5-己二酮对小鼠卵巢直径的影响

前言2，5-己二酮(2,5-Hexadione，2,5-HD)是正己烷在体内的最终代谢产物和终毒物。正己烷属直链饱和脂肪烃类，室温下为微臭液体REF_Ref25425\r\h错误!未找到引用源。，易溶于氯仿、乙醚和乙醇等有机溶剂，所以通常被当做有机清洁剂或胶粘剂生产中的稀释剂应用于工业生产中。正己烷具有高挥发性、高脂溶性。它主要通过呼吸道和皮肤进入人体，并可分布在全身，且在体内具有一定的蓄积作用，长期接触主要累及神经系统，以多发性周围神经病变最为重要REF_Ref25523\r\h错误!未找到引用源。。近几十年来，由于我国工业生产发展迅速，生产过程中接触正己烷工人的数量大量增加，由于接触正己烷发生慢性中毒的事件时常发生[3,4]。目前有研究发现，正己烷除对神经系统有明确损害外，其还对生殖系统具有毒性，例如导致男性性欲下降、精原细胞受损、精子数目减少、活动能力下降及睾丸萎缩等[5-7]，接触正己烷的女工会出现出现停经，月经失调，生育能力降低等情况[8,9]。卵巢作为女（雌）性生殖腺，具有生殖和内分泌的双重功能，负责产生卵母细胞和分泌性激素。卵泡的储备是有限的，且出生后不可更新。以人类的卵泡发育为例，简述卵巢卵泡的生长发育如下。在胚胎期6~8周，原始生殖细胞不断分裂至约60万个，并在胚胎期11~12周时第一次减数分裂成为初级卵母细胞，胚胎期16~20周时，生殖细胞数目达到顶峰，约600万~700万个，此后卵泡不断退化闭锁，出生前约余200万个，至青春期只余30万个。从青春期至绝经期，卵巢的形态与功能呈现的周期性变化，称为卵巢周期。原始卵泡（primodialfollicle）又称为始基卵泡，是卵巢内体积最小数量最多的卵泡，位于皮质浅层，由一个初级卵母细胞和周围一层扁平的卵巢颗粒细胞组成。进入青春期后，在垂体周期性分泌的促性腺激素（gonadotropins，Gn）的影响下，卵巢按月经周期呈周期性排卵。原始卵泡首先发育为初级卵泡（primaryfollicle）并逐渐移向皮质深部，卵巢颗粒细胞由扁平分化为柱状或立方并增殖为多层，初级卵母卵母细胞体积增大；初级卵泡继续生长分化，卵巢颗粒细胞进一步增殖，初级卵母细胞达到最大体积，成为次级卵泡（secondaryfollicle）。初级卵泡和次级卵泡统称为窦前卵泡（preantralfollicle）或生长卵泡（growingfollicle）。在雌激素和卵泡刺激素（folliclestimulatinghormone，FSH）作用下，次级卵泡发育成为窦卵泡（antralfollicle），一组窦卵泡群经过募集、选择，出现一个优势卵泡（dominantfollicle），进一步发育形成排卵前卵泡，而其余卵泡逐渐退化闭锁，在一系列激素的协同作用下，卵泡排出，黄体形成、排出，完成一次月经周期。除极少数卵泡（约占总数的0.1%）可发育成熟并排卵外，绝大多数卵泡均退化成为闭锁卵泡，正常女性一生仅能排出400~500个卵泡。作为女性的基本生殖单位和卵细胞储备的唯一形式，原始卵泡减少是引起卵巢早衰(prematureovarianfailure，POF)主要的原因之一REF_Ref25784\r\h错误!未找到引用源。。已有研究发现，2，5-己二酮诱导颗粒细胞凋亡增加：ZHANG等REF_Ref25814\r\h错误!未找到引用源。研究发现，卵巢颗粒细胞凋亡率与2，5-己二酮浓度呈正相关（相关系数为0.969，P<0.01），且2，5-己二酮暴露组卵巢颗粒细胞活力均受到抑制，并且，研究观察到体内正己烷及体外2,5-HD暴露抑制了卵母细胞的成熟并促其凋亡增加[12]。本研究将进一步探究2，5-己二酮对卵泡的损伤作用。课题组前期研究结果中观察到2，5-己二酮抑制新生小鼠卵巢卵泡发育，导致初次卵泡构成比增加，次级卵泡构成比减少。