双药联用纳米载体递送siRNA策略

双药联用纳米载体递送siRNA策略演讲人2025-12-11

双药联用纳米载体递送siRNA策略壹引言：siRNA递送的临床需求与挑战贰双药联用纳米载体的设计原则叁双药联用纳米载体的类型与构建策略肆双药联用的协同机制与验证伍体外与体内研究进展陆目录临床转化挑战与未来方向柒总结与展望捌01ONE双药联用纳米载体递送siRNA策略02ONE引言：siRNA递送的临床需求与挑战

引言：siRNA递送的临床需求与挑战RNA干扰（RNAi）技术作为后基因组时代的重要突破，通过小干扰RNA（siRNA）特异性沉默致病基因，在肿瘤、遗传性疾病、病毒感染等领域展现出巨大潜力。然而，siRNA的临床转化面临递送效率低、稳定性差、脱靶效应等核心挑战。siRNA为带负电荷的大分子（分子量~13kDa），易被血清核酸酶降解，且难以穿过带负电的细胞膜；同时，肿瘤微环境（TME）的复杂性如血管异常、免疫抑制、药物耐药性等，进一步限制了单一siRNA的治疗效果。为解决这些问题，纳米载体因可保护siRNA、实现靶向递送、调控药物释放等优势成为研究热点。但单一siRNA治疗往往难以克服肿瘤的代偿性激活或多通路耐药机制，而“双药联用”策略——即通过纳米载体共递送siRNA与另一种治疗药物（如化疗药、靶向药、免疫调节剂等）——可通过协同增效、逆转耐药、调节免疫微环境等多维度机制，显著提升治疗效果。本文将系统阐述双药联用纳米载体递送siRNA的设计原则、构建策略、协同机制及研究进展，为该领域的深入开发提供思路。

siRNA递送的关键挑战与双药联用的必要性2.1siRNA递送的核心瓶颈

1.1体内稳定性不足裸siRNA在血液循环中易被血清核酸酶降解，半衰期仅数分钟；同时，肾脏快速清除（肾小球滤过阈值~30-50kDa）导致其在靶器官的蓄积量不足。

1.2细胞摄取与内体逃逸障碍siRNA需穿过细胞膜进入细胞质发挥RNAi效应，但带负电的细胞膜与siRNA的静电排斥阻碍其摄取；即使通过内吞作用进入细胞，siRNA被困于内体-溶酶体中，被酸性水解酶降解，仅有1%-2%的siRNA能逃逸至细胞质。

1.3肿瘤靶向性差实体瘤血管壁通透性异常（EPR效应）和淋巴回流受阻虽有利于纳米颗粒被动靶向，但肿瘤内部间质压力高、血管分布不均，导致纳米载体在肿瘤深部分布有限；同时，缺乏主动靶向能力时，载体易被单核吞噬细胞系统（MPS）捕获，在肝、脾等器官蓄积，增加毒副作用。

1.4耐药性与代偿性激活肿瘤细胞可通过上调药物外排泵（如P-gp）、激活抗凋亡通路（如Bcl-2）、修复损伤DNA等机制对单一治疗产生耐药；siRNA虽能特异性沉默靶基因，但长期使用可能因通路补偿或基因突变导致疗效下降。

1.4耐药性与代偿性激活2双药联用策略的优势针对上述挑战，双药联用纳米载体通过“多靶点协同”实现1+1>2的治疗效果：-协同增效：siRNA沉默耐药相关基因（如多药耐药基因MDR1），化疗药（如阿霉素）通过诱导DNA损伤直接杀伤肿瘤细胞，逆转耐药并增强化疗敏感性；-调节微环境：siRNA靶向肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中的M2型极化因子（如CSF-1R），联合免疫检查点抑制剂（如PD-1抗体），将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”，激活抗肿瘤免疫；-降低毒副作用：纳米载体实现肿瘤局部富集，减少药物在正常组织的暴露，例如siRNA沉默肝脏代谢酶（如CYP3A4），联合化疗药时可降低全身性肝毒性；-克服脱靶效应：两种药物通过不同机制发挥作用，可减少单一药物的高剂量使用，从而降低脱靶风险。03ONE双药联用纳米载体的设计原则

