基因工程的基本操作程序高二下学期生物人教版选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序01课堂导入转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左）与非转基因抗虫棉（右）

科学家将苏云金杆菌的“杀虫基因”——Bt抗虫蛋白基因转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白（苏云金杆菌伴胞晶体蛋白）——破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？

我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植的过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。大量施用农药杀虫，不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。课堂导入01苏云金杆菌与载体拼接普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞提取导入重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定(含抗虫基因）（含有并表达抗虫基因）目录/CONTENTS第一步：目的基因的筛选与获取01第二步：基因表达载体的构建02第三步：将目的基因导入受体细胞03第四步：目的基因的检测与鉴定04第一步：目的基因的筛选与获取Part01一、目的基因的筛选与获取（一）目的基因1.概念在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。2.类型根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。3.实例与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。培育转基因抗虫棉用到的目的基因Bt抗虫蛋白基因简称Bt基因（二）筛选目的基因的方法：①较为有效的方法：从相关的__________和____________的基因中进行筛选。②实例：已知结构功能清晰苏云金杆菌（Bt）制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解：在某类昆虫肠道的碱性环境中表现毒性，对人畜无影响苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。明确了目的基因后，该怎么获取它呢？（三）获取目的基因的方法1.人工合成目的基因。2.通过构建基因文库来获取目的基因。3.常用PCR特异性地快速扩增目的基因。重点了解什么是PCR？将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。（1）什么叫基因文库？DNA合成仪一、目的基因的筛选与获取（若基因较小、核苷酸序列已知，可通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。）阅读教材P77-79文字内容，回答以下问题：1.什么是PCR技术？其原理是？由谁发明的该技术？2.回顾体内DNA复制需要哪些条件？其大概过程是怎样进行的？3.结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？4.什么是引物？PCR扩增为什么需要引物？5.PCR扩增的大致过程可以分为哪三步？需什么设备来完成？【利用PCR获取和扩增目的基因】概念：PCR是__________________的缩写，它是一项根据___________________的原理，在体外提供________________的各种组分与反应条件，对_________________________进行大量复制的技术。聚合酶链式反应DNA半保留复制参与DNA复制目的基因①全称：②原理：③操作环境：④目的：聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的核苷酸序列PCR扩增仪3.利用PCR获取和扩增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。DNA的复制视频讲解比较PCR反应与体内DNA复制所需的基本条件在DNA复制中的作用体内DNA复制条件PCR反应条件DNA母链DNA母链解旋酶高温条件（90℃以上）4种脱氧核苷酸4种脱氧核苷酸DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶RNA聚合酶合成的一小段RNA（引物）一小段DNA或RNA（引物）提供DNA复制的模板断裂氢键，打开DNA双链合成子链DNA的原料催化形成磷酸二酯键，进而合成DNA子链使DNA聚合酶结合在引物的3’端，从而开始连接脱氧核苷酸（引物）通常是20~30个核苷酸引物1、概念：是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。2、结合部位：引物结合在模板链的_________。3’端拓展3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物23’5’DNA母链13’5’DNA母链2子链延伸方向5’3’5’--3’引物引物为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从3’端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)3、引物的作用5’--3’-5’3’-引物引物子链延伸子链延伸3’--5’比较PCR反应与体内DNA复制所需的基本条件在DNA复制中的作用体内DNA复制条件PCR反应条件DNA母链DNA母链解旋酶高温条件（90℃以上）4种脱氧核苷酸4种脱氧核苷酸DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶RNA聚合酶合成的一小段RNA（引物）一小段DNA或RNA（引物）提供DNA复制的模板断裂氢键，打开DNA双链合成子链DNA的原料催化形成磷酸二酯键，进而合成DNA子链使DNA聚合酶结合在引物的3’端，从而开始连接脱氧核苷酸（引物）通常是20~30个核苷酸耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）DNA模板引物（2种）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）四种脱氧核苷酸(dNTP)激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶①DNA模板（需含有目的基因）。②四种脱氧核苷酸（或四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。③分别与模板DNA相结合的2种引物。④耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）。⑤稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。⑥能严格控制温度的温控设备。dATPPCR反应体系需要的条件dNTP和ATP类似,不但可以提供原料还可以提供能量。一.目的基因的筛选与获取——脱氧核苷三磷酸dATP

腺嘌呤脱氧核苷酸dADP腺苷（A)

腺嘌呤脱氧核糖PPP~~OHH

在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。PCR过程905072℃延伸905072℃变性905072℃复性PCR过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成。①变性：当温度上升到_______以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。

氢键单链DNA待扩增的DNA片段第一步：变性3’3’5’5’3’5’3’5’变性90℃思考1：变性的温度为何是90℃以上的

一个温度范围？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；3）PCR反应的过程长度相同但C-G含量高的DNA需要设定的变性温度较

。高预变性90℃以上增加DNA彻底变性的概率②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过

与两条单链DNA结合。

第二步：复性引物1引物2DNA引物3’5’3’5’碱基互补配对5’5’3’3’3）PCR反应的过程思考2:PCR扩增时至少需要2种引物,原因是？DNA的两条链是反向平行的，用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增。引物能使耐高温的DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。设计引物的要求：①同种引物之间不能发生碱基互补配对，防止引物自身折叠；②两种引物之间不能发生碱基互补配对，防止引物之间配对，导致引物不能与模板链结合。③延伸：当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

