DB51∕T 1185-2025 桑蚕微粒子病诊断防控技术规程

ICS65.020.30

CCSB47

DB51

四川省地方标准

DB51/T1185—2025

代替DB51/T844—2008，DB51/T1185—2011

桑蚕微粒子病诊断防控技术规程

2025-09-15发布2025-10-15实施

四川省市场监督管理局发布

DB51/T1185—2025

目次

前言..................................................................................II

1范围.................................................................................1

2规范性引用文件.......................................................................1

3术语和定义...........................................................................1

4诊断技术.............................................................................1

5防控技术.............................................................................5

附录A（资料性）微粒子孢子图..........................................................10

附录B（资料性）DNA普通提取法........................................................11

附录C（资料性）荧光定量PCR产物相关信息..............................................12

附录D（资料性）阳性质粒的制备........................................................13

I

DB51/T1185—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件代替DB51/T844—2008《桑蚕微粒子病防治技术规程》和DB51/T1185—2011《桑蚕微粒子

病诊断技术规程》。与DB51/T844—2008和DB51/T1185—2011相比，除结构性调整和编辑性改动外，

主要技术变化如下：

——增加了桑叶全程消毒技术（见5.2.5）。

——增加了实时荧光定量PCR检测法（见4.2）。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由四川省农业农村厅提出、归口、解释并组织实施。

本文件起草单位：四川省蚕业管理总站、西南大学、四川省农业科学院蚕业研究所。

本文件主要起草人：吴钢、马露芸、潘敏慧、青学刚、董战旗、王琳璐、杨炯、李文学、魏卓娅、

王晶晶。

DB51/T844—2008和DB51/T1185—2011的历次版本发布情况为：

——DB51/T844于2008年首次发布；DB51/T1185于2011年首次发布。

——本次为第一次修订。

II

DB51/T1185—2025

桑蚕微粒子病诊断防控技术规程

1范围

本文件规定了桑蚕微粒子病诊断和防控技术要求，确立了常规诊断及实时荧光定量PCR检测的流程

和方法，描述了防控的关键环节及防控内容。

本文件适用于四川省桑蚕微粒子病的诊断和防控。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T1027桑园用药技术规程

DB51/T848养蚕消毒技术规程

DB51/T1187桑蚕原蚕基地建设规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

桑蚕微粒子病pebrineforsilkworm(Bombyxmori)

由桑蚕微孢子虫（NosemabombycisNaegeli）感染引起的蚕病。

3.2

补正检查correctiveinspectionforpebrine

从母蛾检疫合格的原蚕种中，逐卵圈抽取少量蚕卵置于温度（29±0.5）℃、相对湿度大于等于85%

的条件下催青，对孵化蚁蚕及卵壳、死卵，或原蚕种正常收蚁后的催青死卵、尾蚁、卵壳等，进行微粒

子病检查。

3.3

预知检查predictiveinspectionforpebrine

从饲养到制种全过程，对幼虫、蛹、成虫，蚕粪、熟蚕尿、蛾尿等排泄物，蜕皮壳、蛹壳、鳞毛等

脱出物等抽样，进行微粒子病检查。

4诊断技术

4.1常规诊断

4.1.1主要仪器设备

包括：

1

DB51/T1185—2025

——普通光学显微镜、相衬（相差）显微镜，放大倍数16倍×40倍；

——生化培养箱，温度范围10℃～50℃，湿度范围50%～95%；

——普通冰箱，温度为0℃～4℃、-20℃；

——电子天平，精度0.001g；

——离心机，转速0r/min～3000r/min。

4.1.2试剂

包括：

——氢氧化钾溶液[w(KOH)=2％]；

——浓盐酸[w(HCl)=30％];

