流感病毒标本采集、运输、分离检测及注意事项

流感病毒标本采集、运输、

分离检测及注意事项PPT汇

报

人：

XXXX2月15日02标本采集规范04

标本包装与运输01CONTENTS目录03引言与背景标本保存与预处理05CONTENTS目录07病毒分离与检测技术数据管理与总结展望质量控制与生物安全0601引言与背景疫情防控的关键环节及时、准确检测流感病毒是疫情防控

的重要举措，有助于早期发现病例、

实施隔离措施，减少院内感染和社区

传播风险。流行病学研究的基础通过对流感病毒标本的采集、分离和

检测，可掌握病毒的遗传特点、地域

分布及变异情况，为疫苗研发、防控

策略制定提供科学数据支持。疾病负担与危害流感病毒可引起季节性流感疫情，导

致高热、头痛、咳嗽等症状，严重时

引发肺炎、心肌炎等并发症，对人类

健康造成严重威胁。临床治疗的重要依据明确流感病毒类型和亚型，能帮助医

生选择针对性抗病毒药物，如奥司他

韦等，避免抗生素滥用，提高治疗效

果，尤其对高危人群意义重大。流感病毒的公共卫生意义杂质与抑制剂的干扰及消除痰液等样本需经蛋白

酶K(2mg/mL)

或专

用消化液预处理，55℃震荡消化30-60

分钟以去除黏液等杂

质。避免血红蛋白、

唾液等PCR抑制剂影

响，可通过稀释复测

或优化提取方法消除

干扰。灭活处理对病毒活性的影响采用含1%TritonX-100或0.5%β-丙内酯

的灭活缓冲液，或56℃水浴30分钟，可

在确保病毒完全失活、

保障操作人员安全的

同时，最大程度保留

病毒核酸完整性，避

免因灭活不当导致假

阴性。核酸提取效率的关键因素优先选择磁珠法或柱

式法核酸提取试剂盒，

确保RNA回收率高于

90%且无抑制剂残留。

每批次提取需设置阴

性对照和提取对照，排除交叉污染，同时

检测人源RNaseP基因

(Ct

值≤30)验证样

本质量。标本预处理的重要性标本处理是连接采集与检测的关键环节，直接影响病毒活性、核酸完整性及后续检

测的灵敏度和准确性。

规范处理可有效去除

杂质、抑制核酸降解，

为高质量检测结果奠

定基础。标本处理对检测结果的影响提升疫情防控效率标准化流程有助于快速、高效地完成标

本从采集到检测的全过程，为流感疫情

的早发现、早诊断、早治疗和及时防控

提供有力支持。确保数据可比性与溯源性统一规范的操作方法使得不同实验室、不同批次的检测数据具有可比性，完整

的操作记录便于样本和检测结果的追溯，

为流行病学研究提供可靠数据。降低生物安全风险流感病毒具有传染性，规范操作可有效

防止样本泄漏、交叉污染，保护操作人

员和环境安全，避免实验室感染和病毒

扩散。保障检测结果准确性样本采集、运输、分离检测各环节的规

范操作是确保流感病毒检测结果准确可

靠的基础，错误操作可能导致假阴性或

假阳性，延误诊断与疫情控制。规范操作的必要性与目标02标本采集规范采样时机选择原则疑似病例应在出现症状后48小时内采集样本，此时病毒载量最高，可获取最佳检测

效果；重症患者尽可能在发病初期采集，持续发热或症

状加重者建议每3-5天采集一

次，连续采集3-5次。生物安全防护规范采样人员需佩戴N95级或更高级别防护口罩、护目镜、防护服及双层手套，必要时加

穿鞋套和防护面罩；操作环境应通风良好，采样后按生物安全标准消毒操作区域，妥善处理医疗废物。采样对象界定标准主要针对出现发热、咳嗽、喉咙痛等症状的甲型H1N1流感疑似病例；密切接触者也应进行采样以排除病毒传播

