COE诱导16HBE细胞恶变过程中lncRNA的检测

COE诱导16HBE细胞恶变过程中lncRNA的检测DetectionoflncRNAintheprocessofmalignanttransformationof16HBEinducedbyCOE摘要目的寻找焦炉逸散物(COE)诱导正常支气管上皮细胞(16HBE)发生恶变过程中表达差异的长链非编码RNA(lncRNA)。方法1、差异lncRNA的筛选提取正常支气管上皮细胞和COE诱导发生恶变的肺鳞癌细胞的总RNA，送公司进行转录组测序，拟挑选在两组细胞中差异倍数大于2或者小于0.5，p值小于0.05（经FDR校正）的lncRNA作为表达差异的lncRNA。2、差异lncRNA的验证查阅相关文献，挑选研究较少且差异显著的lncRNA进行验证。首先提取正常支气管上皮细胞和COE诱导发生恶变的肺鳞癌细胞的总RNA，逆转录为cDNA，利用qRT-PCR技术对挑选的差异lncRNA进行验证。3、调控性lncRNA的确定采用Spearman等级相关系数对lncRNA与基因表达量进行相关性分析，相关系数r>0.4（r<–0.4），则认为两者存在正（负）相关。我们认为与lncRNA表达相关的基因数越多，则这个lncRNA为调控性lncRNA。结果1、lncRNA芯片结果检测显示以筛选标准FDR＜0.05,foldchange>2倍，p<0.05计，转录组测序出来的差异lncRNA有899个。2、进一步挑选标准FPKM>20的lncRNA包括SFTA1P、AL031600.1、AC124312.2。3、SFTA1P、AL031600.1、AC124312.2调控的基因数分别为82、4、16。结论1、部分lncRNA在人支气管上皮恶变细胞中出现表达差异。2、推测lncRNA可能与人支气管上皮细胞恶性转化的分子机制密切相关，SFTA1P、AL031600.1、AC124312.2可以作为分子性生物标记物用于易感人群的筛检和肺癌的早期诊断。关键词：焦炉逸散物人支气管上皮细胞细胞恶性转化长链非编码RNAABSTRACTObjectTofindlongnoncodingRNAsexpressingdifferencesinnormalhumanbronchialepithelialcellsduringmalignanttransformationinducedbycokeovenemissions.Methods1ScreeningofdifferentiallncRNAToextractthetotalRNAfromnormalbronchialepithelialcellsandCoe-inducedmalignantlungsquamouscellcarcinoma,tosendthecompanytosequencingthetranscriptiongroup,andtoselectlncRNAwithdifferencemultiplesgreaterthan2orlessthan0.5,pvaluelessthan0.05(correctedbyFDR)inthetwogroupsofcellsaslncRNA.2ValidationofdifferentiallncRNAReviewtherelevantliteraturesandselectthelncRNAwithlessresearchandsignificantdifference.ThetotalRNAfromnormalbronchialepithelialcellsandtheCoe-inducedmalignanttumorofthelungsquamouscellcarcinomawasextracted,andtheQRT-PCRtechniquewasusedtoverifytheselecteddifferencelncRNA.3DeterminationofRegulatorylncRNAThecorrelationbetweenlncRNAandgeneexpressionwasanalyzedbySpearmangradecorrelationcoefficient,andthecorrelationcoefficientr>0.4(R<–0.4)wasconsideredtohavepositive(negative)correlation.WebelievethatthemoregenesassociatedwithlncRNAexpression,thelncRNAistheregulatorylncRNA.Results1LncRNAchipresultsshowedthatthescreeningstandardFDR<0.05,foldchange>2times,p<0.05,thetranscriptomesequencingdifferencelncRNAhas899.2FurtherselectionofstandardFPKM>20lncRNAincludesSFTA1P,AL031600.1andAC124312.2.3SFTA1P,AL031600.1andAC124312.2controlgeneswere82,4and16respectively.Conclusion1PartiallncRNAexpressionisdifferentincancerationcellsofhumanbronchialepithelialcells.2.ItispresumedthatlncRNAmaybeoneofthemolecularmechanismsofmalignanttransformationofhumanbronchialepithelialcells.SFTA1P,AL031600.1andAC124312.2canbeusedasmolecularbiomarkersforscreeningofsusceptiblepopulationandearlydiagnosisoflungcancer.Keywords:cokeovenemissions;humanbronchialepithelialcell;cellmalignanttransformation；longnon-codingRNA目录前言……………………1材料与方法……………32.1材料………………32.2方法………………32.2.1芯片实验………………………32.2.2qRT-PCR技术对差异lncRNA的验证…………42.2.3调控性lncRNA的确定………5结果……………………53.1转录组测序出来的差异lncRNA………………53.2lncRNA的验证…………………73.3调控性lncRNA的确定…………94讨论…………………95结论…………………106谢辞…………………107参考文献……………118毕业论文（设计）成绩评分表……………………129附录…………………12前言肿瘤（tumor，neoplasm）是机体在各种致瘤因素所用下，局部组织的细胞在基因水平上失去了其对生长的正常调控，导致异常增生而形成的新生物。它是一直多基因遗传的常见病和多发病，在其发生发展过程中，遗传因素与化学因素、物理因素、生物因素（病毒）等环境因素长期、多阶段的相互作用［1-3］。其中九成以上是恶性肿瘤，也就是癌症（cancer）。癌症是局部组织细胞增殖和分化异常而导致的细胞生长失控，伴随着肿瘤局部浸润和远处转移等生物学特征，是一个多因子、多步骤的复杂过程，其危险因素包括不良生活习惯，环境污染，遗传因素等，分为引发、促长和进展三个阶段［4-5］。在全世界范围内，据世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构（IARC）的世界癌症报告数据显示：2000年，全球恶性肿瘤患者约2200万人，每年新增患病人数约为1010万人，每年死亡人数约为620万人，占全部死亡人数的12%，在发展中国家占9%，在发达国家占21%。2008年，全球恶性肿瘤患者约为24600万人，每年新增人数约为12700万人，死亡人数约为760万人，其中发展中国家新发病数约占全世界的56%，而死亡人数约占世界的63.7%。由于人类生活习惯以及人口结构变化和环境污染加剧，预计到2020年，各项统计结果将是2000年数据结果的两倍，预测到2030年癌症死亡人数将高达1150万人。肺癌（lungcancer）也就是原发性支气管肿瘤（primarybronchogeniccarcinoma），为起源于支气管粘膜或腺体的恶性肿瘤。肿瘤发病与吸烟、职业致癌因子、空气污染、电离辐射、饮食和营养、遗传和基因改变等密切相关。其中，由于烟雾中的尼古丁和苯并芘等均有致癌作用，吸烟成为诱发肺癌的首要原因［6］。