Box–Behnken响应面法甜荞多糖颗粒剂的制备工艺及质量检查研究

Box–Behnken响应面法优选甜荞多糖颗粒剂的制备工艺及质量检查摘要：目的运用Box–Behnken响应面法优选出甜荞多糖颗粒的最佳制备工艺。方法提取甜荞多糖，采用单因素试验考察乙醇浓度、多糖与乳糖的比例、多糖与可溶性淀粉的比例对多糖颗粒品质的影响，以成型率（25%）、堆密度（25%）、休止角（25%）、吸湿性（25%）作为评价颗粒剂综合质量的标准，Box–Behnken响应面试验设计优化出甜荞多糖颗粒的最佳制备工艺；用紫外分光光度法测定多糖。结果优化甜荞颗粒剂最佳制备工艺条件：乙醇浓度为55%、多糖:乳糖:可溶性淀粉=1:2.5:0.25。结论本实验确立的甜荞多糖颗粒制备工艺稳定可行，所制颗粒符合《中国药典》相关检测标准。关键词：甜荞多糖；颗粒剂；Box–Behnken响应面法；制备工艺；质量检查甜荞属于蓼科（Polygonaceae)荞麦属（Fagopyrum）。主要分布在我国西北、华北和西南地区[1]。可清理肠道废物、杀菌消炎，故又称净肠草、消炎粮食[2]。荞麦富含蛋白质、维生素、芦丁、多糖和微量元素，有研究显示，荞麦多糖具有改善铅中毒造成的损伤[3]、抗氧化[4]、清除自由基[5]、增强免疫力[6]、发挥减肥因子的作用[7]。多糖在保健和药用发展中发挥重要作用，但多糖多具有吸湿性，需要制成一定的剂型来克服此缺点，其中颗粒剂型使用方便、药效迅速，质量稳定。本实验旨在于优化多糖颗粒制剂的最佳制粒工艺，选择最佳的辅料比，并对颗粒进行多糖成分质量分析及检查。1.实验仪器、材料与试剂1.1实验仪器表1仪器及型号序号名称生产厂家型号1粉碎机上海菲力博实业公司LFP-500A2电子天平慈溪市天东衡器厂HX502T3循环水多用真空泵郑州杜甫仪器厂3SHB-34离心机湖南可成仪器设备有限公司L2-5K5鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司DHG-9123A6电热恒温水浴锅北京科伟永兴仪器有限公司HH-S47紫外分光光度计日本岛津公司UC-2401PC1.2实验试剂表2主要试剂序号名称生产厂家产地级别1葡萄糖对照品成都普思生物科技有限公司成都HPLC≥98%2无水乙醇天津市大茂化学试剂厂天津分析纯3苯酚天津市光复精细化工研究所天津分析纯4可溶性淀粉天津市大茂化学试剂厂天津分析纯5乳糖天津市大茂化学试剂厂天津分析纯6氯化钠天津市大茂化学试剂厂天津分析纯1.3实验材料荞麦（FagopyrumesculentumMoench.），来源于蓼科植物荞麦的干燥成熟种子。本研究所用荞麦采自陕西定边，经甘肃中医药大学药学院中药鉴定教研室王明伟副教授鉴定为正品。2实验方法2.1甜荞多糖的提取2.2甜荞多糖颗粒的制备2.2.1辅料选择多糖粉具有吸湿性，可使颗粒结块，在制粒过程中应选择合适的辅料，本实验通过考虑成本、抗吸湿性和成型性因素后，选用乳糖和可溶性淀粉为辅料进行制粒，选用乙醇作润湿剂。2.2.2颗粒制备工艺2.3颗粒制备工艺优化2.3.1单因素实验设计影响多糖制粒工艺的主要因素：乙醇浓度、多糖与乳糖的比例、多糖与可溶性淀粉的比例，本实验对以上三个因素进行考察，测定不同辅料制成的荞麦多糖颗粒剂的成型率、堆密度、休止角、吸湿性的数值，按照以下公式计算不同样品的分值：分值=（25/最大成型率）×成型率+（25/最大堆密度）×堆密度+（最小休止角×25）/休止角+（最小吸湿率×25）/吸湿率。