3-农业行业标准《枣及制品中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的测定  高效液相色谱法》编制说明

《枣及制品中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的测定高效液相色谱法》农业行业标准编制说明起草单位：青岛农业大学、农业农村部果品质量安全风险评估实验室（青岛）、天津市农业科学院、农业农村部食物与营养发展研究所、青岛市现代农业质量与安全工程重点实验室负责人：聂继云联系电话箱：jiyunnie@163.com一、工作简况（一）任务来源根据农质标函〔2025〕63号农业农村部农产品质量安全监管司关于下达2025年第一批农业国家和行业标准制修订项目计划的通知，由青岛农业大学主持承担《枣及制品中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的测定高效液相色谱法》标准的制定工作，项目编号为NYB-25081，归口单位为农业农村部农产品营养标准专家委会。（二）主要起草单位青岛农业大学、农业农村部果品质量安全风险评估实验室（青岛）、天津市农业科学院、农业农村部食物与营养发展研究所、青岛市现代农业质量与安全工程重点实验室。（三）编写人员与分工标准制定过程主要由青岛农业大学等单位的人员参与资料收集、产业调研、文本起草、实验验证、实验室间比对等工作，人员分工见表1。表1主要起草人员及任务分工姓名单位职称专业特长及分工聂继云青岛农业大学*教授首席专家，组织实施和总体协调王堃宇青岛农业大学*博士生负责试验验证陈秋生天津市农业科学院研究员实验室间验证朱大洲农业农村部食物与营养发展研究所研究员实验室间验证孔夏冰青岛农业大学*博士生参与试验验证刘晓丽青岛农业大学*实验师参与试验验证王昱心青岛农业大学*硕士生参与试验验证万浩亮青岛农业大学*副教授参与试验验证贾东杰青岛农业大学*教授参与试验验证李倩青岛农业大学*讲师参与试验验证韩令喜青岛农业大学*教授参与试验验证*包括农业农村部果品质量安全风险评估实验室（青岛）、青岛市现代农业质量与安全工程重点实验室。（四）主要工作过程1.起草阶段编制方案：2025年6月，标准制定任务下达后，青岛农业大学成立了以项目首席专家聂继云教授为组长的标准编制技术小组，明确了参加人员及任务分工（表1），编制了项目实施方案。实验验证：2025月7月～2025年10月，以前期建立的冬枣中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷超高效液相色谱检测方法为基础，检测对象拓展为鲜枣及主要枣制品（干枣、枣汁），购置标准品及相关试剂耗材，对提取条件、色谱条件等进行优化筛选和方法学验证，起草标准草案及编制说明。比对实验：2025年11月，由江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所（单位1）、农业农村部农产品及加工品质量检验测试中心（天津）（单位2）、新疆维吾尔自治区农业科学院农业质量标准与检测技术研究所（单位3）等3家农业农村部质检中心对标准草案进行了实验室间验证，证明了标准的可行性、实用性和准确性。在比对实验基础上，形成标准征求意见稿及其编制说明。2.征求意见阶段2025年12月，向相关技术推广、科研教学、质量检测等部门位专家广泛征求意见。二、标准的编制原则和主要内容（一）标准编制依据和原则在标准编制过程中严格遵循国家有关方针、政策、法规和规章，严格遵循先进性、经济性和适用性原则，严格执行《标准编写规则第4部分：试验方法标准》（GB/T20001.4-2015）、《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》（GB/T1.1-2020）和《食品卫生检验方法理化部分总则》（GB/T5009.1-2003）等有关标准的规定。力求技术内容叙述正确无误，文字表达准确、简明、易懂，标准构成严谨合理，内容编排、层次划分等符合逻辑与规定。坚持科学性、先进性与实用性统一，确保制定出的标准既有良好的精密度、准确度和灵敏度，又经济、高效。