风险，做到早发现、早诊断、早治疗。无菌操作核心要求采集过程中必须严格遵循无菌操作规程，使用一次性无菌采集器具，避免交叉污染；采集后立即将样本置于含有保存液的试管中，以减少病

毒降解，确保样本纯净度。采集基本原则与通用要求采样时机与对象选择最佳采样时间窗

核心采样对象界定

动态采样频率要求

特殊人群采样策略疑似病例出现症状后48小

时内采集，此时病毒载量

最高，可获取最佳检测效

果；重症患者应尽可能在

发病初期采集样本。主要针对甲型H1N1流感疑

似病例，包括发热、咳嗽、喉咙痛等症状者；密切接

触者也需采样以排除病毒

传播风险。免疫功能低下患者病毒脱

落时间可能延长，可适当

延长采样窗口至发病后10-14天，但需结合临床

症状综合判断。对于持续发热或症状加重

者，建议每3-5天采集一

次样本，连续采集3-5次，

以便观察病毒载量变化和

治疗效果。样本处理与标记迅速将拭子放入含病毒保

存液的试管中，折断多余

手柄，旋紧管盖。在试管

上清晰标记患者姓名、样

本类型、采集时间等信息，

立即低温保存。拭子插入与采样将聚酯纤维拭子沿鼻中隔

平行方向缓慢插入鼻咽部，

直至遇到轻微阻力(约鼻

尖至耳垂距离),旋转拭

子3-5圈，并停留数秒以

充分吸附分泌物。操作过采集前准备患者头部微仰，清除鼻腔

分泌物。操作者佩戴一次

性手套、口罩和面罩，确

保环境通风良好。准备无

菌聚酯纤维拭子、含病毒

保存液的试管、压舌板操作后处理将使用过的防护用品按生

物安全废物规范处理，操

作者进行手部消毒。清洁

消毒操作区域，记录采样

过程及患者情况。(如需)等物品。

程需轻柔，避免损伤鼻腔黏膜。鼻咽拭子采集操作流程咽拭子采集操作规范患者张口发"啊"音，用压舌板轻压舌根，避免触碰舌

面或牙齿。使用聚酯纤维拭子轻柔擦拭双侧扁桃体隐

窝及咽后壁黏膜，旋转并停留数秒后取出，立即放入

含病毒保存液的采样管中。特殊人群采样注意事项痰液采集方法与质量控制指导患者深呼吸后用力咳嗽，留取第一口痰液于无菌

容器中，避免混入唾液。采集量至少1毫升，对于无

法自然咳痰者，可用无菌吸痰管吸取。采集后需肉眼

观察痰液性状，确保无明显唾液污染。采样后即时处理要求每例患者更换一次性压舌板及采样拭子，使用后的防

护用品按生物安全废物处理。采样管立即旋紧密封，

标注患者信息、采样时间及样本类型，30分钟内置于

2-8℃冷藏环境待运。儿童采样时需助手固定头部，采用游戏化引导配合；老年及卧床患者可侧卧位防止误吸；不合作患者必要时在镇静状态下采样。免疫抑制患者需严格无菌操作，

采样后加强手卫生及环境消毒。咽拭子与痰液采集技术要点婴幼儿与新生儿选择细软拭子，优先鼻咽采样以减少刺激，需两

名操作者配合固定体位，避免拭子误入气道。免疫抑制患者严格无菌操作，采样前后加强手卫生，避免引发

继发感染，样本需单独标记并优先检测。老年及卧床患者评估其吞咽反射能力，采样时采用侧卧位防止误

吸，虚弱者缩短采样时间并监测生命体征。精神障碍或躁动者必要时在镇静状态下采样，或使用约束工具确保

安全，同时保障患者尊严与隐私权。不合作儿童可采用游戏化引导，由助手固定头部，快速完成

采样以减少哭闹导致的误差。特殊人群采样注意事项0

10305020403标本保存与预处理抗生素添加标准需添加庆大霉素(终浓度0.1mg/ml)

