多西紫杉醇诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡及耐药前后的蛋白质组学研究

多西紫杉醇诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡及耐药前后的蛋白质组学研究摘要本文旨在探究多西紫杉醇诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡及耐药前后的蛋白质组学变化。采用磺酰罗丹明B（SRB）法检测多西紫杉醇对PC-3细胞增殖的抑制作用，通过胶内差异凝胶电泳（DIGE）技术分析凋亡及耐药前后细胞蛋白质的差异表达，并利用质谱技术鉴定相关蛋白。结果显示，多西紫杉醇对PC-3细胞的半数抑制浓度（IC50）为20nmol/L，诱导凋亡后发现18个差异表达蛋白位点；成功建立耐多西紫杉醇的PC3-R细胞株，其IC50为142nmol/L，是敏感株的7倍，且耐药株与敏感株细胞生长速度和倍增时间相近。对耐药前后细胞进行蛋白质组学分析，鉴定出49种差异蛋白质。本研究为阐明前列腺癌细胞对多西紫杉醇耐药机制提供了线索，也为靶向药物治疗提供了实验依据。关键词多西紫杉醇；前列腺癌PC-3细胞；细胞凋亡；耐药；蛋白质组学一、引言前列腺癌是男性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球范围内呈上升趋势。人体内雄激素的分泌与前列腺癌的发生发展密切相关。对于失去根治手术机会的晚期前列腺癌患者，临床上常采用手术去势（切除睾丸）或药物去势（抗雄激素药物治疗）的方法，阻断体内雄激素的产生及发挥作用，从而抑制癌细胞的生长，在一定程度上延缓病情进展。然而，长期应用抗雄激素药物可能导致激素非依赖性前列腺癌的逐渐转变，此类癌症预后较差。研究表明，当癌细胞转变为激素非依赖性时，患者通常会在18个月内死亡。紫杉醇类药物是近年来用于激素非依赖性前列腺癌的有效化疗药物，其作用机制是通过结合细胞中的微管蛋白来阻断细胞的有丝分裂，从而抑制肿瘤细胞生长。多西紫杉醇作为半合成的紫杉醇类药物，许多研究证实其对前列腺癌细胞具有诱导凋亡作用。临床应用中发现，使用多西紫杉醇治疗前列腺癌，肿瘤体积平均减少至原来的1/3，少数患者可达到完全缓解，近40％的患者经系统治疗后血PSA可下降一半以上。然而，在治疗过程中，肿瘤细胞对多西紫杉醇的耐药问题逐渐凸显，严重影响了治疗效果。国外学者在对激素非依赖性前列腺癌耐药性的研究中，发现了数个基因的过度表达（如bcl-2等）可能与耐药相关。目前国内研究多集中于多西紫杉醇的药效学方面，主要通过应用多西紫杉醇作用于前列腺癌细胞株来观察其生长抑制和诱导凋亡作用。多数研究聚焦于细胞凋亡的形态学变化，而对凋亡及耐药过程中的关键蛋白质研究不足，这些蛋白质是前列腺癌细胞发生凋亡或耐药效应的最终执行者。因此，应用蛋白质组学技术寻找在细胞凋亡及耐药前后含量发生显著变化的关键蛋白质，对于筛选高效低毒抗肿瘤药物及研究肿瘤细胞耐药性形成机制具有重要意义。目前国外研究中蛋白质组学技术主要用于寻找前列腺癌瘤标，如Meehan等发现正常表达于前列腺中的NEDD8、calponin和follistatin相关蛋白在前列腺癌中表达下调或缺失；Senior等通过应用蛋白质芯片技术发现了6种具有潜在意义的前列腺癌的标记物；Alaiya等用二维电泳和生物质谱技术研究了前列腺癌的蛋白质谱，发现数种蛋白表达增高，这些研究为进一步寻找差异蛋白奠定了基础。二、材料与方法2.1实验材料人前列腺癌PC-3细胞系购自中国典型培养物保藏中心。多西紫杉醇购自某生物技术公司，磺酰罗丹明B（SRB）、细胞裂解液等试剂均为分析纯。2.2细胞培养PC-3细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，定期传代。2.3多西紫杉醇对PC-3细胞增殖抑制作用的检测（SRB法）将处于对数生长期的PC-3细胞接种于96孔板，每孔1×10⁴个细胞。