形成征求意见稿后广泛征求科研、教学、推广、质检等相关部门专家广泛意见。（二）标准主要内容本文件主要内容包括范围、规范性引用文件、术语和定义、原理、试剂和材料、仪器与设备、分析步骤、结果计算、精密度、色谱图等10章，并提供了两个资料性附录“环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的标准物质基本信息及检出限和定量限”（附录A）和“标准溶液色谱图”（附录B）。三、主要试验的分析、综合报告、技术经济论证、预期的经济效果（一）试材选择查阅文献、专利和相关标准发现，环磷酸腺苷（cAMP）和环磷酸鸟苷（cGMP）含量丰富的水果主要是枣。本文件以鲜枣（冬枣）、干枣和枣汁这三种代表性样品为试材，进行条件优化试验和方法学验证试验。（二）检测条件与提取条件的优化与验证购置环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷标准品后，配制成1000mg/L的单标储备液，储存在密闭棕色玻璃瓶中。标准储备液在-18℃条件下可保存6个月。在前期建立的冬枣中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷超高效液相色谱检测方基础上[1]，以上述3种样品为对象，进一步筛选优化提取条件和检测参数，并通过实验室间比对验证方法的可靠性。1．色谱条件优化大量文献报道证实，环磷酸腺苷（cAMP）在紫外区最佳吸收峰为258nm[2]，环磷酸鸟苷（cGMP）在紫外区最佳吸收峰为254nm[3]。用液相色谱仪器DAD检测器进行全波长扫描得到等吸收线图，验证了258nm（图2）和254nm（图1）是环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的最佳吸收波长。鉴于实际样本中cGMP含量通常显著低于cAMP，且cAMP在254nm检测波长处也有很强的吸收，为确保低含量组分（cGMP）的检测灵敏度，本文件将检测波长定为254nm。图1cGMP等吸收线图、最大吸收波长图和色谱图图2cAMP等吸收线图、最大吸收波长图和色谱图cAMP和cGMP易溶于甲醇-磷酸二氢钾溶液，本文件起草过程中，基于前期针对冬枣建立的超高效液相色谱测定方法，进一步优化水相中磷酸二氢钾浓度、柱温箱温度、流速、进样量和流动相比例。A相设为甲醇，B相设为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液、0.02mol/L磷酸二氢钾溶液、0.05mol/L磷酸二氢钾溶液等4种流动相；柱温箱设30℃、35℃、40℃等3种温度；流动相设0.6mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min等3种流速；样液设5μL、10μL、20μL等3种进样量；流动相A和流动相B设6:94、7:93、10:90等3种比例。根据目标化合物的分离情况和峰形对称性确定最佳的色谱条件。实验发现，B相为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液时，cGMP峰形比较宽，且在复杂样品基质中于cGMP出峰起始阶段出现共洗脱现象，存在杂质干扰（图3a）；将B相提高为0.02mol/L磷酸二氢钾溶液时，cGMP峰形与分离度均显著改善，能够满足实验要求（图3b）；当B相浓度进一步增至为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液时，cGMP分裂为两个峰（图3c），推测可能由于高浓度磷酸盐溶液缓冲能力较弱，导致pH稳定性下降，进而引起色谱峰异常。在优化流动相比例方面，比较了甲醇-磷酸二氢钾水溶液比例为6:94（图3d）、7:93（图3e）和10:90（图3f）3种条件，发现10:90条件下cGMP与邻近杂质分离度不足，6:94和7:93条件下分离效果良好。6:94条件下分离度更高，因此，综合考虑，本文件选择0.02mol/L磷酸二氢钾溶液为B流动相，并以6:94的流动相比例进行等度洗脱。