职业致癌因素包括煤焦油、石棉、砷等。室内小环境和室外大环境污染中均含有致癌物。大剂量电离辐射能引起肺癌。而食用富含Β胡萝卜素的绿色、黄色和黄绿色蔬菜和水果可作为保护作用减少肺癌的危险性。与此同时，我们已逐步认识到，肺癌很可能是外因导致内因发病的一种疾病［7-10］。在世界范围内，世界卫生组织（WHO）调查数据显示，2008年，肺癌年发病人数约为16万人，年死亡人数约为140万人，在世界常见恶性肿瘤发病率和死亡率排行中均占首位。而在我国，发病率和死亡率均处于持续不断升高趋势，肺癌发病率为肿瘤的首位，也是所有癌症死亡的首要原因。在1973年～2005年间肺癌死亡率增加了464.65%，由1973年～1975年间的7.1/10万增加到1990年～1992年间的17.5/10万人，增长147.7%。自2004年至2007年间，肺癌发病率从45.22/10万人增加至51.25/10万人，主要高发城市有北京、天津、上海等发达城市。城市死亡率从32.66/10万人增加到46.56/10万人，增长15.96%；农村死亡率从28.67/10万人增加到33.58/10万人，增长17.13%。肺癌已成为影响人类公共健康的重大问题之一，给全世界各个国家和地区造成了极大的直接经济损失和间接经济损失，美国和欧盟每年用于肺癌的费用数额巨大，而在我国，如果不及时控制吸烟并治理环境污染问题，预计到2025年，每年肺癌人数将超过100万，成为世界第一肺癌大国。目前，癌症状况不容忽视。在我国，据国家卫生部全国卫生事业发展情况统计显示，我国肿瘤发病率已经上升到127例/10万人，从20世纪70年代至21世纪初死亡率上升了83.13%。2000年，癌症占居民死亡原因的19%，在北京和上海分别为24%和26%。进入21世纪以来，恶性肿瘤的每年新发病约为282万人，死亡约为196万人，带癌生存86万人。2005年，农村地区人口恶性肿瘤以107.1/10万人居死因第三位，而在城市人口中以126.0/10万人居第一位。目前，按死亡率高低排列最常见的恶性肿瘤，在女性分别为乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、子宫颈癌、肝癌、卵巢癌、食管癌等;在男性分别为肺癌、肾癌、肝癌、结直肠癌、食管癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病等。由此可知，近半个世纪以来，世界癌症的发病率和死亡率一直处于上升趋势，恶性肿瘤已经成为人类死亡构成的重要病因，是目前危害人类健康和生命安全的最严重的重大疾病之一，全世界各个国家和地区恶性肿瘤的疾病负担均呈不断上升趋势，而当代面临的最重要的公共卫生问题之一就是肿瘤的预防和控制。随着人口不断增长和人口结构老龄化加快，在未来的几十年内，发展中国家癌症疾病负担将持续快速增加，而在我国，恶性肿瘤给国民经济造成了重大损失，给个人、家庭和社会造成沉重负担。癌症作为一种常见的多基因遗传病，是遗传易感性和环境因素共同作用的结果，其中，环境因素占主导作用。环境因素包括化学因素、物理因素、生物因素等，其中最主要的是化学因素，即因化学致癌物（chemicaicarcinogen）而导致的化学致癌作用（chemicalcarcinogenesis）［11-12］。化学致癌物是指能引起人类和动物肿瘤、具有化学致癌作用并增加其发病率和死亡率的化学物质。化学致癌作用即化学致癌物作用于正常细胞使其恶化并最终发展成为肿瘤的过程。化学致癌物从开始作用到肿瘤发生并出现明显临床症状有一段相当长的潜伏期。而到目前为止，经确定对人类和动物有致癌作用的化学致癌物已有1000多种，包括多环芳烃、真菌毒素、烷化剂和酰化剂等［13］。目前，关于化学致癌物研究比较多也比较明确的是多环芳烃类。多环芳烃（polycyclicaromatichydrocarbon，PAHs）主要来源于各种含碳有机物的热解和不完全燃烧，如煤、石油产品的燃烧、烹调油烟以及各种有机废物的焚烧等。目前已经发现200多种PAHs，其中致癌性相当强的有3,4-苯并芘，1,2,5,6-双苯并蒽等。第一个被发现的致癌作用很强的环境化学污染物是苯并A芘（benzoApyrene，Bap），它是唯一经吸入染毒实验证实可引起肺癌的PAH。它是煤焦油的主要致癌成分，而煤焦油挥发物是焦炉逸散物的重要组成部分［14］。