本实验将在前期实验的基础上，在体外水平上探究2，5-己二酮是否影响卵泡的健康状况，进一步认识2，5-己二酮的卵巢卵泡生长发育毒性作用。1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验耗材Transwell24孔培养板Coring公司1ml、200μl、10μlTip头Axygen公司1.1.2实验的仪器与设备EASYpurell超纯水系统美国Barnsyeaed公司超净台上海力申科学仪器有限公司4℃低温冰箱中国海尔集团80℃超低温冰箱中国海尔集团80℃超低温冰箱美国Thermo公司GZX907MBE数显鼓风干燥箱上海博讯实业有限公司立式压力蒸汽灭菌器上海博讯实业有限公司DK-8D电热恒温水槽上海精密实验设备厂全自动脱水机湖北孝感有限公司BM-VⅧ生物组织包埋机孝感市宏业医用仪器有限公司回转式石蜡切片机上海仪表厂普通光学显微镜（BH-200型）日本OLYMPUSOLYSIA-BioReport图像拍摄系统日本OLYMPUS1.1.3实验试剂2，5-己二酮美国SIGMA公司BSAPhygene公司苏木素染液福州飞净生物科技有限公司伊红染液福州飞净生物科技有限公司α-MEM培养液美国GIBCOBRL公司1.2研究方法1.2.1实验动物SPF级ICR小鼠，6日龄，体重25±2g，购自福建医科大学实验动物中心，生产许可证：SCXK（闽）2016-0002。小鼠均采取自由体位，室内湿度均由中央空调控制温度为20~26℃，相对湿度为50%~70%，光照明暗交替12h/d。1.2.2卵巢剥离及体外卵巢培养（1）培养液的预处理在超净台中打开Transwell24孔培养板，每孔加入1mlα-MEM培养液，用灭菌处理后的镊子夹取聚碳酸酯膜，放置于培养液上，将培养板置于CO2培养箱（37℃,5%CO2）中预孵育1h。（2）卵巢剥离及体外培养将6日龄ICR小鼠皮肤酒精消毒处理后，采用颈椎脱臼法处死。在无菌条件下，于解剖板上打开腹部皮肤和组织，快速取下卵巢-输卵管复合物，放入已37℃预热的L-15培养液中。在体式显微镜下用显微镊和21号针头小心快速地剥离输卵管和其他粘连组织，分离出卵巢。用显微镊轻轻取出卵巢，小心转移至预孵育的α-MEM培养液中，置聚碳酸酯膜上，培养24h后加入剂量分别为0、10、30、90、150µmol/L（µM）的2,5-HD，连续染毒4天。（3）卵巢组织的固定包埋和切片培养结束的卵巢用4%中性甲醛缓冲液固定过夜，脱水、包埋，步骤如下：70%乙醇1h→80%乙醇3h→90%乙醇2h→95%乙醇16h→100%乙醇145min→100%乙醇II45min→二甲苯I5min→二甲苯II5min→石蜡I10min→石蜡II30min→石蜡包埋。用回转式石蜡切片机将组织块5μm连续切片，60℃烤片过夜。每个卵巢标本取10张切片，每个剂量组随机选6个标本。（4）卵巢的HE染色取小鼠卵巢的切片进行如下操作：二甲苯I5min→二甲苯Ⅱ5min→100%乙醇I5min→100%乙醇Ⅱ5min→95%乙醇5min→80%乙醇5min→70%乙醇5min→苏木素染液6min→流水冲洗15min→1%盐酸乙醇分化2s→流水冲洗5min→镜下观察染色情况→伊红染液15下→流水冲洗2min→70%乙醇20s→80%乙醇20s→95%乙醇20s→100%乙醇I20s→100%乙醇Ⅱ5min→二甲苯5min→中性树脂封片。1.2.3资料及数据的收集（1）组织切片的选取：选择切片完整，染色效果良好的切片。（2）卵巢直径的测量应用OLYSIA-BioReport图像拍摄系统，拍摄照片，测量卵巢直径。卵巢直径测量的方法：每个卵巢测量2条直径，第一条经过卵巢的中心，第二条为第一条的垂直平分线。然后求这两条直径的平均值，即作为卵巢直径。