ababcdef图3流动相对cAMP和cGMP分离效果的影响实验表明，升高柱温有助于提高cAMP与cGMP的分离度，并显著缩短其保留时间。在30 ℃条件下，由于温度较低，cGMP未能与其前面的杂质峰实现有效分离（图4a）；当柱温升至35 ℃时，两者分离效果良好（图4b）；进一步提高至40 ℃后，因保留时间过度缩短，cGMP再次与杂质峰重叠，分离度下降（图4c）。在流速优化方面，提高流速可显著缩短cAMP与cGMP的分离时间（图4d–f），但流速过高会导致系统超压或分离度降低。当流速为1.0 mL/min时，cGMP与相邻杂质峰实现有效分离，同时分析时间显著缩短。因此，综合考虑，本文件选择柱温35 ℃、流速1.0 mL/min作为最优色谱条件。fedabcfedabc图4柱温和流速对cAMP和cGMP分离效果的影响进样量的选择需要在信号响应、分离效果与系统稳定性之间取得平衡。过高的进样量容易导致色谱柱污染或过载，影响色谱柱寿命和分离性能；而过低的进样量则会使目标化合物响应信号较弱，难以准确定量。实验中发现（图5），当进样量为5 μL时，cAMP与cGMP的色谱峰较低，基线噪声较为明显，不利于低浓度样品的准确检测。参考文献方法，多数研究采用10μL进样量，该条件能够保证良好峰形与灵敏度。因此，综合考虑，本文件进样量设为10μL。图5进样量对cAMP和cGMP分离效果的影响2．鲜枣提取条件优化影响cAMP和cGMP提取率的参数主要有提取时间、提取温度和料液比。冬枣鲜果洗净，擦干，取可食部分约200g，切碎混匀，置冷冻研磨机中，加入液氮，研成粉末，称取4g粉末样品，进行提取。（1）不同提取温度对鲜枣中cAMP和cGMP提取效果的影响cAMP和cGMP在提取试剂中的溶出受温度的影响，一定范围内，温度越高提取效果越好，但是较高的温度会促进其降解。为此，设定40℃、50℃、60℃、65℃等4个提取温度，以纯水为提取剂，进行提取效果对比试验。65℃下的cGMP提取得率均高于60℃、50℃和40℃下的提取得率，且极显著高于后两者（图6）。相较于cGMP，cAMP更容易提取，4个提取温度间均无显著差异（图6）。因此，综合考虑，本文件确定65℃为鲜枣最佳提取温度。图6提取温度对鲜枣中cGMP和cAMP提取效果的影响（2）不同提取时间对鲜枣中cAMP和cGMP提取效果的影响理论上，延长提取时间能够提高cAMP和cGMP的得率。然而，提取时间过长有可能会使部分cAMP和cGMP降解，导致得率降低，并且提取时间过长也导致实验繁琐、成本升高。试验以纯水为提取剂，比较了提取1h、2h、4h、6h、8h、16h、32h和48h的提取得率。发现cGMP的提取含量随着时间延长，总体呈现先上升后下降的趋势，在32h达到峰值，48h时开始下降，但16h在统计上与32h没有显著差异（图7）。cAMP的含量随时间变化不大，在16h达到最高值，但各时间点之间的差异没有达到显著水平（图7）。因此，综合考虑得率、效率、成本和统计学结果，本文件确定最佳提取时间为16h。图7提取时间对鲜枣中cGMP和cAMP提取效果的影响（3）料液比对鲜枣中cAMP和cGMP提取效果的影响溶剂体积的增大使得样品和提取溶剂之间界面的浓度梯度增大，cAMP和cGMP受到溶剂的浸润更容易扩散到溶剂中。然而，过量溶剂的引入会稀释样品，可能导致其中低浓度的cGMP降至方法检出限以下，而影响分析结果的准确性与方法可靠性。为探究最佳的料液比，对1:5、1:10、1:15、1:20等4种料液比进行了对比试验（图8）。虽然1:15与1:20之间提取得率无显著差异，但1:20是得率最高的比例。因此，综合考虑，本文件确定最佳料液比为1:20。图8料液比对鲜枣中cGMP和cAMP提取效果的影响3．干枣提取条件优化干枣相比于鲜枣（冬枣）更容易提取，主要源于其物理结构和细胞完整性不同。鲜枣的细胞壁和细胞膜结构完整、紧致，构成了有效的屏障，溶剂需要先渗透这些屏障，才能将细胞内的有效成分溶解并带出。这个过程需要更高的能量来破坏细胞结构，促进溶出。干枣在干燥过程中，细胞失水导致细胞壁坍塌、破裂，细胞膜的通透性也大大增加。这使得溶剂可以非常容易地接触和溶解细胞内的成分。