表3单因素试验设计表多糖质量/g乙醇浓度（A）多糖:乳糖（B）多糖:可溶性淀粉（C）460%1:11:0.5470%1:21:1480%1:31:1.5方法取多糖：乳糖：可溶性淀粉为1：1：1与乙醇制备软材，用14目网筛制粒，60℃烘干,整粒。确定乙醇的最佳浓度取A中最佳乙醇浓度，同法操作，得多糖与乳糖的最佳比例。取A、B中最佳乙醇浓度、乳糖比重，同法操作得多糖与可溶性淀粉的最佳比例。2.3.1.1成型率的测定将颗粒用双筛分法过筛取得合格颗粒（能过1号筛但不能过5号筛），将合格颗粒称重，计算成型率（计算公式：成型率（%）=实际成型/颗粒剂重量×100%）。2.3.1.2吸湿率的测定[8]称取3g颗粒置于称量瓶中干燥至恒重后精密称取质量，打开瓶盖，将称量瓶放置于玻璃干燥器中（盛有相对湿度75%的过饱和氯化钠溶液）在室温下放置24h，称量并计算吸湿率（根据公式计算：吸湿率（%）=(吸湿后颗粒重量—吸湿前颗粒重量)/吸湿前颗粒剂重量×100%）。2.3.1.3休止角的测定[9]将漏斗固定水平置于坐标纸上方适宜高度，漏斗下端离绘图纸的高度为H，将颗粒剂缓缓从顶端漏斗倒入底部颗粒剂形成圆锥体，测得圆锥体的直径为2R计算休止角（根据公式计算，tanα=H/R,求出休止角α）。2.3.1.4堆密度的测定取3g颗粒置于量筒中，待量筒中颗粒上平面水平后读取体积，计算堆密度（计算公式：堆密度=M/V）。2.3.2响应面实验设计依据单因素试验的结果及优选出的相应条件，将对颗粒制剂影响的3个因素：乙醇浓度、多糖与乳糖的比例、多糖与可溶性淀粉的比例进行质量评价，选用Box–Behnken响应面法进行优化试验。表4响应面试验因素水平表水平因素乙醇浓度多糖:乳糖多糖:可溶性淀粉-155%1:1.51:0.25060%1:21:0.5+165%1:2.51:0.752.4颗粒剂中多糖含量的测定[10]2.4.1标准溶液的制备与最大波长的确定精确称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖0.010g,置50mL容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀备用。精确吸取上述溶液0.2mL,置于10mL的容量瓶中,加入5%苯酚1.5mL,混匀,再加入浓硫酸7.5mL,加水至刻度,混合均匀,水浴60℃加热20min,取出流水冷却,在紫外分光光度计中400nm-600nm的范围内扫描，得到最大吸收波长为490nm。2.4.2标准曲线的绘制准确吸取葡萄糖标准溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL置于10mL的容量瓶中,加入5%苯酚1.5mL,混匀,再加入浓硫酸7.5mL,混合均匀,水浴60℃加热20min,取出流水冷却,加水至刻度,以取0mL标准溶液管为空白对照组，用1cm的比色皿，在490nm处测定吸光度，以吸取葡萄糖标准溶液体积为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线（如图1所示）得回归方程y=66.601x-0.0536，R²=0.998,线性关系良好，可用于多糖含量测定。图1葡萄糖标准曲线2.4.3颗粒剂中多糖的测定多糖颗粒由甜荞多糖与辅料混合制粒而得，辅料乳糖为单糖，可利用多糖与单糖在水与乙醇中溶解度的不同除去乳糖，辅料可溶性淀粉不溶于冷水的特征，从颗粒中取得多糖。