甲型流感病毒实 验室检测指南

汇报人:XXXX2025年12月24日甲型流感病毒实验室检测指南PPTCONTENTS目录01

概述与检测意义02

标本采集与处理03

核酸检测技术04

病毒分离鉴定CONTENTS目录05

生物安全要求06

质量控制与管理07

结果分析与报告08

附录与参考文献概述与检测意义01甲型流感病毒生物学特性病毒分类与结构甲型流感病毒属于正黏病毒科，基因组由8个单链RNA片段组成，根据表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的差异可分为多种亚型，如H1N1、H3N2等。病毒易变性该病毒易发生抗原漂移或转变，抗原漂移导致季节性流行，抗原转变可能引发大流行，这一特性使其防控难度增加，需要持续监测病毒变异情况。病毒传播与潜伏期主要通过飞沫、接触传播，潜伏期一般为1-4天，在潜伏期内患者即可具有传染性，增加了疾病防控的复杂性。宿主范围具有广泛的宿主范围，包括人、禽类、猪等动物宿主，动物宿主可作为病毒重组库，增加了跨种传播和病毒变异的风险。检测目的与适用范围检测目的早期诊断与隔离，快速识别感染者以启动抗病毒治疗及隔离措施，减少社区传播；流行病学监测，通过病毒分型和基因测序追踪变异株，评估疫苗匹配度；差异化诊疗，与其他呼吸道感染鉴别，避免抗生素滥用，优化医疗资源分配。适用人群出现流感样症状（发热≥38℃伴咳嗽/咽痛）且发病48小时内的患者；聚集性疫情中的密切接触者；免疫功能低下者需优先检测。样本类型选择鼻咽拭子为首选（病毒载量高），亦可采用咽拭子、肺泡灌洗液或痰液，采样需严格无菌操作以避免假阴性结果。检测方法原则推荐快速抗原检测（15-30分钟出结果）用于初筛，但敏感性较低（50-70%）；RT-PCR为金标准（敏感性＞95%），适用于确诊及分型；病毒培养和测序仅用于科研或特殊监测。流行病学监测价值01疫情早期预警与趋势预测通过实验室检测阳性率变化，可早期识别甲型流感流行趋势，为公共卫生决策提供数据支持，如及时调整疫苗接种策略和医疗资源配置。02病毒变异株追踪与疫苗匹配对分离的病毒株进行基因测序，监测HA、NA等关键基因的变异情况，评估流行株与疫苗株的匹配度，为疫苗更新提供科学依据，保障疫苗保护效果。03传播链分析与防控措施优化结合病例流行病学信息和病毒基因序列，追溯疫情传播链，识别聚集性疫情的传播来源和途径，指导针对性防控措施的制定与实施，有效控制疫情扩散。04重症病例风险评估与救治指导通过对检测数据的分析，掌握不同人群（如儿童、老年人、慢性病患者）的感染率和重症发生率，评估特定人群的重症风险，为临床救治资源的优先调配和重症病例的早期干预提供依据。标本采集与处理02推荐采集标本种类

核心呼吸道标本类型发病后应尽快采集鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液；气管插管患者需收集气管吸取物，标本应置于无菌病毒采样液中。

拭子选择标准推荐使用头部为合成纤维（如聚酯纤维）的拭子，铝或塑料柄；禁止使用棉拭子和木柄，采样管需含3毫升病毒采样液（含蛋白质稳定剂、抗生素及缓冲液）。

特殊病例标本要求重症或有创通气患者优先采集下呼吸道标本（如气管吸取物），其病毒载量更高，检测准确性优于上呼吸道标本。拭子选择与采样液要求拭子材质与柄部要求应使用头部为合成纤维（如聚酯纤维）的拭子，柄部为铝或塑料材质。不推荐使用棉拭子和木柄，以避免对病毒核酸检测造成干扰。采样液成分标准标本采集管应包含3毫升病毒采样液，该采样液需含有蛋白质稳定剂、阻止细菌和真菌生长的抗生素以及缓冲液，确保病毒在采样和运输过程中的稳定性。采样液禁用与替代要求严禁使用生理盐水或蒸馏水替代专用病毒采样液。采样液需提前配置并按规定条件储存，未收集标本时可在-20℃冻存，采集标本后应在4℃条件下保存和运送。标本储存与分装规范