培养24h后，加入不同浓度（0、5、10、20、40、80nmol/L）的多西紫杉醇，每组设6个复孔，继续培养48h。弃去培养液，每孔加入10%三氯乙酸（TCA）100μL，4℃固定1h。弃去TCA，用去离子水冲洗5次，晾干。每孔加入0.4%SRB溶液100μL，室温染色30min。弃去SRB溶液，用1%乙酸冲洗5次，去除未结合的染料。待晾干后，每孔加入150μLTris-HCl缓冲液（10mmol/L，pH10.5），振荡10min，使结合的染料充分溶解。用酶标仪在570nm波长处测定各孔的吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率。抑制率（%）=（1-实验组A值/对照组A值）×100%。根据抑制率计算半数抑制浓度（IC50）。2.4多西紫杉醇诱导PC-3细胞凋亡前后蛋白质组学分析2.4.1细胞凋亡诱导用IC50浓度（20nmol/L）的多西紫杉醇处理PC-3细胞48h，诱导细胞凋亡。同时设置未处理的PC-3细胞作为对照组。2.4.2细胞总蛋白提取收集对照组和凋亡组细胞，用预冷的PBS洗涤3次。加入适量细胞裂解液，冰上裂解30min，期间不断振荡。4℃、12000r/min离心30min，取上清液，采用Bradford法测定蛋白浓度，将蛋白浓度调整至相同水平，-80℃保存备用。2.4.3胶内差异凝胶电泳（DIGE）将对照组和凋亡组细胞总蛋白分别用不同的荧光染料（Cy3、Cy5）进行标记，同时设置内标（将对照组和凋亡组细胞总蛋白等量混合后用Cy2标记）。标记后的蛋白样品进行双向凝胶电泳。第一向等电聚焦在IPG胶条（pH3-10）上进行，然后将IPG胶条平衡后转移至SDS-PAGE凝胶上进行第二向电泳。电泳结束后，用Typhoon荧光扫描仪扫描凝胶，获取蛋白质图谱。利用DeCyder软件对图谱进行分析，筛选出差异表达蛋白位点（差异倍数≥2倍且P＜0.05为有统计学意义）。2.4.4差异蛋白鉴定将差异表达蛋白位点从凝胶上切下，进行胶内酶解。酶解后的肽段用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行分析，获得肽质量指纹图谱（PMF）。将所得PMF数据通过Mascot软件在蛋白质数据库中进行搜索匹配，鉴定差异蛋白。2.5耐多西紫杉醇前列腺癌细胞系PC3-R的建立采用小剂量浓度递增法与大剂量冲击相结合的方法诱导PC-3细胞产生耐药。首先，用低浓度（0.1IC50，即2nmol/L）的多西紫杉醇处理PC-3细胞，培养2周后，逐渐增加药物浓度（每次增加2nmol/L），每2周增加一次浓度，直至细胞能够在较高浓度（140nmol/L）的多西紫杉醇中稳定生长。然后，用140nmol/L的多西紫杉醇对细胞进行大剂量冲击培养2次，每次持续48h，筛选出耐药细胞。将耐药细胞命名为PC3-R，常规培养于含140nmol/L多西紫杉醇的RPMI1640培养基中。2.6多西紫杉醇诱导PC3细胞耐药前后蛋白质组学分析2.6.1细胞总蛋白提取分别收集PC-3敏感株和PC3-R耐药株细胞，按照上述方法提取细胞总蛋白，并测定蛋白浓度。2.6.2胶内差异凝胶电泳（DIGE）及差异蛋白鉴定同“2.4.3”和“2.4.4”步骤，对PC-3敏感株和PC3-R耐药株细胞总蛋白进行DIGE分析和差异蛋白鉴定。三、实验结果3.1多西紫杉醇对PC-3细胞增殖抑制作用不同浓度的多西紫杉醇对PC-3细胞的增殖均有抑制作用，且呈浓度依赖性。随着多西紫杉醇浓度的增加，细胞增殖抑制率逐渐升高。通过计算得出多西紫杉醇对PC-3细胞的半数抑制浓度（IC50）为20nmol/L。3.2多西紫杉醇诱导PC-3细胞凋亡前后蛋白质组学分析结果3.2.1双向凝胶电泳图谱分析通过DIGE技术获得了对照组和凋亡组细胞蛋白质的双向凝胶电泳图谱。经DeCyder软件分析，找到表达差异较为明显的18个蛋白质位点。