微生物学教学课件-第7章-微生物之生长繁殖-8

第七章微生物的生长繁殖与控制目录第一节微生物生长的测定微生物的个体生长细菌的群体生长繁殖细菌群体在固体培养基上的生长丝状微生物的群体生长第二节第三节第四节第五节环境对微生物生长的影响第六节微生物生长繁殖的控制第七节一、

计数法

此法通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。计数法又分为直接计数和间接计数两类。

第一节微生物生长的测定该法是利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。属于全菌计数，无法区分死菌与活菌。

每毫升原液所含细菌数

＝每小格平均细菌数×4000×l000×稀释倍数1.显微镜计数器直接计数图7-1血细胞计数板的构造和酵母菌的细胞计数（仿林稚兰等，2011）（一）直接计数法2.比浊法又称平板菌落计数和活菌计数原理：是每个活细胞在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落进而计数。

方法：每毫升原菌液活菌数＝

同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×稀释倍数（二）间接计数(1)对样品进行系列稀释1.平板菌落计数(2)制作混菌平板要点是充分混匀！(3)通过培养后，进行平板菌落计数，计数范围要求在25-250

个菌落之间(单位：CFUs)PourplatePourplate(4)该法要求重复间的差异要尽量下，如下图所示2.最大概率法该法是取单细胞微生物悬液在定量培养液中做系列稀释培养，在一定稀释度数以前的培养液中出现细菌生长，而在这个稀释度以后的培养液中不出现细菌生长，将最后3级有菌生长的稀释度称为临界级数，将3-5次重复的临界数求得最大概率数(MPN)，可计算出单位体积样品中细胞数的近似值。3.膜过滤法二、重量法此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。微生物湿重微生物干重蛋白质总量

DNA含量

蛋白质总量蛋白质总量＝含氮量×6.25细胞总量＝蛋白质总量÷[50%～80%(或65%)]≈蛋白质总量×1.54DNA含量核酸DNA是微生物的重要遗传物质，每个细菌的DNA含量相当恒定，平均为8.4×10-5ng.生理指标包括微生物的呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等。这是根据微生物在生长过程中伴随出现的这些指标，样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。三、生理指标法第二节微生物的个体生长

一、真核生物细胞的生长周期二、原核生物细胞的生长周期三、细胞分化真核生物的个体生长包括分裂间期或起始生长期、DNA合成期、第二次生长期和有丝分裂期：1.起始生长期（G1）;2.DNA合成期（S期）;3.第二次生长期（G2）；4.有丝分裂期（M期或D期）一、真核生物细胞的生长周期一、真核生物细胞的生长周期细菌的个体生长包括细胞结构的复制与再生、细胞的分裂与控制：1.染色体DNA的复制和分离;2.细胞壁扩增;3.细菌的分裂.二、原核生物细胞的生长周期分化是细胞在发育过程中发生的形态、结构和生理功能上一系列的变化。高等动植物的分化已有大量研究，真核微生物的分化也有很多了解，但对细菌细胞分化的研究比较滞后。三、细胞分化细菌芽孢的形成过程第三节细菌的群体生长繁殖

一、生长的规律二、生长的数学模型三、微生物的连续培养分批培养:微生物在化学成分一定的培养基中进行的培养。生长曲线:

在细菌分批培养中，定时取样测定单位体积里的细胞数，以培养时间为横坐标，以单位体积中的细胞数为纵坐标，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线，这种曲线称为生长曲线(growthcurve)。一、细菌的群体生长繁殖一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期等四个生长时期。为了适应新环境。细菌数量(或菌体重量)在初始阶段几乎不增加，甚至稍有减少。然后，菌体细胞物质开始增加、体积增大、代谢机能活化，大量合成诱导酶、辅酶以及其他产物；核糖体合成加快，RNA含量升高。接着，细胞开始分裂。1.迟缓期，也称延滞生长期菌种特性菌龄接种量移接前后的环境条件迟缓期的影响因素缩短迟缓期的主要措施接种适当菌龄的菌种配制接近种子培养基的发酵培养基亦称指数期。经过延滞生长期后的细菌，细胞分裂速率加快，个体数量以几何级数增长(21，22，23，24…2n)。细菌个体数量与时间呈对数关系，被称为对数生长期。对数生长期对数生长期细菌的特征个体生长繁殖迅速、代时最短细胞生理活性强、代谢活动旺盛菌体大小、个体形态、化学组成和生理特性等相对一致2.对数生长期又称最高生长期。经过对数生长期，营养物质被大量消耗，比例失调，代谢产物开始积累，营养液pH发生变化，致使生长条件恶化，环境条件逐渐不适宜于细菌生长，细菌增殖速率逐渐下降，死亡速率上升。当增殖速率与死亡速率基本持平时，培养液中活菌数保持相对稳定，这一时期称为稳定生长期。3.稳定生长期内源代谢：当培养液中的营养物质消耗殆尽后，细菌开始消耗细胞内的贮藏物质，同时菌体死亡后裂解，释放出的营养物质，也作为其他细菌的养料，称之为内源代谢(endogenousmetabolism)。稳定生长期细菌的特征总数达到最高活性下降，内含物如肝糖粒、脂肪粒、PHB等开始积累开始形成芽孢。3.稳定生长期在稳定生长期后，营养物质殆尽，代谢产物积累，细菌增殖逐渐停止，死亡率增加，细胞死亡数超过新增数，总活菌数明显下降，细胞进入衰亡期。在某一时段，活菌数呈几何级数下降，称为“对数死亡期”。4.衰亡生长期.