1载体材料的生物相容性与可降解性纳米载体材料需具备低毒、可生物降解的特性，避免长期蓄积。常用材料包括：-脂质材料：阳离子脂质（如DOTAP、DLin-MC3-DMA）可静电结合siRNA形成脂质体，磷脂（如DSPC）和胆固醇（Chol）可增强稳定性；-高分子聚合物：可降解聚酯（如PLGA、PCL）通过酯键水解降解，阳离子聚合物（如PEI、PLL）可压缩siRNA，但需优化分子量以降低细胞毒性；-无机纳米材料：介孔二氧化硅（MSNs）、金纳米颗粒（AuNPs）具有高载药量和表面易修饰性，但需解决长期生物安全性问题。

2双药共递送的负载策略2.1物理包埋与静电吸附-核-壳结构：以siRNA为内核，聚合物或脂质为外壳负载化疗药（如紫杉醇包埋于PLGA壳层）；-共组装：两亲性分子（如DSPE-PEG2000）同时包裹siRNA和疏水性药物，形成胶束结构。

2双药共递送的负载策略2.2化学偶联-二硫键连接siRNA与阿霉素，在肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽（GSH）环境下断裂，实现同步释放；-基底膜金属蛋白酶（MMP）敏感肽连接siRNA与靶向药，在TME中特异性水解释放药物。通过pH敏感、酶敏感或二硫键连接siRNA与药物，例如：

3靶向性与响应性释放3.1主动靶向修饰在载体表面修饰靶向配体（如RGD肽靶向肿瘤血管内皮细胞整合素αvβ3、叶酸靶向叶酸受体过度表达的肿瘤细胞），促进载体与肿瘤细胞的特异性结合。

3靶向性与响应性释放3.2微环境响应释放-pH响应：肿瘤细胞外pH（6.5-7.0）低于正常组织（7.4），可设计含组氨酸、聚β-氨基酯（PBAE）的载体，在酸性条件下溶解释放药物；-酶响应：TME中高表达的MMP-2、透明质酸酶（HAase）可降解载体（如MMP敏感肽交联的PLGA），实现药物控释；-氧化还原响应：肿瘤细胞内GSH浓度（2-10mM）远高于细胞外（2-20μM），二硫键连接的载体可在细胞质内快速释放siRNA和药物。

4优化药代动力学与生物分布通过聚乙二醇化（PEG修饰）延长血液循环时间（“隐形效应”），减少MPS摄取；同时，调节载体粒径（50-200nm）以增强EPR效应，提高肿瘤蓄积效率。04ONE双药联用纳米载体的类型与构建策略

1脂质基纳米载体1.1脂质体（Liposomes）脂质体是由磷脂双分子层形成的封闭囊泡，可同时包封亲水性和疏水性药物。例如，阳离子脂质体（如Lipofectamine）通过静电作用负载siRNA，疏水内核包载阿霉素（DOX）；表面修饰PEG（Stealth®脂质体）可延长半衰期，进一步修饰转铁蛋白（Tf）可实现主动靶向。优势：生物相容性好、制备工艺成熟；挑战：血清易导致脂质体聚集（“蛋白冠”形成），影响靶向性；改进策略：使用稳定阳离子脂质（如DLin-MC3-DMA）或pH敏感脂质（如CHEMS），提高血清稳定性和内体逃逸效率。4.1.2脂质-聚合物杂化纳米粒（Lipid-PolymerHybridN

1脂质基纳米载体1.1脂质体（Liposomes）anoparticles,LPHNs）LPHNs以聚合物纳米核（如PLGA）为疏水性药物载体，外层包裹脂质体（含siRNA），结合了聚合物的高载药量和脂质体的优异转染效率。例如，PLGA核负载紫杉醇（PTX），阳离子脂质层（DOTAP/Chol）结合siRNA靶向Bcl-2，表面修饰PEG-RGD，实现主动靶向与pH响应释放。优势：稳定性优于脂质体，转染效率高于聚合物载体；构建流程：1.乳化挥发法制备PLGA-PTX纳米核；2.脂质薄膜水化法包裹阳离子脂质层；3.静电吸附siRNA；4.修饰靶向配体与PEG。

2高分子聚合物纳米载体2.1阳离子聚合物纳米粒阳离子聚合物（如PEI、PLL、壳聚糖）通过正电荷与siRNA形成聚复合物（polyplex），同时负载疏水性药物。例如，低分子量PEI（25kDa）与siRNA形成复合物，通过疏水修饰（如接枝PLGA）包载PTX；或使用β-环糊精修饰的壳聚糖，同时包载siRNA和DOX。优势：siRNA压缩效率高，易于表面修饰；挑战：PEI等阳离子聚合物细胞毒性大，需通过乙酰化、PEG化等修饰降低毒性。