——过氧化氢溶液[w(H2O2)=10％]；

——乙醇溶液[w(CH3CH2OH)=75％]；

——无菌水；

——分析用水按GB/T6682规定执行。

4.1.3耗材

包括：

——解剖剪、镊子、橡皮吸管；

——研钵、研磨棒；

——样品袋、离心管（1.8mL、5mL）；

——容量瓶、量筒、烧杯；

——载玻片、盖玻片；

——无纺布滤纸。

4.1.4外观观察

通过肉眼观察，蚕的不同发育阶段是否具有下列症状：

a)卵期：卵形不正，排列不齐、多重叠卵；卵产附差、易脱落，不受精卵和死卵多；催青期发育

不整齐；

b)小蚕期：收蚁后不疏毛；体色深暗、体躯瘦小；发育缓慢、重症死亡；群体发育不齐；

c)大蚕期：表皮缩皱、体呈锈色；体壁出现微细不规则黑褐色病斑，以尾角末端、气门周围和胸

腹足外侧部位较多；蜕皮困难、死亡；群体发育不齐；

d)蛹蛾期：蛹反应迟钝；表皮无光泽、腹部松弛，体壁出现微细不规则黑褐色病斑；感病严重的

不化蛾、死亡；蛾羽化展翅不良、鳞毛脱落；腹部膨大、节间松弛；交配能力差；产卵少。

4.1.5解剖观察

将外观观察的具有上述大蚕期典型症状的病蚕，用解剖剪从背中线剪开，肉眼观察丝腺是否有乳白

色脓疱状斑块。

4.1.6显微镜检查

4.1.6.1样品采集

采集4.1.4描述的典型症状的卵、小蚕、大蚕、蛹、蛾，样品置于样品袋或离心管中，做好记载。

4.1.6.2样品处置

2

DB51/T1185—2025

每份样品先混合均匀，再分成2份，其中1份作为检样，另1份作为备样保存于4℃冰箱中备用，

保存期30d～60d。

不同发育阶段的样品，按照下列方法处置：

a)卵期样品解除滞育后，在生化培养箱温度（29±0.5）℃、相对湿度大于等于85％的条件下催

青；孵化后待其自然死亡；

b)小蚕期蚁蚕样品在生化培养箱温度（29±0.5）℃、相对湿度大于等于85%的条件下，放置2d～

3d；

c)小蚕期其他阶段、大蚕期、蛹期、蛾期样品不需处置。

4.1.6.3样本制备

将上述处置后的样本分别置于研钵中，每个研钵各放1个研磨棒，磨碎；滴入氢氧化钾溶液

[w(KOH)=2％]，研细备用。

4.1.6.4显微镜观察

4.1.6.4.1直接观察法

按照序号，将磨碎液用研磨棒点样至载玻片，盖上盖玻片，制成镜检样本，用普通光学显微镜观察。

4.1.6.4.2离心沉淀法

将4.1.6.3制备的磨碎液，加入适量无菌水，用无纺布滤纸过滤后，将滤液移入离心管中，经3000

r/min离心3min，倾去上清液，沉淀物振荡制成镜检样本，用普通光学显微镜观察。

4.1.6.4.3酸溶解法

将检出有微粒子孢子的磨碎液吸取2滴，分别滴于载玻片两端，自然干燥后在其中1点加1滴浓盐

酸[w(HCl)=30％]，另1点作对照，在30℃生化培养箱中放置10min～20min后，盖上盖玻片，用普

通光学显微镜观察。如果样本已干，可加无菌水1滴。经过酸处理的样本，微粒子孢子溶解消失，真菌

孢子保持原状。

4.1.6.4.4过氧化氢法

将检出有微粒子孢子的磨碎液吸取1滴，滴于载玻片上，再加1滴～2滴过氧化氢溶液

[w(H2O2)=10％]，盖上盖玻片，经过10min～30min，用相衬（相差）显微镜观察，活微粒子孢子释放

出极丝。

4.1.7判定

判定方法如下：

a)通过外观观察，蚕的不同发育阶段出现4.1.4表述症状之一的，可疑似为微粒子病；

b)通过解剖观察，大蚕期病蚕丝腺出现可见的乳白色脓疱状斑块时，可确诊为微粒子病；

c)通过普通光学显微镜观察，发现孢子呈卵圆形或长卵圆形，淡绿色，折光性强，中间隐约可见

1根黑色线状物，表面光滑，孢子活泼，多左右摆动，有时可见翻滚现象时，孢子则为微粒子

孢子（参见附录A），原样品确诊为微粒子病；

d)加盐酸作用后，在普通光学显微镜下观察，被溶解的孢子为微粒子孢子，原样品确诊为微粒子

病；

e)加过氧化氢作用后，在相衬（相差）显微镜下观察，活微粒子孢子释放出极丝，原样品确诊为

微粒子病。

3

DB51/T1185—2025

4.2实时荧光定量PCR检测法

4.2.1主要仪器设备

包括：

——水浴锅；

——高压灭菌锅；

——二级生物安全柜；

——普通冰箱，温度为0℃～4℃、-20℃；超低温冰箱，温度为-80℃；

——紫外分光光度计；

——荧光定量PCR仪，温度范围4.0℃～99.9℃；

——高速冷冻离心机，转速为0r/min～16000r/min；