迟缓期对数生长期稳定生长期衰亡生长期

对微生物生长速率变化规律的研究有助于推动基础研究和解决工业发酵中的问题。对数生长期中微生物细胞数量呈对数增加和细胞各成分按比例增加，该期微生物的生长可用数学模型表示如下：二、生长的数学模型注：式中相关字母代表：N：每毫升培养液中细胞的数量；M：每毫升培养液中细胞物质的量；E：每毫升培养液中其他细胞物质的量；µ：比生成速率，即每单位数量的细菌或物质在单位时间（h）内增加的量；t：培养时间（h）。

在细菌个体生长中，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时（generationtime），在群体生长中细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（doublingtime）。代时通常以G表示。二、生长的数学模型代时在不同微生物差别很大，一般为1h左右，但生长快的微生物在条件适宜时还不到10min。在分批培养的对数生长期时，一方面以一定速度源源不断地输入营养物质，同时以相同速度移去培养物(菌体和代谢产物)，可以延长对数生长期一种培养方法。＊解除分批培养中由于营养物质消耗和产物积累而导致微生物生长停止。三、连续培养（Continousculture）①培养液贮备瓶，其上有过滤器（a）和培养基进口（b）；②蠕动泵；③恒化器，其上有培养基入口（c）、搅拌器（d）、空气过滤装置（e）和取样口（f）；④收集瓶，其上有过滤器（g）。三、连续培养（Continousculture）三、连续培养（Continousculture）连续培养的类型按控制方式连续培养恒浊法恒化法单级连续培养法多级连续培养法按培养器级数第四节细菌群体在固体培养基上的生长

细菌在固体培养基上生长时，细胞分裂后不能分散开来，因此相对地固定在培养基表面生长，形成菌落，是细菌鉴定的指标之一。细菌菌落并非大量细胞的简单堆积，而是有一定的性状和结构，呈现出特有的图案，即使是同一种细菌因培养情况不同也可以表现出不同的菌落表型。细菌菌落图第五节丝状微生物的群体生长

丝状微生物包括原核微生物中的放线菌和真核微生物的丝状真菌。在液体培养基中，丝状微生物的生长方式主要分为：丝状生长和沉淀生长。

丝状生长是指丝状微生物以分布均匀的丝状菌丝悬浮于液体培养基中生长；沉淀生长是指以分散的沉淀物出现在发酵液中的生长。。

与单细胞微生物不同，丝状微生物(放线菌、霉菌等)的生长曲线一般不出现典型的对数生长期。分批培养中，以菌丝体干重为生长指标，丝状霉菌的生长过程大致可分为停滞生长期、迅速生长期和衰亡生长期三个阶段。第五节丝状微生物的群体生长茄病镰刀霉（Fusariumsolani）的生长曲线丝状真菌的生长曲线1.营养物质2.水活度3.温度4.pH5.氧气第六节环境对微生物生长的影响1.营养物质营养物质不足导致微生物生长所需养分不足，此时机体一方面降低或停止细胞物质合成，避免能量的消耗，或通过诱导合成特定运输系统，充分吸收环境中微量的营养物质以维持机体的生存；另一方面机体对胞内某些非必需成分或失效的成分（蛋白质、酶等）进行降解以重新利用。水活度值是指在一定的温度和压力条件下，溶液的蒸气压力与同样条件下纯水蒸气压力之比。