和抗真菌药物(终浓度2mg/ml),

抑制细

菌和真菌污染，添加后需重

新调整pH至7.4。配制与分装要求配制好的保存液应分装为3-

4ml/

管，121℃高压灭菌20分

钟，-20℃冻存备用，避免反复冻融影响效能。常用保存液类型推荐使用pH7.4～7.6的Hanks液

、Eagle's

液或DMEM培养基

作为基础保存液，可有效维

持病毒活性。特殊样本保存液调整粪便等样本需将抗生素浓度

提高10倍，如青霉素终浓度

2000U/mL、链霉素2mg/mL,

以应对高菌量环境。保存液选择与配制标准短期保存温度规范标本采集后若48小时内送检，应置于2-8℃冷

藏环境，使用带温度监控的冷藏箱，避免温度

波动超过±1℃。特殊标本储存处理储存环境监控要求储存设备需配备温度记录仪，每日至少记录2

次温度，

-70℃冰箱允许波动范围为-65℃至-

80℃,2-8℃冰箱不超过5℃至7℃,异常情况

需立即启动备用设备。长期储存温度要求需长期保存或超过48小时未送检的标本，应分

装后存放于-70℃或以下超低温冰箱，严禁在-

20℃条件下保存，以防病毒核酸降解。痰液等粘稠标本需先加入等量病毒保存液(含

青霉素2000U/mL+链霉素2mg/mL),混匀后按

上述温度条件储存，保存液与标本体积比不低于1:1。温度控制与储存条件分装容器选择标准分装操作技术要点应使用带螺旋盖的耐低温无菌塑料管，推荐容积为2-

5mL,

确保密封性良好且可

耐受-70℃及以下低温环境。在生物安全柜内进行分装，

每管样本量控制在1-3mL,避免样本溢出。同一原始标

本至少分装2管，

一管用于

检测，

一管备用。标识信息内容要求直接在容器管壁用油性记号

笔标注：唯一标本编号、样

本类型(如鼻咽拭子)、患

者姓名、采样日期(2025-

XX-XX)。分装后保存条件分装完成后立即放入密封袋，

2-8℃暂存不超过4小时，如

需长期保存应置于-70℃超低温冰箱，避免反复冻融。标本分装与标识规范样

本

预

处

理

操

作

规

范呼吸道标本需在生物安全柜内进行预处理，痰液标本应加入等体积蛋白酶K缓冲液(终浓度2mg/mL),55℃震荡消化30-60分钟至完全液化；鼻咽/咽拭子样本需充分混匀后低速离心(800-1000rpm,5分钟),取上清液用于后续检测。灭

活

剂

选

择

与

浓

度

标

准推荐使用含1%TritonX-100或0.5%β-丙内酯的灭活缓冲液，确保病毒完全失活的同时保留核酸完整性。对于高浓度病毒液样本，可采用56℃水浴灭活30分钟或室温下0.2%胍盐溶液处理60分钟，灭活后需立即冷却至4℃终止反应。灭

活

效

果

验

证

方

法灭活效果需通过双重验证：①接种MDCK细胞培养72小时观察无细胞病变；②实时荧光RT-PCR检测病毒核酸Ct值与灭活前一致，且无活病毒复苏现象。每批次灭活样本需记录灭活时间、温

度及操作人员信息，留存验证报告至

少3年。预处理后样本保存条件预处理后的样本应立即进行核酸提取，若需短暂保存应置于2-8℃环境(不超过24小时),长期保存需分装后存放于-70℃超低温冰箱，避免反复冻融(≤3次)。分装体积以单次检测用量

