糖尿病细胞治疗技术进展-根治糖尿病的新选择

EQ\*jc3\*hps63\o\al(\s\up16(Dia),Up)EQ\*jc3\*hps63\o\al(\s\up16(et),at)EQ\*jc3\*hps63\o\al(\s\up16(e),e)s——根治糖尿病的新选择□细□细胞治疗的挑战：生产平台/质量控制/免疫保护1型糖尿病：免疫破环致β细胞功能障碍，需终生胰岛素治疗《中国1型糖尿病诊治指南》1,AnnBucholtz.Chapter10-SuddenDeathinAdults.DeathInvestigation,2015,Pages193-250.2,《中国1型糖尿病诊治指南》(2012年版)糖尿病前期糖尿病糖尿病前期糖尿病250-胰岛素抵抗胰岛素抵抗胰岛素水平胰岛素水平空腹血糖糖尿病病史(年)基于患者需求，糖尿病细胞治疗的必要性补充外源性胰岛素，不能根治糖尿病，需每日多次注射，且有低血糖风险持续血糖监测和人工胰腺，虽可改善预后，但仍不能长期将HbA1C控制在目标范围某些患者不愿佩戴人工胰腺，因需同时佩戴几个笨重设备(如传感器、胰岛素泵和监测器)因此，临床患者仍需寻找恢复内源性胰岛素的新方法根治糖尿病的新选择：细胞治疗根治糖尿病的新选择：细胞治疗为恢复内源性胰岛素分泌带来希望糖尿病细胞治疗定义糖尿病细胞治疗定义的治疗方式，都可以叫糖尿病细胞治疗包括以下常见方式(前2种最常见)GopikaG.Nair¹,EmmanuelS.TzanakaNair,G.G,NatRevEndocrinol,2糖尿病细胞治疗理论基础在营养物质刺激下，具有动态双相胰岛素分泌的功能，去除刺激后，胰岛素分泌迅速停止对肠道和神经系统信号有反应抑制可能导致异常胰岛素分泌的不允许基因诱导线粒体氧化磷酸化，活性线粒体氧化还原穿梭于线粒体偶联因子的产生…第一部分小结持续血糖监测和人工胰腺，虽可改善预后，但仍不能长期将HbA1C控制在目标范围，且很多患者不愿长期佩戴人工胰腺的诸多装置细胞治疗，是目前研究的新方向□细□细胞治疗的进展：胰岛移植/干细胞移植□细□细胞治疗的挑战：生产平台/质量控制/免疫保护根据细胞治疗的移植物来源，主要分为以下两种方式胰岛移植的前身是胰腺移植，但胰腺移植手术复杂且术后并发症多，而糖尿病患者，其胰腺外分泌功能正常，仅需有内分泌功能的胰岛细胞，因此，胰腺移植逐渐简化为胰岛移植供体胰岛细胞供体肝门静脉内输注分离后的胰岛细胞(多为心源性死亡供体)提取成熟后，直接移植入糖尿病患者体内胰岛移植部位·主要部位：肝门静脉内输注，直接作用于肝脏，符合生理胰岛素途径·其他部位：比如肌肉、腹腔、脾脏、胰腺被膜下和肾包膜下面临的问题：胰腺供体短缺同种胰岛移植示意图同种胰岛移植常面临胰腺供体短缺的问题，遂开发出异种胰岛移植异种胰岛移植示意图异种胰岛移植定义：直接从异种动物胰腺中(一般选择无菌环境下养殖猪的胰腺作为供体)分离纯化胰岛细胞后移植异种胰岛移植为什么选择猪作为供体·猪胰岛获取简单·猪胰岛素结构与人最为相近·猪血糖调节与人类似异种胰岛移植面临的问题·异种免疫排斥反应·猪内源性逆转录病毒感染胰岛移植：明显改善患者血糖控制一项在北美8个中心进行的3期临床研究，对48名病程大于5年的成人1型糖尿病患者进行人胰岛移植，检测移植后血糖改善情况，并检测外源性胰岛素用量和C肽水平的变化

