1,2,5,7]；以甲醇：0.1%磷酸（80:20）为流动相[9]；检测波长为254nm[1,2,5,7]。2.2.2空白溶液以甲醇为空白溶液。2.2.3标样制备精密称定大黄素对照品8mg、大黄素甲醚对照品4mg放置于50ml的容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释到刻度，振摇均匀，即得标样5（每1ml含有大黄素160μg、大黄素甲醚80μg的对照品储备液）。按照下面“表1”的内容配制不同浓度的标样，即得标样1、2、3、4。表1不同浓度的标样储备液浓度精密量取(ml)稀释到(ml)终浓度200%52050%2580%510100%1520150%备注：储备液配制见对照品溶液配制记录，批号：20190620-022.2.4测试方法分别精密吸取上述各浓度对照品溶液标样，注射进入液相色谱仪，经过测定，记录峰面积和保留时间[2,11]。2.3线性与范围2.3.1测试方法以重复性确认中的各标样的浓度为纵坐标，峰面积为横坐标绘制标准曲线得出线性方程[2,11]。2.4进样残留2.4.1测试方法于空白进样后，记录峰面积。2.5性能确认范围本次性能确认参照《液相色谱检定规程》JJG705-2014及USP(1058)相关要求进行，确认项目见表2。表2确认项目确认项目可接受标准系统适用性标样中大黄素与大黄素甲醚标样的理论塔板数按大黄素峰面积计不得低于3000。标样中大黄素与大黄素甲醚峰分离度应不小于1.5。标样连续进样5针，测得每个对照品峰面积的RSD值不得过2.0%，保留时间的RSD值不得过1.0%。重复性5个不同浓度的标样连续进样5针，测得每个标样中各对照品峰面积的RSD值不得过2.0%，保留时间的RSD值不得过1.0%。线性与范围5个不同浓度的标样浓度与峰面积的线性方程的相关系数r不得小于0.999。进样残留不大于0.2%。3结果3.1系统适用性确认表3系统适用性实验结果表（大黄素100%）样品出峰时间峰面积塔板数出峰时间RSD（%）峰面积RSD（%）空白溶液-1――――――――――标样3-15.7072985.9698246.720.040.12标样3-25.7122991.6188245.58标样3-35.7112993.0228226.39标样3-45.7082993.0008233.34标样3-55.7092996.0388212.33空白溶液-2――――――――――表4系统适用性实验结果表（大黄素甲醚100%）样品出峰时间峰面积塔板数分离度出峰时间RSD（%）峰面积RSD（%）空白溶液-1――――――――――――标样3-110.4841413.57210654.6714.510.050.11标样3-210.4851414.87610662.4514.51标样3-310.4781415.16510666.8814.50标样3-410.4741411.44110676.2714.51标样3-510.4771415.11610678.1314.52空白溶液-2――――――――――――3.2重复性确认表5重复性实验结果表（大黄素50%）样品出峰时间峰面积塔板数出峰时间RSD（%）峰面积RSD（%）标样1-15.6841500.9968180.950.060.16标样1-25.6901495.0318200.16标样1-35.6921496.2798181.34标样1-45.6921495.7838197.00标样1-55.6931498.6808204.83表6重复性实验结果表（大黄素甲醚50%）样品出峰时间峰面积塔板数分离度出峰时间RSD（%）峰面积RSD（%）标样1-110.419707.01110546.5514.410.060.08标样1-210.425708.42510536.6614.40标样1-310.436707.18110561.2614.41标样1-410.430707.62210543.5914.39标样1-510.431707.49210582.5414.41表7重复性实验结果表（大黄素80%）样品出峰时间峰面积塔板数出峰时间RSD（%）峰面积RSD（%）标样2-15.6962422.6648232.990.140.05标样2-25.6942422.4978211.38标样2-35.7102420.4418250.08标样2-45.7092420.2048237.44标样2-55.7092422.2408230.49表8重复性实验结果表（大黄素甲醚80%）样品出峰时间峰面积塔板数分离度出峰时间RSD（%）峰面积RSD（%）标样2-110.4451141.15310654.4714.490.170.09标样2-210.4401142.28910601.0614.45标样2-310.4751139.49010677.3214.51标样2-410.4761141.58010641.6714.49标样2-510.4701141.88510630.4914.47表9重复性实验结果表（大黄素150%）样品出峰时间峰面积塔板数出峰时间RSD（%）峰面积RSD（%）标样4-15.7104500.7058265.250.030.18标样4-25.7074509.3858235.30标样4-35.7114518.2648249.83标样4-45.7104509.6548256.49标样4-55.7124521.4788243.49表10重复性实验结果表（大黄素甲醚150%）样品出峰时间峰面积塔板数分离度出峰时间RSD（%）峰面积RSD（%）标样4-110.4892118.04610660.5814.540..020.22标样4-210.4872120.31710675.1914.54标样4-310.4902121.66910690.0014.54标样4-410.4932118.14210695.4014.57标样4-510.4932129.39910691.3414.54表11重复性实