为宜(通常50-100μL/管),并使用耐低温螺口管密封。预处理与灭活技术要求04标本包装与运输主容器技术规范采用带螺旋盖的耐低温塑料管，直接盛装标本，

需确保密封防泄漏。液体标本量超过10mL时应使

用双层主容器，管身用油性记号笔标注编号、种

类、姓名及采样日期。外包装合规标准使用符合UN2814标准的硬质瓦楞纸箱或塑料箱，表面清晰标注生物危害标识(红色三叶型标志)、

"感染性物质"标签、收发货信息及应急联系人。需通过1.2米跌落试验验证无泄漏。辅助容器防护设计外层为硬质塑料盒或泡沫箱，内部填充吸水材料

(如海绵、纤维素棉)以吸附泄漏物，具备缓冲

防震功能。主容器放入后需固定，防止运输中晃

动，确保与辅助容器间无空隙。包装操作流程将主容器放入塑料密封袋(每袋一份标本),送

检单单独放入另一塑料袋；依次装入辅助容器和

外包装，确保三层包装完整。操作全程在生物安

全柜内进行，佩戴双层手套和护目镜。三层包装系统构建要求03020401温度控制与监测要求样本需在2-8℃条件下48小时内运送，超过48小时应

-70℃以下保存。运输全程使用冷链箱配备温度记录

仪，数据需可追溯72小时以上，确保温度波动不超

过±1℃。应急处置与报告机制发生泄漏时立即隔离现场，运输人员穿戴全套PPE,

用5%过氧乙酸消毒处理泄漏物。2小时内向属地卫生

健康部门和疾控中心报告，并配合开展环境采样与

人员健康监测。三层包装体系规范主容器采用密封螺口塑料管，直接盛装样本并标注

信息；辅助容器填充吸水材料防震防漏；外包装为

硬质防破损箱体，表面清晰标注生物危害标识、UN2814编号及收发货信息。人员资质与操作规范运输人员需同时具备生物安全三级培训资质和危险

品运输从业资格，熟悉泄漏应急处置流程。样本装

箱前需核查包装完整性、温控设备运行状态及运输文件与实物一致性。UN2814运输标准实施要点DITABLESTROKE异常温度应急响应机制当温度超出阈值时，设备立即触发声光报