HERINGBJ,胰岛移植胰岛移植干细胞移植胰岛移植：明显减少患者外源性胰岛素用量，提高C肽水平一项在北美8个中心进行的3期临床研究，对48名病程大于5年的成人1型糖尿病患者进行人胰岛移植，检测移植后血糖改善情况，并检测外源性胰岛素用量和C肽水平的变化外源性胰岛素用量：胰岛移植后第75天，第365天别与基线相比，p值均<0.001C肽水平：胰岛移植后第75天，第365天及第730天时，C肽水平明显升高，0分钟，60分钟，90分钟时测得C肽值，分别与基线时相同时间测得值相比，p值均<0.0003HERINGBJ,DiabetesC2017年，美国制定《临床胰岛移植标准化操作流程》极大提高了胰岛制备临床成功率IsietIsietpurifcationwithwithcollagenasePercutaneoustranshepaticportalvenouscannulation,poisletgravityinfusionwithconstantpor1,胰腺消化酶灌注2,放入“胰腺消化罐”消化3,胰腺消化4,胰岛细胞提取及纯化5,胰岛细胞培养7,胰岛细胞移植2019年，中国达成《临床胰岛制备技术专家共识》极大推动了胰岛移植临床转化>2019年，中华医学会器官移植分会胰腺小肠移植学组，发表了《中国临床胰岛制备技术专家共识》。共识详述了包括胰腺筛选，胰腺获取及保存，胰腺消化，胰岛纯化，胰岛培养，胰岛质量鉴定等六大部分的内容，标志着我国也逐步形成了适合中国人群的胰岛制备方法中华器官移植杂志2019年9月第40卷第9期ChinJOrganTransplant,September2019,Vol.40,No.9515中国临床胰岛制备技术专家共识基金项目：国家自然科学基金面上项目(81870535);天津市自然科学基金重点项目(18JCZDJC33100)DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-1785.2019.糖尿病胰岛移植临床试验总数165个(截止2021年5月)/ct2/results?cond=Diabetes&term=islet+transplantation&cn根据细胞治疗的移植细胞来源，主要分为以下2个方向与胰岛移植的区别：后者需从供体成熟的胰腺中分离和提取胰岛细胞后移植(一般1例T1DM患者需2至3例供者的胰岛，才可维持正常血糖),所以，常常供体短缺，而干细胞移植只要在临床前阶段解决了技术问题，则可大批量工业生产，解决了以上问题干细胞体外诱导干细胞体外诱导干细胞直接移植干细胞移植免疫保护装置功能异常干细胞移植简要示意图干细胞分类：按照来源分为成体干细胞和人多能干细胞两大类名称成体干细胞间充质干细胞(骨髓、脂肪、脐带血间充质干细胞)…人多能干细胞胚囊内细胞团中的二倍体细胞，可从植入子宫内膜前的囊胚中获得由外周血单个核细胞或真皮成纤维细胞，重新一，直接移植一，直接移植干细胞移植方式二，体外诱导后移植干细胞直接移植的原理：糖尿病患者常有胰岛的自身免疫损伤，向其直接输入成体干细胞，因成体干细胞具有的自趋性和分化性，它们能在胰岛部位定居并分化为β细胞治疗方式：干细胞直接胰腺内注射或静脉注射作用机制：·直接在体内分化为β细胞¹·直接接触或分泌细胞因子，调控T细胞功能2,3·直接接触或分泌细胞因子，保护β细胞不受免疫或氧化损伤，减弱胰岛素抵抗⁴1,DongQY,[J].Clin胰岛移植胰岛移植干细胞移植Meta分析提示：不同来源成体干细胞直接移植治疗1型糖尿病疗效不一致一项探索成体干细胞直接移植治疗1型糖尿病有效性的Meta分析，数据涉及6项149名1型糖尿病患者干细胞治疗，静脉注射：脐血细胞(UCB),脐带间充质干细胞(UC-MSCs),骨髓造血干细胞(BM-HSCs),主要分析从基线到不同干细胞移植