——微量可调移液器，最大量程分别为2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL；

——超微量核酸蛋白测定仪。

4.2.2试剂

包括：

——超纯水（Rnase/Dnasefree,Sterile）；

——分析用水按GB/T6682规定执行。

4.2.3耗材

包括：

——枪头、离心管；

——研钵、研磨棒。

灭菌后使用。

4.2.4样品处置

4.2.4.1样本制备

不同发育时期的样品，按照下列方法制样：

a)卵期：取200粒蚕卵；

b)小蚕期：取50头蚁蚕、20头～30头小蚕；

c)大蚕期：取3头～5头大蚕；

d)蛹期：取3个～5个蚕蛹；

e)蛾期：取1只～3只母蛾。

以上样品均使用研钵充分研磨破碎，保存于4℃冰箱备用。

4.2.4.2DNA提取与保存

取4.2.4.1制备好的样品，使用经过质量验证的或等效的市售商品化微生物DNA提取试剂盒，按照试

剂盒说明书步骤提取DNA。DNA普通提取法参见附录B。

提取好的DNA模板保存于-20℃冰箱备用，保存期限宜在6个月内；长期保存应置于-80℃冰箱。

4.2.5定量PCR检测

4.2.5.1引物序列

4

DB51/T1185—2025

包括：

——正向引物：5'-ACGGAAGAATACCACAAGGAGT-3’；

——反向引物：5'-CACTACATCTGTCTAAATGAGGGTC-3’；

——探针：5'-FAM-CGTTGAGTCAAATTAAGCCGCACA-TAM-3’。

荧光定量PCR产物相关信息参见附录C。

4.2.5.2PCR反应体系

反应体系20μL：2X探针法qPCRMix10μL，10umol/L正、反向引物各0.4μL，10μmol/L

探针0.4μL，DNA模板2μL，超纯水（Rnase/Dnasefree,Sterile）6.8μL。每个样品设3个重复。

以含有经4.2.5.1引物扩增的GNL8基因片段的阳性质粒DNA（拷贝数为1.0×103个/μL，制备方法参见附

录D）替代DNA模板作为阳性对照；以超纯水（Rnase/Dnasefree,Sterile）代替DNA模板作阴性对照。

反应程序：95℃预变性2min；95℃5s，60℃30s（荧光信号在每个循环的此阶段进行），循环

从第2个步骤开始，共40个循环。可按照其它市售商品化试剂盒说明书进行荧光定量PCR反应。

4.2.5.3PCR反应质量控制

对照组的检测结果应符合以下情况，此次检测方为有效：

——阴性对照无Ct值，且无扩增曲线；

——阳性对照的Ct值应在21～23之间，并出现典型的扩增曲线。

4.2.6判定

根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。判定规则如下：

a)待测样本检测Ct值小于或等于35，且出现典型的扩增曲线，判定原样品检出微粒子；

b)待测样本检测Ct值大于35，且未出现典型的扩增曲线，判定原样品未检出微粒子；

c)若阴性对照Ct值小于35，或阳性对照Ct值大于35或没有Ct值，则重新检测。

5防控技术

5.1蚕前防控

5.1.1抽样

5.1.1.1时间及范围

养蚕前，对蚕室、蚕具、养蚕环境和桑园等，进行抽样。

5.1.1.2方法

用消毒棉签在冷开水中浸湿后蘸擦取样，或用乙醇溶液消毒小刀后刮取抽样。抽取的每个样品分别

放入样品袋，并记录抽样时间、地点、样品名称、抽样人等信息。

5.1.2制样检查

将抽取的样品分别置于研钵中，固体样本加入适量氢氧化钾溶液[w(KOH)=2％]，研磨后按照序号点

板制镜检样本，在显微镜下观察，每个样本观察不少于10个视野，记录镜检结果。

5.1.3消毒

按照DB51/T848中6.1的规定执行。消毒后再抽样镜检，直至镜检无微粒子孢子。

5

DB51/T1185—2025

5.2蚕中防控

5.2.1补正检查

包括催青检查、尾蚁检查、死卵及卵壳检查。

5.2.1.1抽样及样品处置

补正检查抽样及样品处置见表1。

表1抽样及样品处置

项目抽样样品处置

逐批逐张逐蛾圈抽取晚产卵、不受精卵和参照4.1.6.2a)规定执行。原种按张平均分为4个样、

催青检查

死卵，每蛾抽取20粒～30粒。原原种按张平均分为2个样、母种每蛾1个样本。

尾蚁检查收蚁完毕的蚕连纸上孵化的尾蚁。待尾蚁自然死亡，1张为1个样本。