即αw＝Pw／P0w式中Pw代表溶液蒸气压力，P0w代表纯水蒸气压力。

纯水αw为1.00，溶液中溶质越多，αw越小。2.水活度微生物一般在αw为0.60-0.99的条件下生长，αw过低，微生物生长迟缓期延长，比生长速率和总生长量减少。微生物不同，其生长的最适αw不同(表7.1)。一般而言，细菌生长最适αw较酵母菌和霉菌高，而嗜盐微生物生长最适αw则较低。2.水活度表7.1几类微生物生长最适

w水活度（αw）环境（材料）微生物（代表种类）1.00纯水柄杆菌、螺旋菌0.90~1.00一般农业土壤大多数微生物0.98海水假单胞菌、弧菌0.95面包大多数革兰氏阳性杆菌0.90槭树糖浆、火腿革兰氏阴性球菌、毛霉、链孢霉0.85咸腊肠鲁氏酵母0.80水果、蛋糕、果酱拜耳酵母、青霉0.75盐湖、咸鱼盐杆菌、盐球菌、曲霉0.70谷物、蜜饯、干果嗜干燥真菌最高温度

最低温度最适温度温度对微生物的影响具体表现在：（1）影响酶活性（2）影响细胞膜的流动性（3）影响物质的溶解度3.温度最适生长温度：

微生物分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。3.温度同一微生物不同生理生化过程有不同的最适温度。如：青霉素发酵：(产量比30℃提高14.7%)

30℃25℃20℃25℃

0h

5h

40h

125h165h微生物类型生长温度/℃

最

低

最

适最

高嗜冷微生物（psychrophile）0以下1520兼性嗜冷微生物（facultativepsychophile或psychrotroph）020-3035嗜温微生物（mesophile）15-2025-4050嗜热微生物（thermophile）4555-6580超嗜热或极端嗜热微生物（hyperthermophile）6580-90100以上表7-3微生物生长的温度范围3.温度不同微生物的生长pH存在最低、最高与最适3个数值(生长pH三基点)。4.pH微生物pH最低最适最高一般细菌3.0–5.06.5–7.58.0–10.0放线菌5.07.0–8.010.0酵母菌3.05.0–6.08.0一般霉菌1.0–3.03.8–6.07.0–11.0褐球固氮菌4.57.4–7.69.0大豆根瘤菌4.26.8–7.011.0亚硝酸细菌7.07.8–8.69.4氧化硫硫杆菌1.02.0–2.84.0–6.0嗜酸乳酸杆菌4.0–4.65.8–6.66.8黑曲霉1.55.0–6.09.0表7-4一般微生物生长的pH范围（一）嗜中性微生物生长的pH范围是pH5.5—8.0，最适生长pH近中性（pH7.0）。大多数细菌属于嗜中性微生物（二）嗜酸性微生物最适生长pH在5.5以下生长的微生物称之为嗜酸性微生物（三）嗜碱性微生物生长的pH范围是pH7.0—11.5，最适生长pH在8.0以上4.pH同一微生物不同生长阶段、不同生理、生化过程有不同的最适pH。黑曲霉：菌体生长，2.5-6.5；产柠檬酸，2-2.5；合成草酸，7左右。pH影响微生物生长机制：（1）影响生活环境中营养物质的可给态和有毒物质的毒性（2）影响菌体细胞膜的带电荷性质、膜的稳定性及膜对物质的吸收能力（3）影响代谢中各种酶的活力4.pH5.氧根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:

专性好氧菌

好氧菌

兼性厌氧菌

微好氧菌

耐氧厌氧菌

厌氧菌

(专性)厌氧菌微生物类型最适生长的O2的体积分数好氧菌（aerobe）≥20%微好氧菌（microaerophile）2%-10%耐氧厌氧菌（aerouolerentanaerobe）2%以下兼性厌氧菌（facultativeanaerobe）有氧或无氧专性厌氧菌（obligateanaerobe）不需要氧、有氧时死亡微生物与氧的关系5.氧微生物与氧的关系氧毒害厌氧菌的机制：O2+e

O2(O2).-生物体的针对措施：超氧化物歧化酶(superoxidedismutase-SOD)是其中之一。好氧、耐氧微生物的超氧化物歧化酶将超氧阴离子转化为毒性稍低的过氧化氢，过氧化氢酶再将过氧化氢转化为无毒的水。厌氧微生物因为没有超氧化物歧化酶，超氧阴离子自由基可造成其损害。5.氧5.氧