后6个月或12个月C肽峰值以及HbA1c的变化Meta分析提示：不同来源成体干细胞直接移植治疗2型糖尿病疗效也不一致和PD-MSCs,胰内注射UCB和BM-MNCs,主要分析从基线到不同干细胞移植后6个月或12个月，C肽峰值以及HbA1c的变化AAHbA1c(%)650AhmedEl-Badawy,PLoSOne,2016Apr13;11(4):e0151938.doi:10.1371/journal.pone.0151938AhmedEl-Badawy,PLoSOne,2016Apr13;11(4胰岛移植胰岛移植干细胞移植人多能干细胞第1步◎获取定向胚胎干细胞诱导多能干细胞重编程第2步第2步颗粒并移植回患者体内逆转糖尿病种来源：胚胎的内细胞团获取的胚胎干不成熟的β细胞信号出现，使不成熟β细胞获得动态胰岛素分泌特性，进一步分离不成熟细胞，移植回患者体内，以逆转糖尿病流程图：人多能干细胞体外诱导分化为成熟β细胞后再移植Nair,G.G,NatRevEndoc胰岛移植胰岛移植干细胞移植一项在1型糖尿病大鼠中观察诱导分化和未诱导分化的骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗效果的动物试验，采用Exendin-4和TGFβ诱导MSCs向细胞分化，通过检测β细胞特异性基因定量表达，及胰岛素和血糖水平，评价分化与未分化骨髓间充质干细胞的治疗效果大鼠分化期骨髓间充质干细胞DTZ染色HealthycontrolDiabeticcontrolacellularmediumacellularmedium|undifferentiatedβ细胞特异性基因在胰腺中的基因表达胰岛移植干细胞移植干细胞体外诱导胰岛移植干细胞移植对1型糖尿病大鼠，无论移植未分化或经过体外诱导分化后的骨髓间充质干细胞120(MSCs对1型糖尿病大鼠，无论移植未分化或经过体外诱导分化后的骨髓间充质干细胞120(MSCs),均能明显改善胰岛素及血糖水平EQ\*jc3\*hps13\o\al(\s\up2(r),ia)EQ\*jc3\*hps13\o\al(\s\up2(t),e)EQ\*jc3\*hps13\o\al(\s\up2(ia),ic)EQ\*jc3\*hps13\o\al(\s\up2(SC),eren)Bloodglucoseafter2ndmonthBloodglucoseafter_不同来源干细胞移植优缺点比较优点缺点成体间充质干细胞(骨髓、脂肪、脐带血间充质干细胞)肝脏干细胞…直接移植>体外诱导后再移植来源广泛>从自体组织分离，无免疫原性>从自体组织分离，无伦理学问题>低成瘤性>缺乏特异性标志分子，分离纯化及鉴定技术比较困难>不同细胞之间，在体外及体内，分化能力均存在较大变异性人多能胚胎干细胞体外诱导后再移植>体外定向分化能力强移植后细胞存活率高>必须摧毁人类早期胚胎获取，一直有伦理争论>免疫原性>潜在成瘤性诱导性多能干细胞>体外诱导后再移植>体外定向分化能力强移植后细胞存活率高>移植细胞来自自体组织，无免疫原性，无伦理学问题>体外诱导技术要求高糖尿病干细胞移植临床试验总数186个(截止2021年5月)>全球干细胞移植三足鼎立局面已经形成：第二部分小结经典的糖尿病细胞治疗，根据移植物来源，分为胰岛移植和干细胞移植2个方向胰岛移植是直接从同种或异种胰腺中，分离纯化胰岛细胞后移植，存在供体短缺及术后需长期使用免疫抑制剂等问题，但因其技术相对简单，目前临床转化比较充分胞移植有不同的优缺点。