临床标本储存条件保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。不应保存在-20℃。

标本分装处理要求标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。

短期储存规范若样本需短期保存，置于2-8℃冷藏环境，避免反复冻融，保存时间不超过规定期限以保证检测准确性。

长期冷冻要求需长期保存的样本应分装后存放于-70℃超低温冰箱，避免温度波动导致病毒核酸降解。定期检查储存设备的温度记录仪，确保稳定性，并配备备用电源以应对突发断电情况。UN2814包装与运送流程UN2814包装规范

疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本列为A类，需采用符合UN2814标准的三层包装系统，包括防漏主容器、带吸附材料的辅助包装和硬质外包装，并粘贴生物危害标识及方向标签。标本送检单填写要求

需完整填写疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本送检单（附表2），内容包括患者姓名、性别、年龄、职业、现住址、发病日期、标本种类、采集日期、标本量等关键信息，确保信息准确可追溯。运输条件与监控

运输过程中应维持适当温度，避免标本反复冻融。运输箱内放置足量冰排或干冰以保持低温环境，并配备温度监控设备记录全程温度，确保运输条件符合生物安全要求，防止标本变质或病毒灭活。交接与记录管理

标本运送至接收实验室后，双方需核对标本信息、包装完整性及温度记录，确认无误后签字交接。运输全程需有详细记录，包括发送单位、接收单位、运送人员、起止时间等，确保责任可追溯。核酸检测技术03real-timeRT-PCR检测原理

技术原理概述基于逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）原理，结合实时荧光信号监测技术，实现对甲型H1N1流感病毒RNA的定性检测。通过特异性引物和双重标记TaqMan®探针，识别病毒保守基因区域，在扩增过程中实时检测荧光信号累积，实现快速诊断。

引物与探针设计采用美国CDC设计的特异性引物和探针，针对甲型H1N1流感病毒的保守基因片段（如InfA、swInfA、swH1等靶标）。引物负责扩增目标序列，探针携带荧光基团和淬灭基团，扩增时探针被水解释放荧光信号，确保检测的高特异性。

检测流程与信号解读检测流程包括RNA提取、逆转录合成cDNA、实时荧光PCR扩增三个步骤。通过监测荧光信号的S型扩增曲线及Ct值（循环阈值）判断结果：Ct值≤35且曲线典型判为阳性，无扩增或Ct值＞40为阴性，Ct值35-40需重复验证。该方法可同时筛选甲型流感病毒并排除季节性流感和H5N1禽流感病毒。引物探针设计与来源

美国CDC设计的real-timeRT-PCR引物探针4月29日WHO网站公布美国CDC设计的针对本次甲型H1N1流感病毒的real-timeRT-PCR引物和探针，用于检测疑似病例呼吸道样本，可筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒，方法参见附件3（中文翻译版）和附件4（英文原版）。

国家流感中心设计的RT-PCR引物国家流感中心设计了RT-PCR方法检测新的甲型H1N1流感病毒，其引物序列为国内自主研发，RT-PCR方法参见附件5。RT-PCR方法操作步骤

核酸提取采用磁珠法或硅胶膜离心柱法提取样本RNA，加入外源性内标监控提取效率。在生物安全柜内操作，严格分区，洗脱体积控制在50-100μl。

反应体系配制按试剂盒说明配制反应混合液，包含逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs、荧光探针及特异性引物。在PCR配制区进行，避免交叉污染，分装后立即使用或低温保存。

样本RNA加样在核酸提取区，向分装好的反应体系中加入5μlRNA模板，同时设置阴性对照（无菌水）和阳性对照。加样后盖紧盖子，混匀离心。

扩增程序设置进行两步法扩增：逆转录阶段将RNA转为cDNA，扩增阶段设置预变性（95℃30秒）、循环变性（95℃5秒）、退火/延伸（60℃30秒）共40个循环，在退火/延伸步骤采集荧光信号。

结果判读阳性对照Ct≤35且阴性对照无扩增时，样本Ct值<40且有典型S型扩增曲线判为阳性；Ct值35-40为灰区，需重复检测或测序确认；无扩增曲线或Ct值≥40为阴性。结果判读标准与质控

阳性结果判定标准核酸检测中，扩增曲线呈典型S型且Ct值≤预设截断值（如Ct≤38），同时内参基因扩增正常，可判定为甲型流感病毒核酸阳性。

阴性结果判定标准所有靶标基因无扩增曲线，且内参基因Ct值在有效范围内，同时阴性对照结果正常，方可报告阴性。需排除标本采集不当或运输条件不符导致的假阴性。

临界值结果处理流程若Ct值处于灰区（如38<Ct<40）或扩增曲线异常，需重新提取核酸复测，并补充血清学或病毒培养等辅助检测方法。

质量控制品设置要求每批次检测需包含弱阳性对照（Ct32±2）、阴性对照和空白对照，批内变异系数（CV）应<5%，室间质评符合率需≥95%。病毒分离鉴定04鸡胚培养方法