因此，即使在较低温度、较短时间和较低比例下，有效成分也能迅速、大量地溶出。因此干枣果实（去核，如果有）约50g直接置于冷冻研磨机中，研成粉末，称取2g样品进行提取。（1）提取温度对干枣中cAMP和cGMP提取效果的影响设定40℃、50℃、60℃、65℃等4个提取温度，发现50℃～65℃条件下cGMP的提取得率没有显著差异，各温度条件下cAMP的提取得率没有显著差异（图9）。因此，综合考虑标准文本的简洁与一致性，与鲜枣提取温度相一致，本文件确定65℃为干枣最佳提取温度。图9提取温度对干枣中cGMP和cAMP提取效果的影响（2）提取时间对干枣中cAMP和cGMP提取效果的影响比较了65℃下分别提取1h、2h、4h、6h和8h的提取得率。发现cGMP和cAMP的提取含量均随时间变化没有显著差异（图10），因此，确定干枣最佳提取时间为1h。图10提取时间对干枣中cGMP和cAMP提取效果的影响（3）料液比对干枣中cAMP和cGMP提取效果的影响考虑到干枣中水分含量远低于鲜枣，对料液比进行了调整，以便更好地提取样品中的cAMP和cGMP。对1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80等7种料液比进行试验。对于cGMP，前6种料液比之间，提取效果没有显著差异；对于cAMP，所有料液比之间提取效果均无显著差异（图11）。因此，确定最佳料液比为1：20。图11料液比对干枣中cGMP和cAMP提取效果的影响4．枣汁提取条件优化在枣汁加工的高温浸提、杀菌处理中，cGMP和cAMP都会被高温破坏。由于cGMP分子中鸟嘌呤碱基固有的不稳定性，它通常被认为比cAMP更容易被热破坏。同时由于cGMP在枣中的含量相对较少，因此，成品枣汁中，cGMP不容易被检测到，购买了3种红枣汁，均未从中检测出cGMP，应是枣汁加工中cGMP被完全破坏了。枣汁样品量取2mL样品进行提取，针对cAMP进行提取条件筛选。比较了60℃下分别提取10min、20min、30min、60min及不提取5种处理的得率。发现5种处理之间的cAMP含量测定值没有显著差异（图12）。比较了40℃、50℃、60℃、65℃和不加热（即室温）下提取30min的提取效果，发现各提取温度之间cAMP提取得率没有显著差异（图13）。提取时间和提取温度试验均表明，枣汁中的cAMP已完全进行枣汁的水相中，因此，枣汁测定cAMP含量时无需加热提取。比较了枣汁中加入0倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍水稀释后的cAMP测定结果，发现稀释会导致cAMP含量测定值降低（图14）。因此，确定测定枣汁cAMP含量时，样品不提取，直接离心后上机检测。图12提取时间对枣汁中cAMP提取效果的影响图13温度对枣汁中cAMP提取效果的影响图14料液比对枣汁中cAMP提取效果的影响(三)方法的科学性和可操作性的验证为了保证本文件方法的有效性，对cAMP和cGMP进行了标准曲线线性范围、检出限和定量限、准确度、重复性和再现性的考察。1、标准曲线线性范围配制cAMP和cGMP的混合标准储备液，用纯水稀释成浓度分别为0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L和100mg/L的系列标准工作溶液，高效液相色谱法进样测定。在上述确定参数条件下，从低浓度到高浓度进样，每一浓度样品进样三针，按其所得峰面积比的平均值与对应的cAMP和cGMP溶液浓度（mg/L）作标准曲线，计算出回归方程和相关系数。方程回归得到cAMP和cGMP混合标准溶液浓度均在0.5～100mg/L范围内具有良好的线性关系，具体线性方程及相关系数见表1。表1cAMP和cGMP的线性关系化合物公式线性范围（mg/L）相关系数（R2）检出限（mg/kg）定量限（mg/kg）cAMPy=23.612x-0.74380.5-1001.00.030.5cGMPy=20.51x+0.84390.5-1001.00.050.52、检出限和定量限根据《食品卫生检验方法理化部分总则》（GB/T5009.1）附录A和《实验室质量控制规范食品理化检测》（GB/T27404-2008）的规定，检出限的计算方法是3倍的仪器信噪比，定量限为实际样品测量时精密度和准确度都达到要求的最小浓度。