微生物学教学课件-第10章-微生物与基因工程

第10章微生物与基因工程是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。基因工程（geneticengineering）或重组DNA技术(recombinantDNAtechnology)第一节微生物基因工程的发展一、基因工程的发展历史对基因工程的建立与发展具有重要意义的几项关键技术：DNA的特异切割DNA的分子克隆（人工转化方法的建立）DNA的快速测序二、微生物学与基因工程的关系1）基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；2）基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的；3）微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中；4）为大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的；5）微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源6）有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得的，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导微生物学不仅为基因工程提供了理论基础，同时也提供了操作技术第二节微生物与克隆载体将外源DNA或基因片段携带入宿主细胞(hostcell)的工具称为载体(vector)作为克隆载体的基本条件：（1）在宿主细胞内必须能够自主复制(具备复制原点)（2）必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，

同时不影响其复制；有一定的选择标记，用于筛选；（3）最好有较高的拷贝数，便于载体的制备。基因工程的常用载体：质粒载体λ噬菌体载体柯斯质粒载体人工染色体2025/12/257pBR322质粒载体举例常用的克隆质粒载体:

pBR322

pUC系列

pGEM系列4363bp一、质粒克隆载体2025/12/258AmprTetr目的基因AmprTetr插入灭活四环素抗性基因pBR322BamHⅠ2025/12/259pUC质粒系列以pUC18/pUC19为代表

黏粒载体是一种由人工构建的含有λ噬菌体DNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的杂和质粒载体,具有质粒和噬菌体的双重特征，被称为cosmid，指带有粘性末端位点的质粒

黏粒载体在结构组成上具有

噬菌体的特性,也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力，一般可插入35～40kb的外源基因，是构建真核生物基因文库的主要载体二、黏粒载体三、人工染色体载体人工染色体酵母人工染色体（YAC）细菌人工染色体（BAC）利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体.2025/12/2513

YAC是酵母人工染色体（Yeastartificialchromosome）的缩写，是目前能容纳最大外源DNA片段的载体 把酵母染色体是利用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)染色体的复制元件构建的载体。YAC载体是结构上能够模拟真正酵母染色体的线状DNA分子。将大片段的基因组DNA连接到YAC载体的两个“臂”上，然后将连接物通过转化的方法导入酵母菌，这样就构成了重组的YAC。1.酵母人工染色体载体142．细菌人工染色体载体

是基于大肠杆菌的F质粒构建的，高容量低拷贝的质粒载体。BAC载体大小约7.5kb复制单元来自F质粒，包括严谨型控制的复制区oriS、启动DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（RepE)，以及3个确保低拷贝并使质粒精确分配至子代细胞的基因座(parA、parB和parC)。

BAC载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。第三节微生物与基因工程工具酶基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的一、限制性核酸内切酶能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。简称任何物种都有排除异物保护自身的防御机制，如人的免疫系统，细菌的限制与修饰系统，即限制酶(restrictionenzyme)与修饰酶(modifyingenzyme)组成的系统。限制性酶（restritionenzyme）。限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。1限制酶的发现与命名限制性内切酶的命名遵循一定的原则，主要依据来源而定，涉及宿主的种名、菌株号或生物型。命名时，依次取宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号，然后再加上序号(罗马字)。取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。EcoRI表示大肠杆菌属名第一个字母E：表示种名头两个字母co：表示株名R：表示该菌中第一个被分离出来的酶。I：根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为I、II、III三种类型I型和III型限制酶无切割特异性或特异性不强II型限制酶切割位点位于识别位点之内或在附近，特异性最强。2.限制酶的基本特性识别序列通常由4～8个碱基对组成，具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构（palindromicstructure）。所有限制酶切割DNA后，均产生含5

磷酸基和3

羟基的末端HindIII的识别序列：5`-AAGCTT-3`3`-TTCGAA-5`

5`-AAGCTT-3`3`-TTCGAA-5`切割后形成具有粘性末端（cohesiveend）的DNA片段：限制性酶不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割结果形成5

或3

单链突出的粘性末端的DNA限制片段。二个具有互相匹配的粘性末端的DNA片段可以通过碱基的互补及DNA连接酶的作用而重新连接起来。HpaI的识别序列：5`-GTTAAC-3`3`-CAATTG-5`5`-GTTAAC-3`3`-CAATTG-5`切割后形成具有平末端（bluntend）的DNA片段：限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段没有突出的单链。具有平末端的DNA片段也可以在DNA连接酶的作用连接起来不同的限制性核酸内切酶识别DNA中的碱基对序列长短不同。在随机排列的DNA序列中，识别位点序列长的限制酶，在酶切后所得到的DNA片段长，相反识别位点序列短的限制酶，酶切后所得到DNA片段短。二甲基化酶原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。DNA聚合酶(DNApolymerase)的主要活性是催化DNA的合成(在具备模板、引物、dNTP等的情况下)。真核细胞有4种DNA聚合酶，原核细胞有3种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关。三、DNA聚合酶DNApolymerasemovesalongtheoldstrandinthe3'-5'direction,creatinganewstrandhavinga5'-3'direction.四DNA连接酶连接酶(ligase)就是将两段核酸连接起来的酶，相当于基因工程中的“糨糊”。现已发现几种不同来源或作用于不同底物的连接酶。