验结果表（大黄素200%）样品出峰时间峰面积塔板数出峰时间RSD（%）峰面积RSD（%）标样5-15.7115994.0538251.360.060.29标样5-25.7096008.8788240.66标样5-35.7065976.9778247.02标样5-45.7045970.3408257.55标样5-55.7035968.6488236.32表12重复性实验结果表（大黄素甲醚200%）样品出峰时间峰面积塔板数分离度出峰时间RSD（%）峰面积RSD（%）标样5-110.4962837.13910660.3014.530.060.37标样5-210.4922836.92210690.5814.56标样5-310.4832818.79210676.1914.52标样5-410.4852818.18810687.6714.56标样5-510.4812817.34310700.7914.553.3线性与范围表13线性与范围实验结果表（大黄素）样品峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4峰面积5峰面积平均值标样1（50%）1500.9961495.0311496.2791495.7831498.6801497.35标样2（80%）2422.6642422.4972420.4412420.2042422.2402421.61标样3（100%）2985.9692991.6182993.0222993.0002996.0382991.93标样4（150%）4500.7054509.3854518.2644509.6544521.4784511.90标样5（200%）5994.0536008.8785976.9775970.3405968.6485983.78图2大黄素重复性线性图[11]表14线性与范围实验结果表（大黄素甲醚）样品峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4峰面积5峰面积平均值标样1（50%）707.011708.425707.181707.622707.492707.55标样2（80%）1141.1531142.2891139.4901141.5801141.8851141.28标样3（100%）1411.4411413.57214141.8761415.1651415.1161414.03标样4（150%）2118.0462120.3172121.6692118.1422129.3992121.51标样5（200%）2837.1392836.9222818.7922818.1882817.3432825.68图3大黄素甲醚重复性线性图[11]3.4进样残留数据结果为0。4讨论4.1由各项性能检定实验结果表中的数据显示，大黄素进行实验中每组数据的理论塔板数皆大于8000，大黄素甲醚的理论塔板数都大于10000，远高于3000[3]；大黄素甲醚的分离度都大于14，远大于1.5[3]；出峰时间的RSD整体小于0.1%，峰面积的RSD整体小于0.2%[3]；进样残留都为0；线性相关系数达到0.9999及1[3]，说明实验操作的进样也较为准确，各项数据都高于可接受标准，证明仪器的性能良好。4.2选择大黄素作为对照品做确认，是因为公司做的产品精肝颗粒需要检测大黄素的含量，选用这个对照比较有代表性。为使试验操作更简便，实验数据更加简易分析，进行性能确认配置的标准样品，由实验室用于大黄含量测定常规使用的多种物质混合的照品溶液替换成由大黄素与大黄素甲醚组成的混合溶液。在不干扰实验准确度的情况下，实验过程中使用的流动相（甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15）的配比中降低了甲醇的比例，变成了（80:20），与之对比，这样调整保留时间就会有所滞后，随着保留时间滞后，峰与峰之间的距离会变大，有利于分离，调整比例能使待测组分达到较理想的分离度，重现性更好，只是保留时间会有所延长。4.3实验操作过程中的注意事项流动相使用前必须进行脱气处理，用超声波震荡10至15分钟[12]；标准样品的制备，因为大黄素甲醚较难溶于甲醇，需超声一定时间才可使其完全溶解，所以配置好的标准品超声过后才进样，保证测得数据的准确性。进样必须要保证进量10ul的精密度，同时要掌握好检定规程，检定步骤要准确[10]。5结论结果表明，实验得出的所有项目数据都合理清晰，符合标准，仪器运行的可靠性、主要运行参数的稳定性以及结果的重复性都很好，仪器能投入到实验室工作中。经验证，系统适用性确认中，标样为1,2,3,4,5的溶液连续进样5针后，测得的峰面积的RSD值小于2.0%，保留时间的RSD值小于1.0%[3]。重复性确认中，理论塔板数按大黄峰计大于3000，大黄素与大黄素甲醚的分离度都大于1.5，标样峰面积的RSD值小于2.0%，保留时间的RSD值小于2.0%，进样残留显示为0[3]。线性与范围试验中，大黄素线性方程相关系数r为0.9999，大黄素甲醚线性方程相关系数r为1[3]。在此次性能确认测试中，仪器，标样，标准物质及人员操作均无偏差发生。按实验中拟定的项目逐项试验，各项指标均达到预期结果。此1260-II高效液相色谱仪经过检定和确认，可作为试验室的日常检测使用。参考文献[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版[M].北京:中国医药科技出版社,2015.419-423.[2]国家药典委员会.中国药典2015年版[M].北京：中国医药科技出版社，2015.23-24.[3]裴勇.HPLC法测定消炎止痛洗剂中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的含量

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