01鸡胚选择与预处理选用9-11日龄SPF鸡胚，照蛋确认存活后标记气室及尿囊腔位置，用70%乙醇消毒蛋壳，在气室端钻孔避免损伤壳膜。

02病毒接种与孵育使用1mL注射器将样本接种于尿囊腔（0.1-0.2mL/胚），封孔后置于33-35℃、湿度60%的孵育箱中培养48-72小时，每日照蛋剔除死亡胚胎。

03尿囊液收集与检测冷藏鸡胚4℃过夜后抽取尿囊液，离心取上清进行血凝试验（HA）检测病毒滴度，阳性样本需进一步通过RT-PCR或测序确认亚型。MDCK细胞培养流程细胞复苏与接种从液氮或-80℃冰箱取出冻存的MDCK细胞，37℃水浴快速解冻，离心去除冻存液后，用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬，按适宜密度接种于培养瓶，置于37℃、5%CO₂培养箱培养。细胞传代与培养待细胞融合度达80%-90%时，弃培养基，用PBS洗涤后，加入胰蛋白酶消化至细胞脱落，加入新鲜培养基终止消化，吹打混匀后按1:3-1:5比例传代，继续培养至对数生长期备用。病毒接种与培养取处理后的临床标本上清液，按一定比例接种于单层MDCK细胞，37℃吸附1-2小时，期间轻摇培养瓶促进病毒吸附，弃上清后加入含TPCK-胰蛋白酶的维持培养基，33-35℃、5%CO₂培养箱孵育，每日观察细胞病变效应（CPE）。病毒收获与保存待CPE达75%以上时，收获培养上清液，4℃离心去除细胞碎片，分装后标记清楚，置于-70℃或以下保存，用于后续病毒鉴定或其他相关实验。病毒鉴定方法与验证

基于real-timeRT-PCR的病毒鉴定采用美国CDC设计的引物和探针序列，可快速筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒，具有高灵敏度和特异性。

基于RT-PCR的病毒鉴定国家流感中心设计的RT-PCR方法，用于检测新的甲型H1N1流感病毒，为病毒鉴定提供了另一种可靠的分子生物学手段。

病毒分离培养鉴定可采用鸡胚和/或MDCK细胞进行流感病毒分离，具有相应条件的网络实验室在收到标本后24h内进行病毒接种，是病毒鉴定的经典方法。

血凝抑制试验（HI）鉴定使用标准抗血清进行HI试验，通过血凝抑制效价判定病毒亚型（如H1N1、H3N2等），需设置阴性对照和血清对照以排除非特异性反应。

基因测序与进化分析鉴定提取病毒RNA后通过RT-PCR扩增HA和NA基因片段，测序后与数据库（如GISAID）比对分析，可评估病毒变异情况。生物安全要求05实验室级别划分标准诊断性实验工作环境要求对疑似甲型H1N1流感病例临床标本进行诊断性实验，需在BSL-2实验室内开展，所有样本操作均应在生物安全柜（BSC）内进行，并遵循生物安全三级个人防护。病毒分离培养环境要求进行甲型H1N1流感病毒分离培养工作，应在BSL-3实验室内进行，同时严格遵循生物安全三级个人防护标准，以确保操作安全。分级管理依据实验室级别划分主要依据实验操作的生物安全风险程度，诊断性实验因样本潜在风险相对较低，故在BSL-2实验室进行；而病毒分离培养操作风险较高，因此需在更高防护级别的BSL-3实验室开展。个人防护装备配置

核心防护装备要求实验室人员必须穿戴N95及以上级别口罩、护目镜、防护服及双层手套，确保皮肤和黏膜不直接接触样本，降低感染风险。

生物安全三级防护标准对采集自疑似病例的临床标本进行诊断性实验工作，需遵循生物安全三级个人防护；病毒分离培养工作同样需此级别防护。

特殊场景防护增强高风险操作（如病毒培养物处理）需额外使用正压面罩或生物安全柜；处理样本时，鞋套需防水且高至膝盖，与防护服裤脚密封衔接。

防护装备使用规范实验开始后穿清洁工作服，使用新的一次性无粉手套；防护服袖口应紧贴手套边缘，防止气溶胶渗透；实验前后需检查装备完整性。健康监测与暴露处理

日常健康监测要求所有实验室人员均应每日自测发热及其他症状，包括咳嗽、喉咙痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛等。