焦炉逸散物（cokeovenemissions，COE）是生产焦炭时，烟煤等在高温缺氧的焦炉碳化室内产生的烟类、气体和蒸汽。它是工业焦化生产过程形成的主要环境污染物，由于含有大量的致癌性多环芳烃，长期暴露其中容易引发机体产生细胞恶变和肿瘤。所以说它是“明确的人类致癌物”，即国际癌症研究署（IARC）定义的“Ⅰ类致癌物”［15］。化学致癌物大多与环境污染和职业因素有关，近年来国内外许多研究表明，大气的污染程度与肺癌的发生和死亡存在正相关关系。城市人群肺癌死亡率与农村人群相比较高，提示肺癌发生的危险因素之一就是大气污染。我国研究发现，天津、上海、沈阳等大城市居民肺癌死亡率与大气中苯并A芘浓度存在显著地正相关关系。而对职业因素的研究与认识可追溯到1775年，当时有英国医师发现易患阴囊癌的工人多数曾做过烟囱清扫工作，而现在焦化厂焦炉作业工人人群的肺癌发病率和死亡率明显高于正常人群。核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）是以核糖核苷酸为基本组成单位，具有复杂的结构和重要的生物学功能。RNA是脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）的转录产物，参与遗传信息的复制和表达。RNA包括核糖体RNA(rRNA),信使RNA(mRNA),转运RNA（tRNA),微RNA（microRNA),不均一核RNA（hnRNA),核小RNA（snRNA),核仁小RNA（snoRNA)等，RNA在生命活动中发挥着重要作用，担负着基因的表达和表达调控功能［16］。除了上面的三种RNA，还存在着其他非编码RNA（non-codingRNA,ncRNA)。这是一类不编码蛋白质但具有重要生物学功能的RNA分子，分为长链非编码RNA（longnon-codingRNA)和短链非编码RNA(smallnon-codingRNA)［17］。通常将长度大于200nt的非编码RNA称为lncRNA,短链非编码RNA的长度一般小于200nt。它们参与转录调控、RNA的修饰和剪切、mRNA的稳定调控、蛋白质的稳定和转运、染色体的形成和结构稳定等重要细胞功能，进而调控组织分化、器官形成等基本生命活动过程以及某些如肿瘤、神经系统疾病等的发生和发展过程［18］。短链非编码RNA也称非编码小RNA，主要包括snRNA、snoRNA、scRNA、ribozyme、miRNA和piRNA。长链非编码RNA（lncRNA）与mRNA结构相似，但在序列中无开放读框，具有复杂的生物学功能，并与一些疾病的发病机制密切相关，一些lncRNA能使基因沉默，另一些lncRNA却可以激活基因的表达［19］。现在的研究大部分只针对于短链RNA如miRNA、piRNA等的生成和调控机制，对lncRNA的认识则相对较少。现在已经有研究表明，lncRNA参与调控了基因组印记、转录激活、转录干扰、体内运输、X染色体沉默以及染色体修饰等重要生命活动过程［20］。lncRNA将不再是基因组转录的噪音，它的大量的未知的功能吸引了越来越多科研工作人员的广泛关注，也因此使越来越多的lncRNA被相继发现［21］。肿瘤危害严重，其病因与发病机制尚不十分明确，传统诊断方法主要以疾病的表型改变为依据，而表型改变往往在很多情况下不都是特异的，且通常会在疾病发生一段时间后才出现，因此不能及时作出明确的诊断，致使早期诊断不足而预后差［22］。常规治疗方法如手术治疗、化学治疗、放射治疗效果不十分理想。所以想要大幅度提高生存率，需要大力提倡早期诊断和创新治疗方法。近年来对lncRNA的研究表明其差异表达于恶性肿瘤细胞与正常细胞之间。lncRNA表达或功能异常与肿瘤及其他重大疾病密切相关［23］。因此，差异表达的特异性lncRNA可作为COE暴露致癌的早期生物标志物，进一步研究细胞恶性转化过程中的作用机制，有利于揭示环境化学物致细胞癌变的分子机制，也可将其作为环境化学物致癌的潜在分子标志。在临床应用方面，lncRNA可作为一项参考指标进行早期预警性风险预测诊断，对具有个体易感性的高危人群进行筛检，基因诊断作为病因诊断，既特异又灵敏，同时可作为药物靶向治疗的潜在靶点提供有效的临床个体化治疗，如基因治疗药物对肿瘤细胞的选择性强，且肿瘤细胞耐药性和患者全身反应较轻，从而显示出较好的临床疗效。