第三步：延伸引物1引物2Taq酶Taq酶3’5’3’5’脱氧核苷酸5’5’DNA聚合酶72℃3’3’3’3’3）PCR反应的过程72℃是Taq酶的最适温度01耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’变性复性延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。3）PCR反应的过程第二轮循环的产物第三轮的产物3’5’3’5’3’5’3’5’第一轮循环的产物3’5’3’5’由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’思考：PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？1、用PCR扩增目的基因需要知道目的基因全部核苷酸序列吗？不需要，只需要知道目的基因两端部分核苷酸序列，以便根据这部分序列合成2种引物【问题探究】2.两种引物都结合在DNA模板链的

端；

脱氧核苷酸连接在引物的

端进行延伸。3’3’3.用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA【问题探究】含有引物A的DNA____个含有引物B的DNA____个11第一次扩增【问题探究】含有引物A的DNA____个含有引物B的DNA____个33第二次扩增【问题探究】第三次扩增含有引物A的DNA____个含有引物B的DNA____个77【问题探究】一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：①扩增产物中，含引物A（或B）的DNA分子数为：______个②复制过程中共需引物________个③第n次复制需要引物_________个2n-12n＋1-22nPCR扩增DNA规律【问题探究】利用PCR获取和扩增目的基因（常用）采用

来鉴定PCR的产物。琼脂糖凝胶电泳（1）DNA片段扩增原理①PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。②PCR仪能够自动调控温度，一次PCR一般要经历30次循环。探究

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实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验原理探究

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实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定（2）DNA片段电泳鉴定的原理①DNA分子具有____________，在一定的____下，这些基团可以带上________________。在_________的作用下，这些___________会向着__________________的电极移动，这个过程就是电泳。可解离的基团pH正电荷或负电荷带电分子与它所带电荷相反电场一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA便由负极向正极移动。②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。①凝胶浓度越低，相同核酸分子迁移越快；②在同一浓度的凝胶中，较小的DNA片段迁移速度比大片段快；③超螺旋环状DNA分子的迁移速率快于线状DNA分子。③凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。PCR仪探究

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实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定2.材料用具①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）②微量离心管（进行PCR反应的场所）③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）④一次性吸液枪头（微量移液器吸完一种试剂更换一次枪头）⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）(1)用具微量离心管用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使

。参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性940C，5min30次940C,30s550C,30s720C，1min最后一次940C，1min550C,30s720C，1min移液离心扩增反应液集中在离心管的底部使DNA充分变性，以利于引物更好地与模板结合探究

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实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定3.方法步骤制备凝胶①融化②倒模③凝固用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。进行电泳①加液②加样③电泳将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳观察鉴定取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。3.方法步骤电泳注意1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20°C储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。PCR电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。探究

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实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定5.结果分析与评价(2)如果扩增不成功，可能的原因有？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化边解旋边复制DNA在高温下变性解旋全部解旋后在复制场所主要在细胞核内细胞外(主要在PCR扩增仪内)酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的DNA聚合酶温度细胞内温和条件控制温度，需在不同温度下进行结果合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因联系①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料:均为四种脱氧核苷酸③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3’端合成子链⑧对比第二步：基因表达载体的构建Part02二、基因表达载体的构建（核心）质粒标记基因复制原点启动子终止子限制酶切位点1.构建基因表达载体的目的：（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成各个元件有什么作用？思考：为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，也无法随细胞分裂而复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。质粒标记基因复制原点启动子终止子限制酶切位点供目的基因插入载体中，必须插到

和

之间2.基因表达载体的组成便于重组DNA的筛选DNA复制开始的地方，使能完成自主复制启动子：本质：有特殊序列结构的

片段位置：基因的

。功能：

识别和结合的部位，驱动基因转录出

。DNA上游RNA聚合酶mRNA有时为了满足需要，在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。终止子：本质：有特殊序列结构的

