微生物的选择培养和计数高二下学期生物人教版选择性必修3

1.2.2微生物的选择培养和计数高压蒸汽灭菌液体培养基微生物的基本培养技术1、实验室培养微生物条件1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件—培养基2）确保其它微生物无法混入—无菌技术高压蒸汽灭菌温故知新：2、培养基的营养构成:碳源、氮源、水、无机盐等1）碳源：无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-有机碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等自养微生物异养微生物2）氮源：无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3等有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源3）无机盐：Ca、K、Mg为大量元素Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高温的液体62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化学药剂生物活体、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线紫外线照射30min灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热2～3h湿热灭菌培养基、培养皿等,生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,温度121℃,15～30min无菌的方法：接种室、接种箱，超净工作台课题背景自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。稀释涂布平板法呈现的杂菌群那么我们又如何达成这一目标呢？科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。1、科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。耐高温的酶耐高温生物体高温环境（热泉、火山口）寻找寻找（一）选择培养基根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。2.筛选原则耐寒微生物耐热微生物石油分解菌结果：培养一定时间后，目的菌数量上升，再通过稀释涂布平板等方法对它进行纯化培养。2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基。（一）选择培养基培养基中加氨苄青霉素没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌?举例1培养基+氨苄青霉素培养基加入青霉素：不加氮源：不加含碳有机物：——分离出酵母菌、霉菌等真菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)——分离出固氮菌

——分离出自养型微生物补充资料1-几种选择培养基举例那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？加高浓度食盐

——金黄色葡萄球菌选择培养基特殊成分加入某种化学物质目的抑制其他微生物生长，促进目的微生物的生长用途举例鉴别培养基加入某种指示剂发生特定颜色反应分离出特定微生物鉴别不同的微生物用尿素作唯一氮源的培养基来筛选尿素分解菌伊红—美蓝培养基鉴定大肠杆菌选择培养基和鉴别培养基总结思考-讨论选择培养基配方的设计尿素的立体结构

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。讨论：1、你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml配方一：培养细菌配方二：培养可以分解尿素的细菌

补充资料2-普通培养基与选择培养基的比较1、从物理性质看此培养基属于哪类？从用途上属于哪类培养基？固体培养基配方二是以尿素作唯一氮源的选择培养基2、KH2PO4和Na2HPO4的作用是：①提供无机盐；②调节pH。（二）微生物的选择培养如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。2、实验的具体操作：

2）土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌1）制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基1、稀释涂布平板法是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。①铲取土样，将样品装入纸袋中②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。1mL1ⅹ1090mL无菌水1ⅹ1071ⅹ1051ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1041mL1mL1mL1mL6支试管，分别加入9ml无菌水1mL③取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。3.稀释涂布平板法的操作过程菌液配置⑥取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。⑦用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养菌液涂布培养基浸灼滴涂各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照放入37℃恒温箱中培养1～2d4培养与观察稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照恒温培养箱3.平板划线法和稀释涂布平板法的比较(1)单菌落的获得①利用平板划线法接种时,单菌落从后划线的区域挑取;②利用稀释涂布平板法接种时,只有合适的稀释度才能得到单菌落。(2)两种接种方法的应用两种方法都能将微生物分散到固体培养基表面,以获得单菌落,达到分离纯化微生物的目的;稀释涂布平板法还能对微生物进行计数,而平板划线法不能用于微生物的计数。（三）微生物的数量测定稀释涂布平板法除用于分离微生物外，也常用于统计样品中活菌数。在稀释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约有多少活菌。1、原理：2、计数原则：一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。1.间接计数法（活菌计数法）

—稀释涂布平板法注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。②为增强实验说服力与准确性，以减少偶然因素对实验结果的影响。设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。④统计的结果一般用菌落数而不是活菌数；⑤恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。⑥分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落提示：若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌体的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌体形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。实例分析1：3、计算：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。某同学在稀释倍数为106