材料与方法2.1材料（1）主要试剂： TRZOL试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇、Rnase-free水、电泳缓冲液、琼脂糖凝胶等。（2）主要仪器：基因芯片、反转录试剂盒、QRT-PCR试剂盒、PCR仪器、超净工作台、玻璃匀浆器、移液枪、离心机、离心管、电泳仪、紫外投射仪、凝胶电泳分析仪、分光光度计、制冰机、低温冰箱、倒置显微镜、高压蒸汽灭菌器等。（3）正常人支气管上皮细胞、经焦炉逸散物诱导的支气管上皮恶性转化细胞。2.2方法2.2.1芯片实验2.2.1.1细胞总RNA的提取（1）制作细胞匀浆：在分别盛有正常16HBE和恶变16HBE的培养皿中加入适量TRIZOL试剂，并用枪吹打几次然后转移到离心管中，于15℃～30℃静置5min。（2）RNA分离：向样品试管加入适量氯仿，用力振荡离心管体使其充分混匀，室温静置15min，于4℃，1200g条件下离心10min，使混合液体分层，RNA存在于水相中。（3）RNA沉淀：吸取含有RNA的上层水相置于新的试管中，加入异丙醇并混匀，室温静置10min，在4℃，1200g条件下离心10min。（4）RNA清洗：除去上清液，加入适量75%乙醇，充分洗涤沉淀，轻轻振荡试管，于4℃，7500g条件下离心5min。（5）RNA溶解：除去上清液，空气中干燥RNA沉淀10min，加入适量无RNA酶水，用枪反复吹打几次，然后于56℃温育10min。（6）保存与分类：将得到的RNA溶液分装，一份可以用于核算质量测定，一份可用于逆转录，剩余部分可以保存在-70℃超低温冰箱。2.2.1.2细胞总RNA的纯化应用纯化试剂盒对两种细胞总RNA进行过柱纯化2.2.1.3细胞总RNA的质量检测对纯化后细胞总RNA样品进行定量和质检。用紫外分析仪定量测定细胞总RNA纯度和浓度，用变性琼脂糖凝胶电泳检测细胞总RNA纯度。2.2.1.4对细胞总RNA进行荧光标记反应应用荧光标记反应试剂盒，将纯化后的细胞总RNA样品反转录为cDNA，再体外转录为cRNA，最后反转录为cRNA，并用酶进行荧光标记。具体步骤如下：（1）将纯化后的总RNA加入离心管。（2）加入启动子引物。（3）加入无酶水调节总体积。（4）65℃离心管温育10min。（5）置于冰上5min降温。（6）在冰上将试剂顺序加入另一个洁净的离心管。（7）冰上低温瞬时离心。（8）将已备好的试剂加入各样品中，并吹打至均匀。（9）在40℃下样品水浴2小时。（10）在65℃水浴15min。（11）移回冰上瞬时离心5min。（12）将试剂顺序加入另一个洁净的离心管。（13）在样品中加入预先混合的以上溶剂，上下吹打混匀。（14）40℃样品水浴2小时。2.2.1.5芯片杂交和洗涤应用芯片杂交试剂盒进行标记DNA杂交实验，并用相应冲洗液清洗芯片等待芯片干燥。2.2.1.6芯片扫描扫描芯片，采集图像和数据。2.2.1.7分析图像和数据，筛选特异性lncRNA经过折叠倍率（foldchange）分析获得的RNA数据，挑选在两组细胞中差异倍数大于2或者小于0.5，p值小于0.05（经FDR校正）的lncRNA作为表达差异的lncRNA。2.2.2qRT-PCR技术对差异lncRNA的验证2.2.2.1细胞总RNA的提取（1）制作细胞匀浆：在分别盛有正常16HBE和恶变16HBE的培养皿中加入适量TRIZOL试剂，并用枪吹打几次然后转移到离心管中，于15℃～30℃静置5min。（2）RNA分离：向样品试管加入适量氯仿，用力振荡离心管体使其充分混匀，室温静置15min，于4℃，1200g条件下离心10min，使混合液体分层，RNA存在于水相中。（3）RNA沉淀：吸取含有RNA的上层水相置于新的试管中，加入异丙醇并混匀，室温静置10min，在4℃，1200g条件下离心10min。（4）RNA清洗：除去上清液，加入适量75%乙醇，充分洗涤沉淀，轻轻振荡试管，于4℃，7500g条件下离心5min。（5）RNA溶解：除去上清液，空气中干燥RNA沉淀10min，加入适量无RNA酶水，用枪反复吹打几次，然后于56℃温育10min。（6）保存与分类：将得到的RNA溶液分装，一份可以用于核算质量测定，一份可用于逆转录，剩余部分可以保存在-70℃超低温冰箱。2.2.2.2细胞总RNA的质量检测对纯化后细胞总RNA样品进行定量和质检。用紫外分析仪定量测定细胞总RNA纯度和浓度，用变性琼脂糖凝胶电泳检测细胞总RNA纯度。