3.2.2差异蛋白鉴定结果对18个差异表达蛋白位点进行质谱鉴定，结果显示，其中8个蛋白表达上调，包括葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、抗氧化蛋白2等；10个蛋白表达下调，包括β-微管蛋白等。3.3耐多西紫杉醇前列腺癌细胞系PC3-R的建立结果成功建立了稳定的多西紫杉醇耐药前列腺癌细胞株PC3-R。PC3-R细胞在含140nmol/L多西紫杉醇的培养基中能够稳定生长，其半数抑制浓度（IC50）为142nmol/L，是敏感株的7倍。且耐药株与敏感株细胞生长速度和倍增时间相近，形态上无明显改变。3.4多西紫杉醇诱导PC3细胞耐药前后蛋白质组学分析结果3.4.1双向凝胶电泳图谱分析通过DIGE技术对PC-3敏感株和PC3-R耐药株细胞总蛋白进行分析，获得了清晰的蛋白质图谱。经软件分析，成功分离鉴定出耐药株PC3-R与敏感株存在差异的49种蛋白质。3.4.2差异蛋白鉴定结果在49种差异蛋白质中，29种蛋白质发生表达上调，20种蛋白质发生表达下调。其中Galectin-1、ATP合酶等参与肿瘤血管的生成；coflin、CathepsinD、Calreticulin等蛋白参与肿瘤的转移；Microtubule-associatedprotein-6、GRP78等参与肿瘤的耐药性调节。四、讨论4.1多西紫杉醇诱导PC-3细胞凋亡的蛋白质组学分析本研究通过蛋白质组学技术发现，多西紫杉醇处理激素非依赖性前列腺癌PC3细胞后，有18个蛋白质位点表达发生显著变化。其中GRP78表达上调，GRP78是内质网应激的标志性蛋白，内质网应激在细胞凋亡过程中发挥重要作用，多西紫杉醇可能通过诱导内质网应激，上调GRP78表达，进而激活细胞凋亡途径。抗氧化蛋白2表达上调，可能是细胞在受到多西紫杉醇刺激后，为应对氧化应激而做出的一种自我保护反应。β-微管蛋白表达下调，多西紫杉醇的作用机制是与微管蛋白结合，抑制微管解聚，β-微管蛋白表达下调可能影响了多西紫杉醇与微管的结合，从而影响细胞的有丝分裂，诱导细胞凋亡。这些差异蛋白的发现为进一步研究紫杉醇耐药的分子机制提供了理论依据。4.2耐多西紫杉醇前列腺癌细胞系PC3-R的建立及意义本实验成功建立了耐多西紫杉醇的前列腺癌细胞株PC3-R，其IC50为敏感株的7倍，且耐药株与敏感株细胞生长速度和倍增时间相近，形态上无明显改变。该耐药细胞株的建立为后续深入研究前列腺癌对多西紫杉醇耐药机制提供了重要的实验材料。通过对耐药株和敏感株进行蛋白质组学分析，有望发现与耐药相关的关键蛋白，为克服耐药提供新的靶点。4.3多西紫杉醇诱导PC3细胞耐药的蛋白质组学分析在对PC3细胞耐药前后蛋白质组学分析中，鉴定出49种差异蛋白质。其中Galectin-1、ATP合酶等参与肿瘤血管的生成，肿瘤血管生成对于肿瘤细胞的生长和转移至关重要，耐药细胞中这些蛋白表达上调，可能促进了肿瘤血管生成，为肿瘤细胞提供更多营养和氧气，从而增强了肿瘤细胞的存活能力。coflin、CathepsinD、Calreticulin等蛋白参与肿瘤的转移，这些蛋白表达的改变可能影响了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，使得耐药细胞更容易发生转移。Microtubule-associatedprotein-6、GRP78等参与肿瘤的耐药性调节，GRP78在耐药株中表达变化与凋亡时一致，提示其在多西紫杉醇诱导的细胞凋亡和耐药过程中可能都发挥重要作用，Microtubule-associatedprotein-6表达改变可能影响了微管的稳定性，进而影响多西紫杉醇的作用效果，导致细胞产生耐药。这些差异蛋白的发现为进一步阐明前列腺癌细胞对多西紫杉醇耐药产生的机制提供了线索，也为发现前列腺癌转移及晚期激素非依赖性前列腺癌的靶向药物治疗提供实验依据。五、结论本研究通过蛋白质组学技术，比较了多西紫杉醇诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡及耐药前后的蛋白质表达差异。在凋亡研究中，发现了