据此得到cAMP和cGMP的检出限和定量限（表1）。由表1可见，cAMP和cGMP的检出限在0.03～0.05mg/kg，定量限为0.5mg/kg，表明本文件方法具有很好的灵敏度，能够满足定量分析需要。本方法为外标法定量。在确定的最佳条件下，将cAMP和cGMP配制成含0.5～100mg/L的标准工作溶液（含8个浓度梯度），对峰面积y和浓度x（mg/L）做工作曲线，结果见表1。可以看出，cAMP和cGMP的浓度线性范围均超过3个数量级。3、准确度以青岛农业大学为实验室1，江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所为实验室2、农业农村部农产品及加工品质量检验测试中心（天津）为实验室3和新疆维吾尔自治区农业科学院农业质量标准与检测技术研究所分别为实验室4，依据各产品中cAMP和cGMP的含量水平，分别对鲜枣、干枣和枣汁样品进行加标回收试验（n=3）。称取试样4g（鲜枣）或2g（干枣、枣汁），各加入环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷20mg/kg和20mg/kg（鲜枣）、400mg/kg和200mg/kg（干枣）、6mg/kg（环磷酸腺苷，枣汁），试验结果见表2。cAMP和cGMP的回收率分别为94.0%～99.2%和93.8%～97.2%，满足GB5009.295-2023《食品安全国家标准化学分析方法验证通则》对添加回收率80%～110%的要求，表明本文件方法适用于鲜枣、干枣和枣汁中cAMP和cGMP的准确检测。表2加标回收试验结果单位样品浓度（mg/L）化合物平行（%）平均（%）123实验室1鲜枣20cAMP96.494.699.896.920cGMP93.795.697.195.4干枣400cAMP95.192.794.294.0200cGMP96.395.396.796.1枣汁6cAMP97.293.599.096.6实验室2鲜枣20cAMP97.599.5100.599.220cGMP96.094.593.594.7干枣400cAMP94.894.393.594.2200cGMP95.595.595.095.3枣汁6cAMP98.793.797.096.5实验室3鲜枣20cAMP93.5100.099.097.520cGMP93.096.092.593.8干枣400cAMP94.096.097.095.7200cGMP95.095.596.595.7枣汁6cAMP94.893.296.594.8实验室4鲜枣20cAMP100.596.097.097.820cGMP94.592.098.094.8干枣400cAMP95.895.395.095.4200cGMP97.098.096.597.2枣汁6cAMP95.895.899.296.94、重复性以青岛农业大学为实验室1，江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所为实验室2、农业农村部农产品及加工品质量检验测试中心（天津）为实验室3和新疆维吾尔自治区农业科学院农业质量标准与检测技术研究所分别为实验室4，用前面确定的样品提取方法和液相色谱分析方法对同一样品进行cAMP和cGMP测定（均平行测定3次），找出实验室内相差最大的两个测定值，并计算二者间的相对偏差（表3）。cAMP的相对偏差在0.2%~9.7%，cGMP的相对偏差在0.6%~9.5%，均满足GB5009.295-2023《食品安全国家标准化学分析方法验证通则》≤10%的要求。因此，本标准规定“在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的10%”。