2.2.2.3QRT-PCR对lncRNA进行实时定量的表达测定按反转录试剂盒说明将lncRNA逆转录为cDNA，具体步骤如下：（1）引物设计：利用软件，根据引物设计原则，设计引物。（2）制备逆转录反应体系：在37℃进行15min反转录实验并在85℃，5s使反转录酶失活，最终4℃保存在冰箱中。（3）实时PCR仪上qPCR反应：先在95℃条件下进行30s预变性反应，再在95℃条件下进行5s、60℃条件下进行6sPCR反应总共35个循环，最后熔解。2.2.2.4统计学处理将qRT-PCR实验得到的图像和数据整理并用统计学方法进行分析与描述。2.2.3调控性lncRNA的确定采用Spearman等级相关系数对lncRNA与基因表达量进行相关性分析，相关系数r>0.4（r<–0.4），则认为两者存在正（负）相关。我们认为与lncRNA表达相关的基因数越多，则这个lncRNA为调控性lncRNA。3结果3.1转录组测序出来的差异lncRNA(899个)注：筛选标准FDR<0.05，foldchange>2倍，p<0.05正常人支气管上皮细胞与恶性转化的人支气管上皮细胞的总RNA分别经转录组测序，以FDR<0.05，foldchange>2倍，P<0.05为筛选标准，发现表达差异的lncRNA共有899个，由火山图（图A）发现，红色部分具有统计学意义，左边红色部分表示特异性lncRNA在恶变细胞相对低表达，右边红色部分表示特异性lncRNA在恶变细胞相对高表达。由聚类图（图B）发现，两种细胞从蓝色到红色，越接近红色，lncRNA特异性表达越高，越接近蓝色，lncRNA特异性表达越低。而且同一分组细胞内lncRNA表达差异相对较小，不同的两组细胞间lncRNA表达差异相对较大。两组细胞间出现差异表达的部分lncRNA见图C。ABCRef_SymbolPValueFDRRP5-973M2.200RPE6500AC012513.61.67E-2114.20E-209CTD-2636A23.21.43E-1872.62E-185SCEL-AS13.58E-1665.42E-164CTD-3060P21.11.59E-1652.37E-163AC007750.58.26E-1631.18E-160UCA11.32E-1551.68E-153AC004510.33.60E-1494.29E-147RP11-244F12.32.59E-1442.87E-142TM4SF1-AS11.30E-1401.39E-138AP001623.18.17E-1408.66E-138RP11-22N19.26.47E-1366.49E-134CTD-2024P10.14.64E-1264.09E-124RP11-666A8.97.55E-1246.21E-122AC096574.41.40E-1181.05E-116RP11-69I8.33.17E-1122.24E-110NMNAT22.01E-1071.35E-105CTD-2033D15.12.87E-1031.83E-101PSIP14.96E-862.58E-84XIST1.90E-859.78E-84SFTA1P6.63E-803.14E-78IDI2-AS11.46E-796.91E-783.2lncRNA的验证注：进一步挑选标准FPKM>20分别对正常人支气管上皮细胞和恶性转化的人支气管上皮细胞提取提取总RNA，逆转录为Crna,利用qRT-PCR技术对差异表达的lncRNA进行验证，以FPKM>20，P<0.0001为筛选标准，进一步挑选出在两组不同细胞间特异性表达最为明显的三种lncRNA：SFTA1P在恶变细胞相对低表达，AL031600.1在恶变细胞相对高表达，AC124312.2在恶变细胞相对高表达，而且特异性lncRNA表达结果芯片实验结果一致。ABC3.3调控性lncRNA的确定采用Spearman等级相关系数对lncRNA与基因表达量进行相关性分析，相关系数r>0.4（r<–0.4），则认为两者存在正（负）相关。我们认为与lncRNA表达相关的基因数越多，则这个lncRNA为调控性lncRNA。由表得知SFTA1P、AL031600.1、AC124312.2调控的基因数分别为82、4、16。则SFTA1P为最主要的调控基因。基因名调控的基因数SFTA1P82AL031600.14AC124312.2164讨论焦炉逸散物（cokeovenemissions，COE）是生产焦炭时，烟煤等在高温缺氧的焦炉碳化室内产生的烟类、气体和蒸汽。