取多糖颗粒3g，加入适量蒸馏水至完全溶解，加入适量无水乙醇（少量多次，慢加快搅），至冰箱冷却24小时，抽滤后取沉淀，然后用乙醇洗涤，干燥，得多糖。取多糖粉末用无水乙醇洗涤后干燥，取粉末用适量蒸馏水溶解后移至250ml容量瓶稀释至刻度，摇匀后精密量取0.1ml溶液于试管中，加水至2ml，精密加入5%苯酚溶液1ml，摇匀后迅速精密加入硫酸5ml，摇匀放置10min后置40℃水浴锅中保温15min，取出冷却至室温，将所配溶液加入比色皿中，在490nm处测定吸光度，计算多糖。2.5颗粒质量评价[11]2.5.1外观性状颗粒剂应干燥，颗粒均匀，色泽一致，无吸潮、软化结块、潮解等现象。2.5.2粒度《中国药典》中，照粒度和粒度分布测定法，不能通过一号筛与能通过五号筛的总和不超过15%。2.5.3水分《中国药典》中，中药颗粒剂照水分测定法（通则0832）测定，除另有规定外，水分不得超过8.0%。干燥并恒重扁形称量瓶,取供试品2g置称量瓶中,精密称定后置于105℃烘箱内干燥5小时，将瓶盖盖好移置干燥器中放冷30分钟，精密称定后再在105℃烘箱干燥1小时，放冷称重（直至连续两次称重的差异不超过5mg为止），计算含水量。2.5.4溶化性《中国药典》中，可溶颗粒检查法，颗粒溶于水后应全部溶化或轻微浑浊。取颗粒10g加热水200ml搅拌5min观察溶液。3结果3.1单因素试验结果3.1.1不同乙醇浓度、多糖与乳糖的不同比例、多糖与可溶性淀粉的不同比例对多糖制粒工艺的影响如图2、图3、图4所示图2不同乙醇浓度对多糖颗粒成型率、堆密度、休止角、吸湿性的影响图2不同乙醇浓度对多糖颗粒成型率、堆密度、休止角、吸湿性的影响图3乳糖与多糖的不同比例图3乳糖与多糖的不同比例对多糖颗粒成型率、堆密度、休止角、吸湿性的影响图4可溶性淀粉与多糖的不同比例图4可溶性淀粉与多糖的不同比例对多糖颗粒成型率、堆密度、休止角、吸湿性的影响3.1.2单因素试验结果分析通过方法2.3.1所设计的单因素实验中，对所制颗粒的成型率、休止角、堆密度、吸湿性等评价指标进行综合性评分后，通过图1可以得出制粒的最佳浓度的60%乙醇，通过图2可以得出制粒中多糖:乳糖的最佳比例为1:2，通过图3可以得出制粒中多糖:可溶性淀粉的最佳比例为1:0.5。3.2响应面法优化甜荞多糖颗粒最佳制备工艺在预试验2.3.1的基础上，选定乙醇浓度、多糖与乳糖的比例、多糖与可溶性淀粉的比例三个因素，经Designexpert软件分析，依据Box–Behnken响应面组合设计原理，设计3因素3水平以成型率和溶化率作为响应值的响应面优化试验，通过实验方法2.3.2所得结果如表5和图5-9所示。表5响应面数据评价表Response1率颗粒成品ANOVAforResponseSurfaceLinearModelAnalysisofvariancetable[Partialsumofsquares-TypeIII]SumofMeanFp-valueSourceSquaresdfSquareValueProb>FModel 