的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B

两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。

2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、

212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。

你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？

甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）

乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。实例分析2：这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数缺点：不能区分死菌与活菌（数值偏大）不适于对运动细菌的计数需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；2.显微镜直接计数—计数板计数法项目直接计数法间接计数法(稀释涂布平板法)原理利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下观察计数,计算一定体积的样品中微生物的数量当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌主要用具显微镜、细菌计数板或血细胞计数板培养基计数数据菌体本身培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌缺点死菌、活菌都计算在内操作较复杂,有一定误差计算公式每毫升原液含菌数＝每小格平均菌体数×400×10000×稀释倍数每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积归纳提升:统计菌落数目的方法微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法,但是一般使用计数法,计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如下表所示。思考-讨论土壤中分解尿素的细菌的分离和计数尿素的立体结构1)课题目的1、从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

2、统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌2)研究思路土壤取样制备培养基样品稀释与取样涂布微生物的培养与观察1、土壤取样1）取样的位置：

细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数的细菌分布距地表3∼8cm的土壤层。2）取样要求：先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。2、制备培养基准备选择培养基（以尿素为唯一氮源）和牛肉膏蛋白胨培养基。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基以及各一个空白对照。

在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目，应明显多于选择培养基。用以分离并计数能分解尿素的细菌用以判断选择培养基是否具有选择作用用以验证培养基中是否含有杂菌3、样品的稀释测土壤中细菌数量，一般选用1x104

、1x105

和1x106倍的稀释液进行平板培养。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数

不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。测细菌数：一般用104、105、106稀释液测放线菌：一般用103、104、105稀释液测真菌数：一般用102、103、104稀释液4、微生物的培养与观察②在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。①培养不同微生物往往需要不同培养温度。

细菌：30～37℃培养1～2d

放线菌：25～28℃培养5～7d

霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。

3)操作提示2）无菌操作3）做好标记

本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记4）制定计划对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊1）不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。a、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。b、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入

锥形瓶中，塞好棉塞。c、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。4)结果分析与评价（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落

空白对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。（三）在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？

（二）样品的稀释操作是否成功？如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。CO(NH2)2+H2O脲酶CO2+2NH3补充拓展：脲酶阴性脲酶阳性土壤中分解尿素的细菌的鉴定在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。（四）在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落，分析其原因。原因：（1）土样不同（2）培养基污染或操作失误小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。特别提醒

实验设计原则(1)设立重复组:统计某一稀释度下平板上的菌落数时,要至少涂布3个平板作重复组,以增强实验结果的说服力与准确性。(2)设立两种对照组:①判断选择培养基中是否有杂菌污染,需同时将未接种的选择培养基进行培养;②判断选择培养基是否具有筛选作用,需同时设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养,观察两种培养基上的菌落数目,进行对比得出结论。探究点一探究点二2.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数结果分析与评价

内

容现

象结

论有无污染的判断对照的培养基中无菌落生长未被杂菌污染培养物中菌落数偏高培养物中混入其他氮源菌落形态多样,菌落数偏高被杂菌污染选择培养基的筛选作用牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目选择培养基具筛选作用样品的稀释操作得到2个或2个以上菌落数目为30~300的平板操作成功重复组的结果若选取同一种土样,统计结果应接近课堂小结微生物的数量测定选择培养基的作用微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法微生物的选择培养和计数选择培养基微生物的选择培养科学实例筛选原则选择培养基的概念及举例稀释涂布平板法的操作过程间接计数法—稀释涂布平板法直接计数—计数板计数法土壤中分解尿素的细菌的分离与计数培养基的制备实验设计（1）土壤取样（2）样品的稀释（3）稀释涂布平板法接种（4）微生物的培养与观察实验设计不同菌落的颜色与形状3.用来判断选择培养基是否起到了选择作用,需要设置的对照是(

)A.未接种的选择培养基B.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C.相同条件下接种了的牛肉膏蛋白胨培养基D.相同条件下接种了的选择培养基答案C解析

将菌液稀释相同的倍数并接种,相同培养条件下牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目应明显多于选择培养基上的菌落数目,因此,应选择接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照实验遵循单一变量原则,所以牛肉膏蛋白胨培养基要与选择培养基在相同条件下接种、培养。2.分离土