2高分子聚合物纳米载体2.2两亲性嵌段共聚物胶束两亲性共聚物（如PLGA-PEG、PCL-PEG）在水溶液中自组装形成胶束，疏水内核负载疏水性药物（如PTX、多西他赛），亲水外壳（PEG）稳定胶束，可通过静电作用或共价键连接siRNA。例如，聚（β-氨基酯）-聚乙二醇（PBAE-PEG）胶束，内核负载PTX，siRNA通过二硫键连接于胶束表面，在GSH环境下释放。优势：粒径均一（20-100nm）、载药量高、可调控释放；构建要点：调节嵌段比例（如PLGA:PEG=3:1）以平衡载药量与稳定性。

3无机纳米载体4.3.1介孔二氧化硅纳米粒（MesoporousSilicaNanoparticles,MSNs）MSNs具有高比表面积（~1000m²/g）、大孔径（2-10nm）和可修饰表面，可同时负载siRNA和化疗药。例如，MSNs孔道负载DOX，表面接枝聚乙烯亚胺（PEI）结合siRNA，再修饰叶酸实现靶向；或通过MMP敏感肽封堵孔道，在TME中响应释放药物。优势：载药量高、化学稳定性好、易于功能化；挑战：长期生物安全性（如硅离子释放）需进一步评估。

3无机纳米载体4.3.2金纳米颗粒（GoldNanoparticles,AuNPs）AuNPs可通过金-硫键、静电作用等负载siRNA和药物，表面易于修饰靶向分子。例如，13nmAuNPs通过硫醇修饰连接siRNA，同时吸附阿霉素，通过RGD肽靶向肿瘤细胞；或利用金纳米颗粒的光热效应（近红外光照射）协同siRNA和化疗药杀伤肿瘤（光热-化疗-基因治疗三联疗法）。优势：光学性质优异（可用于成像）、光热转换效率高；构建策略：控制AuNPs粒径（5-20nm）以增强肾清除，减少长期蓄积。

4外泌体与细胞膜仿生纳米载体4.1外泌体（Exosomes）外泌体是细胞分泌的天然纳米囊泡（30-150nm），具有低免疫原性、高生物相容性和靶向性。可通过基因工程改造供体细胞（如树突状细胞），使其分泌的外泌体携带siRNA（如针对PD-L1的siRNA），同时负载化疗药（如吉西他滨）；或通过电穿孔/孵育法将siRNA和药物加载至外泌体。优势：天然靶向能力（如外泌体膜蛋白CD63、CD81可介导细胞摄取）、可穿透血脑屏障；挑战：载药量低、分离纯化困难。

4外泌体与细胞膜仿生纳米载体4.2细胞膜仿生纳米粒0504020301将细胞膜（如红细胞膜、肿瘤细胞膜）包裹于人工合成纳米核（如PLGA、AuNPs）表面，赋予载体天然细胞的生物特性。例如：-红细胞膜包裹：可延长血液循环时间（避免MPS识别），负载siRNA和DOX；-肿瘤细胞膜包裹：表达肿瘤相关抗原，实现同源靶向，负载siRNA（靶向survivin）和紫杉醇。优势：兼具人工载体的可控性与天然载体的生物相容性；构建流程：1.制备人工纳米核；2.分离纯化细胞膜；3.反复挤出法制备膜-核复合物。05ONE双药联用的协同机制与验证

1协同机制的类型1.1化疗药与siRNA协同逆转耐药-案例：siRNA靶向多药耐药基因1（MDR1），编码P-gp蛋白（外排泵），抑制阿霉素外排；同时阿霉素诱导肿瘤细胞凋亡，协同逆转耐药。-验证方法：qPCR检测MDR1mRNA表达，Westernblot检测P-gp蛋白水平，Hoechst33258染色观察细胞凋亡，流式细胞术检测细胞内阿霉素蓄积量。

1协同机制的类型1.2免疫治疗与siRNA协同调节微环境-案例：siRNA靶向TAMs中的CSF-1R，抑制M2型TAMs极化，减少免疫抑制性细胞因子（如IL-10、TGF-β）分泌；联合PD-1抗体阻断免疫检查点，激活CD8+T细胞，增强抗肿瘤免疫。-验证方法：免疫组化检测CD163+（M2型TAMs标记）和CD8+T细胞浸润，ELISA检测血清细胞因子水平，流式细胞术分析T细胞亚群变化。

1协同机制的类型1.3靶向药与siRNA协同阻断信号通路-案例：siRNA沉默表皮生长因子受体（EGFR），抑制下游PI3K/Akt通路；联合EGFR抑制剂（如吉非替尼），双重阻断信号转导，抑制肿瘤增殖。-验证方法：CCK-8检测细胞增殖，Transwell实验检测侵袭能力，Westernblot检测p-EGFR、p-Akt蛋白表达。