49.26316.423.650.0417significantA-A乙醇浓度7.0317.031.560.2335B-B多糖:乳糖1.2811.280.280.6030C-C多糖:可溶性淀粉40.95140.959.090.0099Residual58.56134.50LackofFit25.7892.860.350.9123notsignificantPureError32.7848.20CorTotal107.8216注：P值＜0.01，有显著意义；P值＞0.05无显著意义图5乙醇浓度和乳糖比重对颗粒成品率影响的等高线图图5乙醇浓度和乳糖比重对颗粒成品率影响的等高线图图6乙醇浓度和乳糖比重对颗粒成品率影响的响应面3D图图6乙醇浓度和乳糖比重对颗粒成品率影响的响应面3D图图8乙醇浓度和乳糖比重对颗粒溶化率影响的响应面3D图图7乙醇浓度和乳糖比重对颗粒溶化率影响的等高线图图8乙醇浓度和乳糖比重对颗粒溶化率影响的响应面3D图图7乙醇浓度和乳糖比重对颗粒溶化率影响的等高线图图9乙醇浓度和可溶性淀粉比重对颗粒溶化率影响的响应面3D图图9乙醇浓度和可溶性淀粉比重对颗粒溶化率影响的响应面3D图由表5可知，模型P值＜0.01，表明该模型具有显著意义；失拟项P值＞0.05不显著，表明该模型拟合度和可信度有效，误差较小，可用该模型优化制备工艺。使用Designexpert软件，利用其中的Box–Behnken响应面组合设计方法得出优化甜荞多糖颗粒的制备工艺，根据响应面实验结果，分析得出以下结论：荞麦多糖颗粒制备最佳工艺条件为60%乙醇，多糖：乳糖：可溶性淀粉=1:2.5:0.25。3.3甜荞颗粒剂中多糖含量的测定结果通过实验方法2.4可得，紫外分光光度计测得最大吸收波长为490nm,得到多糖的标准曲线回归方程为y=66.601x-0.0536，通过苯酚-硫酸法测定得到稀释后多糖溶液的平均吸光度为0.3339，带入标准曲线计算得x=0.0058mg/ml,甜荞多糖颗粒中多糖的含量为38.7mg/g.3.4颗粒质量评价结果3.4.1外观性状通过观察颗粒的外观性状，颗粒干燥均匀，色泽一致，无吸潮、软化结块、潮解等现象，符合药典标准。3.4.2粒度通过方法2.5.2对所制颗粒进行处理，计算所得成型率为96.1%，依据不能通过一号筛与能通过五号筛的总和不超过15%的规定，所制颗粒符合药典标准。3.4.3水分通过方法2.5.3对制得的颗粒进行水分检查，计算所得颗粒含水量为3.20%，其水分不得超过8.0%，制得的颗粒符合药典颗粒剂的标准。3.4.4溶化性通过方法2.5.4，将颗粒溶于水后有轻微浑浊现象，所制颗粒符合药典标准。4结论与讨论通过实验研究，荞麦多糖颗粒最佳制备工艺条件55%乙醇，多糖：乳糖：可溶性淀粉=1:2.5:0.25。将多糖颗粒通过苯酚-硫酸法测得多糖含量为38.7mg/g。所制得的颗粒表面干燥，颗粒均匀，色泽一致，无吸潮、软化结块、潮解等现象，水分、粒度、溶化性均符合《中国药典》相关检测标准。甜荞多糖具有丰富的营养，在保健品和药品发展方向具有较好的前景，但甜荞多糖还未能较好地开发，与之相关的产品甚少。因此，将甜荞多糖制成颗粒能更好地对多糖进行利用且为开发其他剂型奠定基础。甜荞多糖具有粘性大、吸湿性强的特性，因此不易直接制备成颗粒，通过文献查询，在考虑成本、成型率和抗吸湿性等因素的条件下，选取乳糖和可溶性淀粉为辅料来制备颗粒。甜荞多糖粉在制粒中有结块现象，加入可溶性淀粉后该现象有所改善，可使得所制颗粒大小均一；乳糖粉自身口感细腻，加入后可改善颗粒剂粒度，使其更加均匀。制粒工艺中对制粒产生影响的因素分别为乙醇浓度、多糖粉与乳糖、可溶性淀粉的比例，通过Box–Behnken响应面组合设计方法制粒，对颗粒的成型率和溶化率进行考察，经Design

expert软件数据分析后有较好的可信度和拟合度，可