过氧化氢酶

H2O+1/2O2SOD好氧菌2O2-·+2HH2O2+O2

好氧、耐氧微生物过氧化物酶

2H2O耐氧菌

NADH2NAD一、控制微生物生长繁殖的化学物质二、控制微生物生长繁殖的物理因素第七节微生物生长繁殖的控制（一）抗生素（二）表面消毒剂（三）抗代谢药物—磺胺类药物第七节微生物生长繁殖的控制一、控制微生物生长繁殖的化学物质定义：化学控制方法主要是指利用各种化学药剂控制微生物生长的方法。一、控制微生物生长繁殖的化学物质(一)抗生素概念：抗生素(Antibiotics)是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或影响它种生物的生命活动，如杀死或抑制微生物生长。定义：化学控制方法主要是指利用各种化学药剂控制微生物生长的方法。一、控制微生物生长繁殖的化学物质1.抗生素的作用机制抑制细菌细胞壁合成破坏细胞质膜作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化抑制蛋白质和核酸合成一、控制微生物生长繁殖的化学物质2.应用抗生素需要注意第一次使用的药物剂量要足避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素不同的抗生素(或与其他药物)混合使用对现有抗生素进行改造筛选新的更有效的抗生素一、控制微生物生长繁殖的化学物质（二）表面消毒剂概念：表面消毒剂(surfacedisinfactant)是指对一切活细胞都有毒性，但不能用作活细胞或机体内治疗的化学药剂。主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。一、控制微生物生长繁殖的化学物质（二）表面消毒剂石炭酸系数：指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）。一、控制微生物生长繁殖的化学物质是指一类在化学结构上与细胞内必要代谢物的结构相似，并可干扰正常代谢活动的化学物质。抗代谢物的作用：（1）竞争酶的活性中心（2）假冒正常代谢物（3）反馈抑制最常用的是磺胺类药物。磺胺与叶酸合成前体对氨基苯甲酸（PABA）的结构类似。（三）抗代谢药物——磺胺类药物一、控制微生物生长繁殖的化学物质（三）抗代谢药物——磺胺类药物

二氢蝶啶

+对氨基本甲酸二氢叶酸四氢叶酸辅酶F磺胺药核酸合成二氢叶酸合成酶二氢叶酸还原酶磺胺药作用机理：细菌需要利用对氨基本甲酸合成生长所需的叶酸，可以图示如下：磺胺药作用机制图一、控制微生物生长繁殖的化学物质为什么磺胺对人体细胞无毒性？因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶二氢蝶酸合成酶、二氢叶酸合成酶和二氢叶酸还原酶，故不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酸，而必须直接利用营养物中的叶酸做为生长因子。（三）抗代谢药物——磺胺类药物（一）高温灭菌（二）低温抑菌（三）过滤除菌（四）辐射灭菌（五）超声波灭菌第五节微生物生长繁殖的控制二、控制微生物生长繁殖的物理因素二、控制微生物生长繁殖的物理因素（一）高温灭菌干热灭菌：1500C～1700C下处理1-2小时。适用于玻璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌。优点：可保持物品的干燥火焰灭菌（灼烧灭菌）：常用于金属性接种工具、污染物品及实验材料等废弃物的处理。1、干热灭菌法二、控制微生物生长繁殖的物理因素（一）高温灭菌湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。2.湿热灭菌在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好。为什么？二、控制微生物生长繁殖的物理因素（一）高温灭菌湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。2.湿热灭菌在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好。为什么？二、控制微生物生长繁殖的物理因素（一）高温灭菌1.热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强2.热蒸汽比热空气穿透力强3.蒸汽潜热大，当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。二、控制微生物生长繁殖的物理因素（一）高温灭菌湿热灭菌的种类：煮沸消毒、高压蒸汽灭菌、间歇加热灭菌、巴氏消毒、实罐灭菌热致死时间(thermaldeathtime)：

即在一定温度下杀死所有某一浓度微生物所需要的最短时间。热死温度（thermaldeathtime）:

又称热死点，指在一定时间内（一般10min），杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最低温度。衡量灭菌效果的指标2.湿热灭菌高温对培养基的影响及其防止措施高温对培养基的不利影响：▲会产生混浊或形成不溶性沉淀▲营养成分被破坏（葡萄糖生成酮糖）；▲色泽加深（褐变如产生氨基糖等）；▲改变培养基的pH值（通常下降0.2）；▲形成有害物质，抑制微生物生长；消除有害影响的措施采用特殊的加热灭菌法过滤除菌