表3实验室内重复性试验样品测定物质实验室平行（mg/kg）最大值（mg/kg）最小值（mg/kg）相对偏差（%）123鲜枣cAMP118.219.919.019.918.28.9219.517.718.219.517.79.7318.820.318.720.318.78.2418.518.019.419.4187.5cGMP21.920.28.121.620.17.2320.420.219.320.419.35.5419.121.020.62119.19.5干枣cAMP14304324304324300.524344354344354340.234324324304324300.544264244264264240.5cGMP11781771791791771.121781791781791780.631801761801801762.241741761741761741.1枣汁cAMP15.895.985.905.985.891.526.125.895.946.125.893.835.805.85.445.826.006.026.025.823.45、再现性以青岛农业大学为实验室1，江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所为实验室2、农业农村部农产品及加工品质量检验测试中心（天津）为实验室3和新疆维吾尔自治区农业科学院农业质量标准与检测技术研究所分别为实验室4，用前面确定的样品提取方法和液相色谱分析方法对同一样品进行cAMP和cGMP测定（均平行测定3次），找出实验室间相差最大的两个测定值，并计算二者间的相对偏差（表4）。cAMP的相对偏差为13.7%、2.6%和5.4%，cGMP的相对偏差为13.7%和3.4%，均满足GB5009.295-2023《食品安全国家标准化学分析方法验证通则》≤15%的要求。因此，本标准规定“在再现性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的15%”。表4实验室间样品含量对比结果样品测定物质实验室平行（mg/kg）最大值（mg/kg）最小值（mg/kg）相对偏差（%）123鲜枣cAMP118.219.919.020.317.713.7219.517.718.2318.820.318.7418.518.019.4cGMP21.919.113.7320.420.219.3419.121.020.6干枣cAMP14304324304354242.6243443543434324324304426424426cGMP11781771791801743.4217817917831801761804174176174枣汁cAMP15.895.985.906.125.805.426.125.895.9435.805.826.1245.826.006.02四、采用国际标准和国外先进标准的程度，以及与国际、国外同类标准水平的对比情况，或与其他测试样品的有关数据对比情况1.与其他相关标准的对比情况截止目前，尚未见有cAMP和cGMP的测定相关标准，迫切需要制定相关标准，规范其含量的测定。本文件针对冬枣（鲜枣）、干枣和枣汁中cAMP和cGMP进行高效液相色谱法研究，实现样品中cAMP和cGMP35min内分离检测。因此，本文件的制定和发布实施，将填补我国枣及制品中cAMP和cGMP检测方法标准的空白。2.不同枣及枣制品cAMP和cGMP数据比对为探究本文件方法测定枣及枣制品中cAMP和cGMP含量的准确、可靠性，汇总了文献报道的不同枣品种及枣制品中cAMP和cGMP含量范围，并将该范围与本文件测定cAMP和cGMP含量比对分析。发现cAMP和cGMP含量差异都较大，鲜枣中cAMP范围从4.17～47.0mg/kg，cGMP范围从2.96～29.0mg/kg；干枣中cAMP范围从15.51～529mg/kg，cGMP范围从5.91～274mg/kg；枣汁中cAMP范围从1.06～19.2mg/kg。与文献报道的不同枣品种及枣制品中cAMP和cGMP含量比较发现，其含量均在最低值和最高值范围内（表6）。这证明本文件方法测定枣及制品中cAMP和cGMP含量的结果是可靠的。表6cAMP和cGMP含量与文献报道对比样品化合物本项目试验平均值（mg/kg）文献报道值（mg/kg）[1,4,5,6,7,8,9]鲜枣cAMP18.94.17-47.