离心原理课件

第五章

离心技术离心技术：是利用旋转运动产生的离心力,根据物质的沉降系数或浮力密度的差别进行物质的分析、分离、浓缩和提纯的一种技术。

第一节离心技术的基本原理分离、纯化样品;对已纯化的样品进行结构和性质的分析。悬浮颗粒在液体介质的扩散运动一、离心的一般原理颗粒越小，则沉降越慢，扩散现象越严重。颗粒运动的方向和速度颗粒的密度、形状、大小液体介质的密度、粘度和重力场的强度1、离心力和相对离心力离心力(centrifugalforce，F)

指悬浮颗粒在离心过程中所受的离开旋转中心轴的作用力，由下式计算：

相对离心力(relativecentrifugalforce，RCF)

：在离心场中颗粒所受的离心力相当于它受到的地球重力的倍数（×g）。F=m

w2r2、沉降系数(sedimentationcoefficient,S)

沉降系数是指在单位离心力作用下，待分离颗粒的沉降速度。S的单位为秒，为了纪念离心技术早期的奠基人Svedberg，而把10-13秒称为一个Svedberg单位(S)，即lS=10-13秒。在生物学各种论文中常见的某物质沉降系数为多少个S，即指此单位。

S的数值受颗粒的相对分子质量和形状等特性的影响。预计沉降时间；测定物质相对分子质量。3、沉降速度（sedimentationvelocity,v）沉降速度是指在离心力作用下，单位时间内颗粒沉降的距离。4、沉降时间（t）和相对分子质量（Mr）

沉降时间决定于颗粒的沉降速度和沉降距离。

用于差速离心实验离心机的分类按转速分为低速、高速和超速三种；按用途分为实验型和工业型两种，前者分为分析型和制备型两种；按使用温度分为常温和冷冻两种；按驱动方式分为手摇式、油涡轮式、气动式、电动式和磁悬式等。第二节离心设备preparativeultracentrifuge转头驱动装置速度控制系统冷却装置真空装置光学检测系统离心机的构造

a水平转头b角式转头c垂直转头角度在14-40℃

之间离心转头实验中常用的是普通离心机（转速一般不高于4000rpm），用于分离血清和沉淀细胞、大的沉淀物等。

玻璃离心管用于速度较低的离心，具有管壁光滑、透明和易清洁等优点，但易破碎，故不能用于高速离心。塑料离心管超速离心时，离心管需要封口。由于制造离心管的塑料材料很多，如聚丙烯、聚乙烯、硝化纤维素、尼龙等，其各有自己的理化特性和对各种实验试剂的化学稳定性。不锈钢离心管强度大，刚性好，通常对碱的耐受较好，抗酸性较差。使用时配对使用。离心管选用离心管时应考虑的因素：容量：由样品的体积决定。高速离心时离心管必装满形状：收集沉淀用圆锥形管底的离心管较好；而进行密度梯度离心时圆底离心管更有用最大离心力：标准的玻璃管仅用于低速离心（小于2000g）耐腐蚀性：详细信息可参考厂家的说明书灭菌：一次性塑料离心管出厂时通常是消过毒的。玻璃管及聚丙烯管可重复灭菌使用。透明度：玻璃管和聚碳酸酯是透明的，而聚丙烯管为半透明能否刺穿：以刺穿法收集样品，纤维素乙酸管和聚丙烯管适合管帽：大多数角式及垂直管式转子要求离心管有管帽，用以防止使用过程中样品漏出并在离心过程中支撑离心管使用前在无负荷的情况下，开动离心机以便检查其转动是否平稳；检查套管内是否有橡皮软垫。检查合格后,将用天平平衡好的装有样品的离心管放入离心套管内，位置要对称。盖上离心机盖子，接通电源，缓慢加速到所需速度。离心完毕，待转速缓慢逐步调回零位，任其自动停稳后，方可打开盖子取出离心管，切勿用手助停。离心过程中如发现声音不正常，机身不稳，应立即切断电源，待检查排除故障后方能使用。离心机的使用及注意事项

制备离心技术：是以分离纯化生化物质、细胞、亚细胞粒子为目的离心技术。

第三节常用离心方法及应用制备离心技术一般制备离心技术制备超速离心技术差速沉降离心密度梯度区带离心差速区带离心等密度区带离心

概念：简称区带离心法，是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。密度梯度离心法差速区带离心等密度区带离心不同颗粒存在着一定的沉降速度差20%S或分子量相差3倍不同颗粒存在着一定浮力密度差密度梯度离心原理不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。密度梯度离心法应用利用密度梯度离心的原理，用ficoll液或precoll液分离和纯化人或动物外周血单个核细胞（PBMC）。目前比较常用ficoll密度梯度法。Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）的实验方法一、步骤1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。2.取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面，水平离心2000rpm×20分钟。3.离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入５倍以上体积的Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的