死卵及卵壳将尾蚁扫下后蚕连纸上的所有死卵、不受

不需处置，1张为1个样本。

检查精卵及卵壳等。

5.2.1.2样本制备

按照4.1.6.3或4.2.4.1的规定进行样本制备。

5.2.1.3结果处置

按照4.1.7或4.2.6的规定进行诊断，诊断出有微粒子的，对号淘汰整张蚕种。

5.2.2卵面消毒

平附蚕种催青至点青时，用干净排笔蘸取含有效氯0.33％的漂白粉液，刷于卵面及蚕连纸正面和

背面，用量以蚕连纸湿润不滴液为度。原原种、母种连纸可直接浸入前述消毒液中消毒10s，取出。

蚕种消毒后，平摊于蚕箔中阴干后及时转入黑暗抑制保护。

5.2.3蚕期消毒

包括蚕体蚕座消毒、蚕室地面及周围环境消毒、用具消毒。

消毒方法和程序按照DB51/T848中6.2的规定执行。

5.2.4其他卫生消毒

包括洗手消毒、蚕沙处理、病蚕处理、进出蚕室消毒。

消毒方法和程序按照DB51/T848中6.2.4的规定执行。

5.2.5桑叶全程消毒

5.2.5.1消毒液有效氯含量

消毒液为漂白粉澄清液，有效氯含量见表2。

6

DB51/T1185—2025

表2消毒液有效氯含量

龄期攀西地区其他地区

小蚕期0.30%～0.33%0.33%～0.35%

大蚕期0.35%～0.38%0.36%～0.38%

5.2.5.2消毒方法

桑叶抖散后放入消毒池，使叶面充分浸渍消毒液。浸渍时间见表3。浸渍期间检测有效氯浓度1次～

2次，排气泡1次～2次。桑叶浸渍完毕保持湿润。从桑叶浸渍开始计时，30min后甩干。消毒后的桑

叶摊入贮桑室消毒桑叶专用区域，抖散，保持疏松，晾干待用。

消毒液现用现配。浓度降低时，及时补充母液。每浸消3次桑叶更换消毒液1次。

表3浸渍时间

龄期攀西地区其他地区

小蚕期5min～10min10min～15min

大蚕期5min～10min5min～10min

5.2.6预知检查

5.2.6.1内容

包括蚕期检查、蔟中检查、蛹期检查、苗蛾检查。

根据预知检查情况，可进行发蛾促进检查。

5.2.6.2抽样及样品处置

预知检查抽样及样品处置见表4。

表4抽样及样品处置

项目抽样样品处置

每龄每饲育区（原蚕每张或每饲育户）

不需处置。小蚕每10头～20头、大蚕每3头～5头为1个样

蚕期检查抽取弱小蚕、病死蚕、迟眠蚕、迟起蚕

本。

等约50头。

采茧时，每饲育区（原蚕每饲育户）抽

蔟中检查不需处置。每2头为1个样本。

取不结茧蚕、薄皮茧蚕、死蚕。

削茧时，每饲育区（原蚕每饲育户）的

蛹期检查每箔抽取除明显感染细菌、病毒、真菌不需处置。每1粒～2粒为1个样本。

等外的病死蛹的50%。

置于温度30℃、相对湿度大于等于80％的条件下保护，

原蚕上蔟3d时，每饲育户随机抽取700

发蛾促进检查上蔟第9d削茧，蛹摊放于小蚕网袋中，待80％发蛾时制

粒种茧。

样。每2蛾～5蛾为1个样本。

每饲育区（户）抽取最早羽化的苗蛾10

苗蛾检查不需处置。每2蛾～5蛾为1个样本。

蛾～20蛾。

7

DB51/T1185—2025

5.2.6.3样本制备

按照4.1.6.3或4.2.4.1的规定进行样本制备。

5.2.6.4结果处置

按照4.1.7或4.2.6的规定进行诊断，诊断出有微粒子的，对号整区（户）淘汰蚕（茧、蛹、蛾）。

5.2.7选蚕、选茧、选蛹、选蛾

选出淘汰具有下列症状的蚕、茧、蛹、蛾，经消毒后集中处理：

a)蚕期：弱小蚕、迟眠蚕；

b)茧期：薄皮茧、血茧、小茧及不结茧蚕；

c)蛹期：病死蛹、肥胖蛹、黑斑蛹、腹部环节松弛并手触反应迟钝的蛹；

d)蛾期：苗蛾、尾蛾，以及卷翅、黑环节、大肚、鳞毛脱落、黑斑等症状的蚕蛾。

5.2.8种茧、蛹期摊放与合批

不同级别的蚕种按以下方式处理：

a)原原种种茧、蛹期分饲育区摊放于饲育盒中。选留蛾区确定后，苗蛾预知检查无微粒子的，小

系内可合并制种；

b)原种种茧、蛹期分饲育区摊放于蚕箔中。蔟中、蛹期及苗蛾预知检查无微粒子的，可合并制种；

c)原蚕种茧、蛹期分饲育区（户）摊放于蚕箔中。蔟中、蛹期、发蛾促进及苗蛾预知检查无微粒

子的，可合并制种。

5.3蚕后防控

养蚕制种结束后，养蚕相关环境用具应及时全面清洗、消毒。消毒方法按照DB51/T848中6.3的规

定执行。

5.4桑园防控

桑园宜避免间、套作十字花科作物。桑树病虫害及野外昆虫的防治按照NY/T1027中7的规定执行。