它是工业焦化生产过程形成的主要环境污染物，由于含有大量的致癌性多环芳烃，长期暴露其中容易引发机体产生细胞恶变和肿瘤。所以说它是“明确的人类致癌物”，即国际癌症研究署（IARC）定义的“Ⅰ类致癌物”。长链非编码RNA（longnon-codingRNA，lncRNA)，是一类不编码蛋白质但具有重要生物学功能的RNA分子，长度通常大于200nt，而且与一些疾病尤其是肿瘤等的发病机制密切相关，一些lncRNA能使基因沉默，另一些lncRNA则可以激活基因的表达。现在的研究大部分只针对于短链RNA如miRNA、piRNA等的生成和调控机制，对lncRNA的认识相对较少。现在已经有研究表明，lncRNA参与调控了基因组印记、转录激活、转录干扰、体内运输、X染色体沉默以及染色体修饰等重要生命活动过程。lncRNA将不再是基因组转录的噪音，它的大量的未知的功能吸引了越来越多科研工作人员的广泛关注，也因此使越来越多的lncRNA被相继发现。恶性肿瘤已经成为人类死亡构成的重要病因，是目前危害人类健康和生命安全的最严重的重大疾病之一，全世界各个国家和地区恶性肿瘤的疾病负担均呈不断上升趋势，而当代面临的最重要的公共卫生问题之一就是肿瘤的预防和控制。而在我国，发病率和死亡率均处于持续不断升高趋势的肺癌发病率为肿瘤的首位，也是所有癌症死亡的首要原因。肺癌危害尤其严重，它已成为影响我国人民群众公共健康的重大问题，但其病因与发病机制尚不十分明确。肺癌传统诊断方法主要以疾病的表型改变为依据，而表型改变往往在很多情况下不都是特异的，而且通常会在疾病发生一段时间后才出现，因此不能及时作出明确的诊断，致使早期诊断不足而预后差。常规治疗方法如手术治疗、化学治疗、放射治疗效果不十分理想。所以想要大幅度提高生存率，需要大力提倡早期诊断和创新治疗方法。近年来对lncRNA的研究表明其差异表达于恶性肿瘤细胞与正常细胞之间。lncRNA表达或功能异常与肿瘤及其他重大疾病密切相关。因此，差异表达的特异性lncRNA可作为COE暴露致癌的早期生物标志物，进一步研究细胞恶性转化过程中的作用机制，有利于揭示环境化学物致细胞癌变的分子机制，也可将其作为环境化学物致癌的潜在分子标志。在临床应用方面，lncRNA可作为一项参考指标进行早期预警性风险预测诊断，对具有个体易感性的高危人群进行筛检，基因诊断作为病因诊断，既特异又灵敏，同时可作为药物靶向治疗的潜在靶点提供有效的临床个体化治疗。5结论1、部分lncRNA在人支气管上皮恶变细胞中出现表达差异。2、推测lncRNA可能与人支气管上皮细胞恶性转化的分子机制密切相关，AL031600.1、AC124312.2尤其是SFTA1P可以作为分子性生物标记物用于易感人群的筛检和肺癌的早期诊断。6谢辞通过这一阶段的努力，我的毕业论文《COE诱导16HBE细胞恶变过程中lncRNA的检测》最后完成了，光阴似箭，岁月如梭，一眨眼大学生活即将结束，而这份论文就是最后一份答卷。这篇论文的顺利完成离不开老师和同学对我的帮助和指导。首先要感谢我的导师赵艳洁老师，从写作提纲，到一遍又一遍地指出每稿中的具体问题，严格把关，循循善诱，给了我很多专业知识的指导和建设性的意见，赵老师严谨的治学态度，丰富的专业知识和尽职尽责的工作精神给了我很大的鼓舞和动力。在临近毕业之际，我还要借此机会向给予我诸多教诲和帮忙的各位老师表示由衷的谢意，感谢他们的辛勤栽培。不积跬步何以至千里，各位任课老师认真负责，在他们的悉心教导下，我才能够熟练的掌握和运用专业知识，并在设计中得以体现，顺利完成毕业论文。同时，在论文写作过程中，我还参考了有关的书籍和论文，在这里一并向有关的作者表示谢意。我还要感谢我的同学们以及我的各位室友，在毕业设计的这段时间里，你们给了我很多的启发，提出了很多宝贵的意见，对于你们帮忙和支持，在此我表示深深地感谢!7参考文献[1]刘红梅.GMA诱导的16HBE恶性转化细胞相关差异LncRNA筛选及其研究[D].中国疾病预防控制中心,2016.[2]毒理学研究中的体外细胞毒性评价[J].刘涛,郭辰,赵晓红.

生命科学.2014(03)[3]TheprognosticroleofPRUNE2inleiomyosarcoma[J].Lin-RuZhao,WeiTian,Guo-WenWang,Ke-XinChen,Ji