虽然干细胞移植技术要求高，但因其可工业化批量生产而成为目前最热门的研究方向□□根治糖尿病的新选择：细胞治疗Alowscontrolof●第1代：多板系统，多个平行板组成的2D系统缺点：各种生产中所需的可溶性因子传质不良●第2代：滚轮瓶，在轨道搅拌下旋转，粘附多孔板中的聚集体。缺点：仍不能解决表面积体积比的问题。细胞收获时劳动密集型，污染风险大●第3代：波浪搅拌生物反应器(又叫袋式生物反应器)细胞在一次性袋子中培养，使用探针监测培养环境缺点：难以批量生产，适合单病人生产●第4代：悬浮搅拌生物反应器，已成为设施中的主力优点：可控：可动态监测并控制风潮，溶解0₂,培养，pH,温度在微载体上，随后封装批量：可提供10⁶-107细胞/ml的细若不能有效控制排斥反应，移植细胞将会被免疫系统排斥而导致移植失败，目前主要的解决方案为：1,全身免疫抑制剂的应用2,局部免疫阻断：干细胞结合组织工程材料后再移植3,干细胞免疫教育+依那西普维持方案：西罗莫司(不耐受可换为吗替麦考酚酯)+他克莫司时间(天)>2000至2006年间，多采用Edmonton免疫抑制方案，虽胰岛移植成功率有所提高，但随时间延长，50%至80%的患者胰岛移植物逐渐丢失目前临床多采用Hering等提出的免疫抑制方案(如左图),该方案进一步提高了胰岛移植的成功率免疫隔离装置需满足：对自身免疫系统(免疫细胞、免疫球蛋白、补体等大分子)进行隔离，但允许小分子物质(葡萄糖、胰岛素、氧分子、细胞代谢产物)自由交换名称三唑硫吗啉氧化物(TMTD)海藻酸盐聚四氟乙烯(PTFE)双层结构常见材料1:海藻酸盐胰岛纸Cerco-Medical公司用海藻酸盐做成的纸片状结构(名为胰岛纸sletSheet),为植入方便，每张胰岛纸约4×8×0.25cm大小，可放置10万个胰岛细胞，预计皮下移植6张这样的胰岛纸，可使一名患者脱离外源性胰岛素的使用聚合物网，存在于包含胰岛细胞的核聚合物网，存在于包含胰岛细胞的核全身免疫抑制剂局部免疫阻断干细胞免疫教育海藻酸盐胰岛纸植入，明显改善血糖控制在一只对胰腺切除犬进行的动物实验中，在其大网膜植入含有同种异体胰岛细胞的6张胰岛纸(含大约75000个胰岛当量细胞),观察胰岛纸植入的治疗效果。每日上午对犬喂食一次标准食物，并允许其随意进食，监测其上午喂食前空腹血糖(AM血糖)及下午随机血糖(PM血糖)。为对比治疗效果，在植入术后第84天时手术去除胰岛纸，检测去除胰岛纸后的血糖变化。研究者在切除胰腺前，以及胰岛纸植入后30天和60天时，还进行了静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT),以对比血糖改善情况胰岛纸植入胰岛纸去除0FebMar血糖)及随机血糖(PM血糖)维持在正常水平(低于150mg/dL),而第84天去后30天和60天，未达到切除胰腺前水平，但血胰岛球植入，能减少免疫细胞数量及改善血糖控制aTMTD.SLG.海藻酸盐胰岛球能抑制先天性免疫细胞群的活化，表现为明显减少诸如巨噬细胞(Macrophage)中性粒细胞(Neutrophils)B细胞以及CD8-T细胞的数量。其中，直径1.5mm的TMTD海藻胰岛球包装的干细胞来源的β细胞，效果最明显，明显优于既往常规使用的直径0.5mm胰岛球ArturoJ.VegasNatMed.2016March;22(3):306-31时间(天)正常(红色曲线),并长期维持达到健康小鼠水平(绿色曲线)糖改善明显(绿色曲线),与健康小鼠相似(蓝色曲线)常见材料3:PEC-Encap全身免疫抑制剂微囊细胞递送系统局部免疫阻断干细胞免疫教育>Via