（3）计数卵泡和不健康卵泡的个数并计算不健康卵泡构成比应用OLYSIA-BioReport图像拍摄系统，拍摄照片，计数各级卵泡及各级不健康卵泡的个数并计算总不健康卵泡构成比和各级不健康卵泡构成比。卵泡纳入标准REF_Ref17639\r\h错误!未找到引用源。：在光学显微镜下，能看到卵母细胞细胞核的卵泡才进行计数。卵泡分类标准REF_Ref17639\r\h错误!未找到引用源。：①原始卵泡：单层扁平状的颗粒细胞包裹着一个初级卵母细胞；②初级卵泡：单层立方状的颗粒细胞包裹着一个初级卵母细胞的卵泡；③次级卵泡：两层及以上立方状的颗粒细胞包裹着一个初级卵母细胞的卵泡。不健康卵泡纳入标准[1,14]：卵母细胞或卵巢颗粒细胞出现细胞水肿、染色质凝聚、胞质嗜酸性增强、胞质减少，细胞器致密、细胞皱缩、细胞膜破裂、细胞形态异常等情况，均纳入不健康卵泡。总不健康卵泡构成比=总不健康卵泡个数÷总卵泡个数式（1）各级不健康卵泡构成比=各级不健康卵泡个数÷各级卵泡个数式（2）（4）计数卵母细胞不健康卵泡和颗粒细胞不健康卵泡的个数并计算其构成比卵母细胞不健康卵泡构成比=总卵母细胞不健康卵泡个数÷总卵泡个数式（3）各级卵母细胞不健康卵泡构成比=各级卵母细胞不健康卵泡个数÷各级卵泡个数式（4）颗粒细胞不健康卵泡构成比=总颗粒细胞不健康卵泡个数÷总卵泡个数式（5）各级颗粒细胞不健康卵泡构成比=各级颗粒细胞不健康卵泡个数÷各级卵泡个数式（6）1.2.4数据的统计方法所有数据采用SPSS21.0进行统计分析。不健康卵泡构成比应用卡方检验。卵巢直径数据以（均数±标准差）来表示，经过正态性检验和方差齐性检验，进行单因素方差分析，方差齐，则采用LSD法进行事后两两比较，若方差不齐，则采用Dunnet'T3法，检验水准α=0.05。2结果与分析2.1HE染色结果图1为小鼠卵巢HE染色结果，各组的不健康卵泡以黑色箭头标注。观察卵巢HE染色结果，可见随着2，5-己二酮暴露剂量增大，不健康卵泡逐渐增多，表现为染色质凝聚、胞质嗜酸性增强、胞质减少等，在90μmol/L和150μmol/L2，5-己二酮暴露组尤为明显，出现了大量皱缩、细胞形态异常的卵母细胞。图1光镜下观察卵巢卵泡的结构2.22，5-己二酮对小鼠卵巢直径的影响图1为小鼠卵巢HE染色结果，如表1结果显示：2，5-己二酮对小鼠卵巢直径大小的影响并不明显，2，5-己二酮暴露组卵巢直径的差异无统计学意义（P>0.05）。表SEQ表\*ARABIC12，5-己二酮对小鼠卵巢直径大小的影响组别（μmol/L）N直径(mm)对照组150.87±0.0810130.79±0.1430180.90±0.1190150.83±0.12150150.80±0.21图SEQ图\*ARABIC12，5-己二酮对小鼠卵巢直径大小的影响2.32，5-己二酮对小鼠卵巢不健康卵泡构成比的影响如表2、图3所示，与对照组相比，2，5-己二酮暴露组不健康卵泡的构成比均有不同程度的改变。（1）原始卵泡不健康卵泡构成比：对照组原始卵泡不健康卵泡构成比仅占0.5%，而2，5-己二酮暴露组均明显高于对照组（P<0.05），在150μmol/L2，5-己二酮暴露组，这一比例甚至达到了23.7%。（2）初级卵泡不健康卵泡构成比：30μmol/L、90μmol/L和150μmol/L2，5-己二酮暴露组的初级卵泡不健康卵泡构成比分别为23.2%、39.7%、41.4%，与对照组（9.3%）相比明显升高（P<0.05），尤其是在90μmol/L和150μmol/L2，5-己二酮暴露组，这一比例是对照组的4倍。（3）次级卵泡不健康卵泡构成比：10μmol/L、90μmol/L和150μmol/L2，5-己二酮暴露组的次级卵泡不健康卵泡构成比明显高于对照组（P<0.05），在150μmol/L2，5-己二酮暴露组，不健康次级卵泡甚至占了次级卵泡总数的50%以上。