5.5桑叶采运

贮运桑叶的用具，使用后应立即用含有效氯1％的漂白粉澄清液消毒后待用。桑叶采摘时应除去虫

口叶、病虫污染叶。桑叶运输进入蚕房，应与除沙道路分离。

5.6环境防控

5.6.1附属室及配套设施防控

5.6.1.1清洁消毒

5.6.1.1.1使用前、后，催青室、保种室、蚕种整理室、浸酸浴消场、冷库、检验室等附属室，应清

扫遗漏的蚕卵、灰尘及废弃蚕连纸、散卵盒等，集中销毁；地面用含有效氯1％的漂白粉澄清液消毒1

次。

蚕种架、蚕种筐、蚕箔等相关用具消毒按照DB51/T848资料性附录A的规定执行。

5.6.1.1.2使用结束，催青室、保种室、蚕种整理室清扫后，应密闭消毒1次，方法按照DB51/T848

8

DB51/T1185—2025

资料性附录A.5、A.7的规定执行。

冷库停库后，及时清扫库房及其环境，库房地面及环境用含有效氯1％的漂白粉澄清液消毒1次。

5.6.1.2日常卫生

换鞋入室，非工作人员不应随意进入。

5.6.2原蚕区防控

包括原蚕区的选择、原蚕户的选择和原蚕饲育。

按照DB51/T1187中4、5、6的规定执行。

9

DB51/T1185—2025

A

A

B

B

附录A

（资料性）

微粒子孢子图

微粒子孢子如图A.1所示。

图A.1微粒子孢子图

10

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附录B

（资料性）

DNA普通提取法

B.1主要仪器设备

包括：

——水浴锅；

——高压灭菌锅；

——普通冰箱，温度为0℃～4℃、-20℃；超低温冰箱，温度为-80℃；

——高速冷冻离心机，转速为0r/min~16000r/min；

——微量可调移液器，最大量程分别为2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL；

——超微量核酸蛋白测定仪。

B.2试剂

包括：

——PBS缓冲液[组分：NaCl136.89mmol/L；KCl2.67mmol/L；Na2HPO48.lmmol/L；KH2PO41.76

mmol/L；pH=7.2～7.4)]；

——蛋白酶K[20mg/mL]；

——Tris饱和酚[10mmol/L；pH=7.8～8.0]；

——氯仿、异戊醇、异丙醇；

——乙醇溶液[w(CH3CH2OH)=75％]；

——TEbuffer[10mmol/LTris，1mmol/LEDTA，pH8.0]；

——无菌水；

——分析用水按GB/T6682规定执行。

B.3方法

取4.2.4.1制备好的样品2.0g，加入500mLPBS缓冲液和5μL蛋白酶K溶液，55℃水浴2h。加入

等体积的Tris饱和酚，颠倒充分混匀5min，4℃，12000r/min离心10min，取上清液；加等体积的酚∶

氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），颠倒充分混匀5min，4℃，12000r/min离心10min，取上清液。加入

0.8倍体积的冷冻异丙醇，-80℃沉淀15min。4℃，12000r/min离心10min，小心倾倒上清液；加

入600μL冰乙醇[w(CH3CH2OH)=75％]，轻轻转动，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中，放置5min，

12000r/min离心3min，小心倾倒上清液，并用移液枪吸掉残余液体；再加入冰乙醇[w(CH3CH2OH)=75％]，

将DNA再洗一次，12000r/min离心2min，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上，数分钟后直

立离心管，自然风干。加入100μLTEbuffer（pH8.0）溶解DNA，在37℃金属浴中保温30min；使

用超微量核酸蛋白测定仪测定提取的核酸浓度，并根据测量的数值将DNA浓度稀释至100ng/μL以内作为

DNA模板。

11

DB51/T1185—2025

附录C

（资料性）

荧光定量PCR产物相关信息

C.1检测基因

家蚕微孢子虫GNL8rRNA基因，GenBank登录号：MT510146.1（745~928）。

C.2扩增产物大小

扩增产物大小为183bp。

C.3扩增产物