2协同效应的评价指标-体外实验：联合指数（CI）通过Chou-Talalay法计算，CI<1表示协同效应；01-体内实验：肿瘤体积抑制率（TIR）、生存期延长率（ILS）、病理学评分（如TUNEL法检测凋亡、CD31检测微血管密度）；02-安全性评价：血液生化指标（ALT、AST、BUN、Cr）、组织病理学检查（心、肝、肾、脾等器官）。0306ONE体外与体内研究进展

1体外研究模型1.1细胞模型-肿瘤细胞系：如乳腺癌MCF-7/ADR（耐药细胞）、肺癌A549、肝癌HepG2，用于评价双药联用的细胞毒性、凋亡率、基因沉默效率；-共培养模型：肿瘤细胞与成纤维细胞（CAF）、TAMs共培养，模拟肿瘤微环境，评价载体对间质细胞的靶向性及免疫调节作用。

1体外研究模型1.33D肿瘤球模型相比2D单层细胞，3D肿瘤球更接近体内肿瘤结构，可评价载体对深层肿瘤细胞的穿透能力和递送效率。例如，在HCT-116结肠癌细胞球中，RGD修饰的双药纳米载体可显著抑制肿瘤球生长，且siRNA的基因沉默效率高于非修饰载体。

2体内研究模型2.1荷瘤小鼠模型-皮下瘤模型：在BALB/c或nude小鼠背部接种肿瘤细胞（如4T1乳腺癌），用于评价肿瘤生长抑制、生物分布（近红外荧光标记载体）、药代动力学；-原位瘤模型：如肝癌原位模型（HepG2细胞接种至肝脏）、肺癌原位模型（A549细胞接种至肺），更真实模拟肿瘤转移和微环境；-转移瘤模型：如尾静脉注射4T1-Luc细胞构建肺转移模型，评价载体对转移灶的治疗效果。

2体内研究模型2.2临床前研究结果-案例1：阳离子脂质体负载siRNA（靶向Bcl-2）和DOX，在4T1荷瘤小鼠中，肿瘤抑制率达78%，显著高于单药组（DOX:42%；siRNA:35%），且肝肾功能无明显异常；01-案例3：肿瘤细胞膜包裹的AuNPs负载siRNA（靶向PD-L1）和吉西他滨，在MC38结肠癌模型中，联合PD-1抗体后，小鼠生存期延长至60天（对照组:25天），且CD8+T细胞浸润增加3倍。03-案例2：RGD修饰的PLGA-PEG纳米粒共递送siRNA（靶向VEGF）和PTX，在A549原位肺癌模型中，肿瘤体积较对照组减少65%，且肿瘤微血管密度显著降低；0207ONE临床转化挑战与未来方向

1临床转化面临的瓶颈1.1规模化生产与质量控制纳米载体的制备（如脂质体、外泌体）需满足GMP标准，但批次间差异（粒径分布、包封率、表面电荷）可能影响疗效；同时，双药共递送的载药量优化、稳定性保存（如冻干工艺）仍需突破。

1临床转化面临的瓶颈1.2生物安全性与免疫原性阳离子载体（如PEI）可能引起细胞毒性，长期使用可诱导抗载体抗体产生；外泌体虽生物相容性好，但供体细胞来源（如人源细胞）可能存在病毒污染风险，需建立标准化的外泌体分离与纯化流程。

1临床转化面临的瓶颈1.3肿瘤异质性与个体化差异不同患者的肿瘤基因表达谱、微环境特征（如血管密度、免疫细胞浸润）差异显著，导致纳米载体的靶向性和递送效率存在个体差异；需开发基于影像学（如MRI、PET）或液体活检的个体化给药方案。

2未来发展方向2.1智能响应型载体设计开发多重响应型载体（如pH/氧化还原/酶三响应），实现肿瘤微环境特异性药物释放，减少对正常组织的毒性；例如，设计“智能开关”载体，仅在肿瘤细胞内同时检测到两种标志物（如高GSH+低pH）时释放药物，提高靶向精准度。

2未来发展方向2.2联合免疫治疗与疫苗开发双药联用纳米载体不仅可递送化疗药与siRNA，还可负载免疫佐剂（如CpG、polyI:C），激活树突状细胞，联合siRNA沉默免疫抑制基因（如PD-L1、CTLA-4），形成“免疫激活-免疫阻断”协同效应；此