警并推送短信至责任人手机，需在30分钟

内排查故障(如补充冰排或更换冷链箱),

同时记录应急处置全过程。温度监控标准与范围根据WS/T852-2025《感染性物质运输标准》,流感病毒标本运输需全程维持2-8℃

低温环境，实时监控温度波动范围不得超

过±1℃。多节点温度记录设备采用具有GPS定位功能的冷链箱，内置温度传感器每15分钟自动记录一次数据，支持

蓝牙/4G实时传输至监控平台，数据可追溯

72小时以上。运输后温度数据验证接收方需核对运输全程温度记录曲线，确

认无超温时段(≤8℃且≥2℃)方可签收，

异常数据需启动样本质量评估并记录备案。冷链运输温度监控方案文件填写规范送检单中患者职业参

照传染病汇报卡选项

填写，标本种类按规

定代码标注(如A鼻

咽拭子、

B鼻咽吸取

物等),标本量需注

明，填表人员及送样

时间需清晰记录并加

盖单位公章。交接流程与记录运输至目的地后，需

与接收方双人核对样

本数量、状态，签署

《生物样本运输交接

单》,全程录像留存，

交接记录至少保存规

定期限，确保责任可

追溯。运输文件构成包括疑似人感染甲型

H1N1流感病例标本送

检单(含患者信息、

标本种类、采集日期

等)、生物危害运输

标签、接收单位信息

及应急联系人等，需

确保信息完整准确。文件与标本隔离送检单等文件应放入

单独塑料袋内，不得与标本放置在一起，

避免标本污染文件导

致信息模糊或丢失，

确保运输过程中文档

可追溯。运输文件与交接管理05病毒分离与检测技术逆转录与扩增体系配置将提取的RNA通过逆转录酶转化为cDNA,随后加

入流感病毒特异性引物(终浓度400nM)和TaqMan探针(终浓度200nM),

配置包含预混反

应缓冲液、逆转录/聚合酶混合液的Real-timeRT-PCR反应体系。采用含1%TritonX-100或0.5%β-丙内酯的灭活缓

冲液处理样本，56℃水浴孵育30分钟或室温静置

60分钟以确保病毒完全失活，灭活后立即冷却至

4℃终止反应。在生物安全柜内，使用磁珠法或柱式法核酸提取

试剂盒，从预处理后的样本中提取病毒RNA,确

保RNA回收率高于90%且无抑制剂残留，同步检测

人源RNaseP基因确认样本质量

(Ct

值≤30)。Ct值<35.0且出现典型S型扩增曲线判定为阳性；

Ct值>38.0或无数值且无指数增长期判定为阴性；35.0≤Ct

值≤38.0为可疑，需对原标本重复检测，

重做结果Ct值≤38.0且扩增曲线有明显起峰判定

为阳性，否则为阴性。第一阶段反转录45℃、5min;第二阶段预变性95℃、5min;第三阶段95℃、15s,57℃、34s,40个循环，在第三阶段每个循环的退火延伸时收

集荧光，荧光检测模式根据探针标记的荧光报告

基团设置。核酸检测

(RT-PCR)

操作流程扩增程序设置与荧光检测

结果判定标准样本预处理与灭活

病毒RNA提取VirusdetectionTechniqueViral

cells检测操作与结果判读规范将处理后的样本滴加至检测卡加样孔，按试剂说明书

控制反应时间(通常15-20分钟)。结果判读以质控线

(C线)和检测线

(T

线)显色为准：

C

、T线均显色为

阳性，仅C线显色为阴性，无C线显色则检测无效需重

做。检测原理与应用特点采用免疫层析技术，通过标记抗体与流感病毒表面蛋

白(如血凝素或神经氨酸酶)特异性结合形成可见免

疫复合物，实现定性检测。操作便捷，15-30分钟出结

果，适合门诊初筛，但灵敏度低于核酸检测，阳性可

支持诊断，阴性不能排除流感。质量控制与局限性说明每批次检测需包含阴、阳性对照，监控试剂有效性。

注意检测灵敏度受样本质量、病毒载量影响，发病48

小时后采样可能因病毒数量减少导致假阴性。建议结

合临床症状，对阴性但高度疑似病例进行核酸检测复核。样本采集与前处理要求常用鼻咽拭子或口咽拭子。鼻咽拭子应沿鼻中隔平行

插入至鼻咽部旋转停留数秒；咽拭子需擦拭双侧扁桃

体隐窝及咽后壁，避免触碰舌面。采样前30分钟内禁

止进食、饮水，采样后立即将拭子放入含保存液的试

管中，折断多余手柄并密封。抗原检测关键技术要点orbent

assayNAATS)病毒收获与盲传标准收获前冻融细胞1-2次

以提高滴度。若7天未

出现CPE,收获维持液

做HA试验阴性者，需盲

传1-2代，仍阴性则判

定分离失败。标本接种与培养条件将预处理样本接种于MDCK细胞，33-35℃培

养箱培养。每日观察细

胞病变

(CPE),

特

征

为细胞肿胀圆化、间隙

增大、脱落，出现3+或

4+病变时收获。质量控制与生物安全操作需在BSL-2生物安

全柜内进行，每批次设

阴性对照。使用合成纤

维拭子采集的标本优先

接种，避免棉拭子影响

病毒分离效率。细胞准备与材料要求使用75-90%成片的MDCK细胞，T-25

细胞瓶培养。需配备TPCK处理胰酶、HEPES缓冲液、D-MEM培

养基及青链霉素等试剂，

确保试剂在有效期内。MDCK细胞分离培养方法鸡胚选择与预处理标准选用9-11日龄活胚，照蛋灯检视确保血管清晰、胎动明显，淘汰死胚、未受精胚及发育不全胚。标记气室与尿囊界限，70%-75%酒精消毒蛋壳表面。病毒收获与鉴定要求收获前4℃静置4小时以上，无菌操作收取尿囊液