（4）总不健康卵泡构成比：2，5-己二酮暴露组总不健康卵泡构成比均明显高于对照组（P<0.05）。以上结果提示，2，5-己二酮暴露对新生小鼠卵巢中卵泡的健康状况有明显影响。表SEQ表\*ARABIC22，5-己二酮对小鼠卵巢不健康卵泡构成比的影响组别(μmol/L)N原始卵泡不健康卵泡构成比（%）初级卵泡不健康卵泡构成比（%）次级卵泡不健康卵泡构成比（%）总不健康卵泡构成比（%）对照组150.59.322.84.810134.1*12.837.8*7.8*301814.1*23.2*29.716.5*901515.6*39.7*41.5*22.8*1501523.7*41.4*58.8*30.0*注：与对照组相比，*P<0.05图32，5-己二酮对小鼠不健康卵泡构成比的影响（注：与对照组相比，*P<0.05）2.42，5-己二酮对小鼠卵巢卵母细胞和颗粒细胞的影响如表3、表4所示，与对照组相比，2，5-己二酮暴露对卵母细胞和卵巢颗粒细胞的健康状况均有不同程度的影响。（1）原始卵泡：对照组原始卵泡卵母细胞不健康卵泡构成比仅占0.5%，未观察到颗粒细胞不健康卵泡，而2，5-己二酮暴露组均明显高于对照组（P<0.05），在150μmol/L2，5-己二酮暴露组，二者的比例分别为18.3%、9.2%。（2）初级卵泡：30μmol/L、90μmol/L和150μmol/L2，5-己二酮暴露组的初级卵泡卵母细胞不健康卵泡构成比分别为14.4%、17.6%、28.74%，与对照组（8.7%）相比明显升高（P<0.05）；2，5-己二酮暴露组的初级卵泡颗粒细胞不健康卵泡构成比明显高于对照组的0.6%（P<0.05）。（3）次级卵泡：次级卵泡卵母细胞不健康卵泡构成在对照组与2，5-己二酮暴露组间的差异没有统计学意义（P>0.05），而2，5-己二酮暴露组的次级卵泡颗粒细胞不健康卵泡构成比明显高于对照组（P<0.05），在150μmol/L2，5-己二酮暴露组，颗粒细胞不健康次级卵泡甚至占了次级卵泡总数的近50%。（4）总卵泡：2，5-己二酮暴露组总卵母细胞不健康卵泡构成比和总颗粒细胞不健康卵泡构成比均明显高于对照组（P<0.05），在150μmol/L2，5-己二酮暴露组，二者分别约为对照组的5倍、30倍。以上结果提示，2，5-己二酮暴露对新生小鼠卵巢中卵泡的健康状况的影响主要在颗粒细胞上。表32，5-己二酮对小鼠卵巢卵母细胞的影响组别(μmol/L)N原始卵泡卵母细胞不健康卵泡构成比（%）初级卵泡卵母细胞不健康卵泡构成比（%）次级卵泡卵母细胞不健康卵泡构成比（%）总卵母细胞不健康卵泡构成比（%）对照组150.58.720.54.410132.8*10.529.75.930187.5*14.4*19.39.3*90157.5*17.6*20.811.7*1501518.3*28.7*27.120.9*注：与对照组相比，*P<0.05表32，5-己二酮对小鼠卵巢颗粒细胞的影响组别(μmol/L)N原始卵泡颗粒细胞不健康卵泡构成比（%）初级卵泡颗粒细胞不健康卵泡构成比（%）次级卵泡颗粒细胞不健康卵泡构成比（%）总颗粒细胞不健康卵泡构成比（%）对照组150.00.63.70.510131.3*4.4*14.4*2.7*30186.9*12.7*14.5*8.3*90159.5*29.1*30.1*15.3*150159.2*21.3*48.7*15.0*注：与对照组相比，*P<0.053讨论近年来，随着我国工业高速发展，正己烷被广泛用于生产领域，职业性正己烷中毒事件时常发生[3,4]。随着对正己烷研究的深入，2,5-HD作为正己烷在体内的最终代谢产物和终毒物，其毒性作用与2,5-HD的剂量之间存在剂量反应关系[15]，因而引起人们的关注。正己烷及其代谢衍生物的毒性研究[4]主要集