片段位置：基因的

。功能：终止

。DNA下游转录启动子终止子抗生素抗性基因，荧光蛋白基因等。启动子终止子起始密码子终止密码子本质位置功能总结：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻的碱基mRNA上三个相邻的碱基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号（编码氨基酸）翻译的结束信号（不编码氨基酸）限制酶限制酶同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割DNA连接酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因限制酶切割位点质粒重组DNA分子3.基因表达载体构建过程：拓展：“单酶切”与“双酶切”构建基因表达载体用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段构建基因表达载体1.单酶切abcda、b、c、d四个黏性末端相同。限制酶切割DNA连接酶连接启动子方向目的基因转录方向思考：单酶切有什么缺点？abcd限制酶切割DNA连接酶连接缺点1缺点2缺点3单酶切的缺点目的基因反向连接质粒重新环化目的基因被环化2.双酶切用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段构建基因表达载体限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA连接酶连接abcd黏性末端a与c相同；黏性末端b与d相同。2.双酶切限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA连接酶连接abcd质粒不会重新环化目的基因不会被环化优点1优点2优点3目的基因与质粒不会发生反向连接4.限制酶的选择原则（1）不破坏目的基因：切点应位于目的基因两端，如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和筛选。切割目的基因与质粒所选的限制酶应产生相同的黏性末端。①可以选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ。4.限制酶的选择原则（3）确保出现相同黏性末端②为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），应使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。第三步：将目的基因导入受体细胞Part031.将目的基因导入植物细胞方法1花粉管通道法我国科学家独创的一种方法，将Bt基因导入棉花细胞。用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中花粉管通道法子房注射花柱滴加在植物授粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。三、将目的基因导入受体细胞适用生物：开花植物①转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。（采用最多）方法2.农杆菌转化法②农杆菌特点：a.能在自然条件下侵染___________和___________，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；b.农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞后，能将________上的________（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到________________________；双子叶植物裸子植物Ti质粒Ti质粒T-DNA该细胞的染色体DNA上

将目的基因插入__________________中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入_____________。③利用农杆菌进行转化的思路：Ti质粒的T-DNA植物细胞三、将目的基因导入受体细胞此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒表现出新性状的植株导入植物细胞植物细胞将目的基因插入染色体DNA中目的基因Ti质粒T-DNA含重组Ti质粒的农杆菌转入农杆菌过程农杆菌转化法示意图Ti质粒目的基因构建基因表达载体导入农杆菌导入植物细胞T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中表达新性状植物组织培养三将目的基因导入受体细胞方法2.农杆菌转化法该过程经过____次拼接、____次导入？(1)第一次拼接______________________________________________________________________(2)第二次拼接______________________________________________________________________(3)第一次导入___________________________________________________________________(4)第二次导入____________________________________________________________________将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）两两将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）将目的基因导入受体细胞据图回答问题：03将目的基因导入受体细胞（1）导入方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵原因：①体积大，易操作；

②易表现出全能性。（3）过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物2.将目的基因导入动物细胞三、将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入微生物细胞（1）常用方法：Ca2+处理原核细胞（常选择大肠杆菌）可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。（3）过程：（目的？）（2）受体细胞：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收重组DNA增加细胞壁的通透性一般利用温度变化导入使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态三、将目的基因导入受体细胞(感受态细胞）胰腺提取筛选胰岛素mRNA胰岛素cDNA逆转录重组质粒质粒导入大肠杆菌mRNA胰岛素原胰岛素体外加工用原核生物生产胰岛素示意图[思考]当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时。若无法获得该蛋白，原因可能是？如何解决？若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？解决方法：使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞。原因：真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白质。原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工。所以原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行加工。[思考]第四步：目的基因的检测与鉴定Part04目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。1.检测与鉴定的方法分子水平的检测个体水平的鉴定四、目的基因的检测与鉴定分子杂交技术（1）个体水平的检测转基因生物检测方法观察目标抗虫植物害虫吞食害虫是否死亡抗病植物病毒(菌)感染是否出现病斑抗盐植物盐水浇灌是否正常生长抗除草剂植物喷洒除草剂是否正常生长获取目的基因产物的转基因生物提取细胞产物，与天然产品进行功能活性比较细胞产物的功能活性是否正常四、目的基因的检测与鉴定（2）分子水平的检测①PCR+电泳检测法四、目的基因的检测与鉴定（2）分子水平的检测②分子杂交检测法四、目的基因的检测与鉴定●制作基因探针（一小段单链DNA或RNA，带有检测标记，可与被检测片段互补配对）●提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；●高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。出现杂交带：不出现杂交带：已插入未插入结果

检测目的基因是否导入变性1、提取目的基因的DNA片段用放射性同位素标记，作为基因探针；2、使探针与转基因生物基因组杂交，若出现杂交带，则导入成功。原理：碱基互补配对原则04如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译③检测目的基因是否翻译成蛋白质——通过抗原—抗体杂交技术从棉花中提取蛋白质用相应抗体进行抗原—抗体杂交检测如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译抗原抗体特异性结合四、目的基因的检测与鉴定（2）分子水平的检测在抗原-抗体杂交中，目的蛋白是作为抗原还是抗体？抗原筛选和获取目的基因获取质粒、噬菌体等载体构建基因表达载体将含有目的基因的表达载体导入受体细胞检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性基因工程的基本操作流程图习题练习1.下列对DNA连接酶的功能描述正确的是()A.将碱基、脱氧核糖、磷酸连接起来B.在基因工程中只作用于两个黏性末端C.与DNA聚合酶作用的部位相同，作用对象不同D.用于DNA复制时母链与子链间形成氢键答案：C解析：

DNA连接酶的作用是在相邻两个核苷酸的磷酸和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，A、D错误；DNA连接酶在基因工程中作用于两个黏性末端或两个平末端，B错误；DNA连接酶与DNA聚合酶作用的部位相同，均在磷酸和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，作用对象不同，DNA连接酶作用于DNA片段，DNA聚合酶作用于单个游离的脱氧核苷酸，C正确。习题练习2.下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达()A.在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因B.通过PCR等技术检