和羊水，混合后进行红细胞凝集试验

(HA)

。HA滴度≥8时直接做血凝抑制试验

(HI)定型；<8

时盲传1-2代，仍阴性则判定为分离失败。双腔接种操作流程气室端开10×6mm窗口，滴加液体石蜡后照蛋定位，

16号针头刺入羊膜腔注射100μ1标本(见胚胎随针头晃动),退针至尿囊腔注入另100μ1,医用

胶布封口后33-35℃培养72小时。生物安全操作要点接种与收获全过程在生物安全柜内进行，使用一

次性注射器和吸管，污染废弃物按感染性废物处

理。鸡胚培养期间每日观察，24小时内死亡胚视

为非特异性死亡弃去。鸡胚接种与病毒收获规范06质量控制与生物安全操作流程标准化管理建立标准化SOP文件，涵盖样本采

集、运输、处理、检测各环节关键

操作点，如核酸提取区与扩增区物

理隔离，使用带滤芯吸头防止交叉污染。定期对检测人员进行培训和

考核，每季度开展“泄漏-火灾-交

通事故”联合应急演练，提升风险

处置能力。仪器设备校准维护实时荧光定量PCR仪每日检测前执

行光学校准、温度稳定性测试及流

体系统压力检查，确保运行参数处于最佳状态。定期对超低温冰箱、

生物安全柜、离心机等设备进行性

能验证，校准记录至少保存3年，设备故障维修后需重新校准方可使

用

。每批次检测设置阴性、弱阳性、强

阳性对照，监控检测下限与特异性，

记录Ct值波动范围(±1.5为可接受标准)。采用磁珠法或柱式法核

酸提取试剂盒，确保RNA/DNA回收

率高于90%且无抑制剂残留，同步

检测人源β-actin或RNaseP基因确

认样本质量合格

(Ct

值≤30)。实验室需定期参与国家或省级流感

监测网络组织的室间质评，通过CAP认证样本比对试验，确保检测

人员结果判读一致性。每年至少参加1次飞行检查(不提前通知),

考核从样本接收、检测到报告发布

的全流程规范性。实验室质量控制体系构建室内质控标准建立

室间质评与能力验证装备使用质量控制使用前检查防护服有无破损、

口罩气密性(做呼气试验)、

手套完整性；每批次防护装备

需提供生产厂家资质及灭菌合

格证明，使用后记录装备型号

及使用时间。穿戴流程与顺序依次进行手卫生→戴医用防护

口罩→戴帽子→穿防护服→戴

内层手套→穿防护鞋套→戴外

层手套→戴护目镜/面罩，每步

操作后检查装备密封性。HalrNerGoggles/Eyes-Vsor

sSurocal

Maskboaton

GowmDisposableGlovesShoesCover脱卸注意事项在指定缓冲区按"外层手套→护

目镜→

防护服→

内层手套→

口

罩→帽子"顺序脱卸，每脱一件

进行手消毒，污染面避免接触

清洁区域，所有废弃物按感染

性废物处理。基础防护装备配置包括一次性医用防护服、N95及

以上级别呼吸器、双层乳胶手

套、护目镜或面罩、防护鞋套，

需确保所有装备符合生物安全

二级及以上标准。个人防护装备

(PPE)

使用规范HaimetGoggies

lovesb

coatface

SMedical个人防护规范操作人员必须穿戴N95级以上防护口

罩、护目镜、双层乳胶手套、防护

服及鞋套，在安全柜内完成所有样

本操作，避免手臂频繁进出柜内破

坏气流。操作后维护要求操作结束后关闭前窗至安全位置，继续运行风机30分钟，对柜内表面、

工作台及器械进行彻底消毒，记录

运行参数及消毒情况，定期进行生

物安全柜性能检测(至少每