症状报告与响应机制一旦出现疑似甲型H1N1流感症状，实验室人员应立即停止工作并向上级报告，及时就医并遵循医疗机构指导。

职业暴露评估标准判定标准为在无有效防护情况下暴露于甲型H1N1流感确诊病例的临床标本或活病毒，包括气溶胶吸入、皮肤黏膜接触等情形。

暴露后预防措施发生职业暴露后，应在暴露后的7天时间里考虑使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒药物预防，并进行医学观察。质量控制与管理06室内质控品设置要求

质控品类型选择需包含弱阳性、中阳性和强阳性样本，覆盖检测方法的线性范围，确保不同浓度水平的甲型流感病毒均能被准确识别。

质控频率与批次匹配每批次检测必须同步运行内部质控样本，若连续检测超过规定批次，需增加质控频次以监控系统稳定性。

质控参数要求每批次检测需包含弱阳性对照（Ct32±2）、阴性对照和空白对照，批内变异系数（CV）应<5%，室间质评符合率需≥95%。

质控数据记录与分析详细记录质控样本的CT值、扩增曲线形态等参数，定期绘制Levey-Jennings质控图，分析趋势偏移或失控原因，并形成闭环管理。室间质评与能力验证

室间质评的参与要求实验室需定期参加国家级或省级临床检验中心组织的甲型流感病毒检测室间质评活动，每年至少1次，确保检测能力符合国家标准。

能力验证的实施频率每季度开展1次实验室内部能力验证，采用已知浓度的甲型流感病毒核酸标准品进行盲样检测，验证检测系统的准确性和稳定性。

质评结果的判定标准室间质评结果符合率需≥95%，能力验证样本检测结果与靶值偏差应在±1个Ct值范围内，否则需启动纠正措施并重新验证。

持续改进机制对质评不合格项目，需分析原因（如试剂批次、人员操作、设备状态等），制定整改计划并记录，跟踪验证改进效果，确保检测质量持续提升。试剂与设备维护规范

试剂存储与管理要求核酸提取试剂盒、PCR试剂等需按说明书要求避光、低温（2-8℃或-20℃）保存，避免反复冻融。阳性对照品和阴性对照品应单独存放，严格标记有效期，遵循"先进先出"原则使用。

检测设备日常维护实时荧光定量PCR仪需每日进行温度校准和光路检查，每周清洁样品槽及传感器；生物安全柜定期（每6个月）进行高效过滤器完整性测试和气流速度监测，确保符合BSL-2级实验室要求。

设备校准与性能验证PCR仪每年由计量部门进行校准，验证温度准确性（偏差≤±0.5℃）和均一性；超低温冰箱、生物安全柜等关键设备每日记录运行参数，出现异常立即启动备用设备并联系维修。

维护记录与追溯管理建立试剂使用登记册，记录批号、有效期、库存量及领用信息；设备维护需详细记录校准日期、维护内容、故障处理结果及操作人员，确保符合ISO15189实验室质量管理要求。结果分析与报告07阳性结果判定依据核酸检测阳性标准基于real-timeRT-PCR方法，样本Ct值≤38且出现典型S型扩增曲线，同时内参基因扩增正常，可判定为甲型流感病毒核酸阳性。抗原检测阳性标准免疫层析法检测时，检测线（T线）与质控线（C线）同时显色，无论显色深浅，均判定为甲型流感病毒抗原阳性。病毒分离培养阳性标准鸡胚或MDCK细胞培养出现典型细胞病变效应（CPE），且血凝试验（HA）结果阳性，经血凝抑制试验（HI）或RT-PCR鉴定为甲型流感病毒。血清学检测阳性标准恢复期血清甲型流感病毒IgG抗体滴度较急性期升高4倍及以上，或急性期IgM抗体阳性，结合流行病学史可判定为近期感染。灰区结果处理流程

灰区结果判定标准当检测样本的Ct值处于35-40区间，或扩增曲线形态不典型（如未呈现明显S型）时，判定为灰区结果，需启动复核程序。

样本重新检测与验证对灰区结果样本，应重新提取核酸并使用原检测方法进行重复检测，同时可采用其他原理的检测方法（如不同引物探针组合的RT-PCR）进行交叉验证，确保结果可靠性。

结合临床信息综合评估复核过程中需结合患者的临床症状（如发热、咳嗽等）、流行病学史（如接触史、聚集性疫情）及其他实验室检查结果