T4DNA连接酶T4DNA连接酶（T4DNAligase）的相对分子质量为6.8×104，催化DNA5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。反应底物为黏末端、切口、平末端的RNA（效率低）或DNA。低浓度的聚乙二醇PEG（一般为10%）和单价阳离子（150-200mmol/LNaCl）可以提高平末端连接速率。许多试剂公司研制出5min连接的T4DNA连接酶，在短时间内在室温下可完成黏末端或平末端连接反应。

大肠杆菌DNA连接酶

该酶是从正常的大肠杆菌中提取的，由大肠杆菌基因组中lig基因编码，分子量为75ku，需要NAD+作为辅助因子。

具有同源互补粘性末端的不同DNA分子一条带有切口的双链DNA分子该酶可连接但,该酶几乎不能催化两个平头末端DNA分子的连接TaqDNA连接酶可在两个寡核苷酸之间进行连接反应，同时必须与另一DNA链形成杂交体，相当于连接双链DNA中的缺口，作用在45~65℃，需NAD+。可用于检测等位基因的变化以及在PCR扩增中引入寡核苷酸

TaqDNA连接酶

T4RNA连接酶T4RNA连接酶可以催化单链DNA或RNA的5'磷酸与另一单链DNA或RNA的3'羟基之间形成共价连接。单链DNA或单链RNA的5'端磷酸基团可连接带3'羟基的DNA或RNA或单核苷酸pNp，因此T4RNA连接酶可用于标记RNA的3'端、单链DNA或RNA的连接、增强T4DNA连接酶的连接活性以及合成寡核苷酸。（1）蛋白酶K(proteinaseK)是具有高活性的丝氨酸蛋白酶，属枯草杆菌蛋白酶，由霉菌Tritirachiumalbumvar.limber产生。K指该蛋白酶通过水解角蛋白(keratin)可以为该霉菌提供所有需要的碳源和氮源。（2）蛋白酶K可以水解范围广泛的肽键，尤其适合水解羧基末端至芳香族氨基酸和中性氨基酸之间的肽键。（3）成熟的蛋白酶K相对分子质量为2.9*104

，在50℃的活性比在37℃高许多倍。由于蛋白酶K可有效地降解内源蛋白，所以能快速水解细胞裂解物中的DNA酶和RNA酶，以利于完整DNA和RNA的分离。（4）蛋白酶K是一种常用的蛋白酶，常用于去除残留的酶类以及样品中的蛋白质。五、蛋白酶K溶菌酶(lysozyme)是一类水解细菌细胞壁中肽聚糖的酶，又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramideglycanohydrlase），是一种碱性酶。在分子克隆中常用的是卵清溶菌酶，用于破碎细胞。溶菌酶（lysozyme）主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。六、溶菌酶基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的分离、合成与诱变2、外源基因导入宿主细胞3、目的基因克隆的筛选和鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用

确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。第四节基因工程操作流程一、目的基因的分离或合成1目的基因主要是编码蛋白质的基因：如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。2获取目的基因的常用方法：1、从基因文库分离基因2、从cDNA文库分离基因3、化学合成基因4、PCR扩增基因5、利用基因定位诱变获得突变基因1.从基因文库分离基因基因文库是指包含某一生物基因组DNA片段的全部克隆，即将整个基因组DNA切成片段，并用合适的载体将全部DNA片段进行克隆。文库中每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。一个理想的基因文库应包括该生物基因组的全部遗传信息（即全部DNA序列）2.从cDNA文库分离基因编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码序列。即不含非编码区和内含子基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部DNA

许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库cDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库某种生物某个时期的mRNA3.基因的化学合成如果已知某种基因的核苷酸序列，或某种蛋白质的氨基酸序列，就可通过化学法合成这一基因。基因的化学合成是先合成许多寡核苷酸，彼此交错互补，然后再将它们连接起来，成为双链DNA。基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成4.PCR扩增基因1概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。2原理：DNA复制原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶多聚酶链式反应体外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列PCR技术的操作过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一5.利用基因定位诱变获得突变基因定位诱变技术就是指按照设计要求，在体外将基因特定区域的碱定位诱变（site-directedmutagenesis）是利用合成的DNA和重组DNA技术在基因精确限定的位点