微生物检验指导手册

微生物检验指导手册一、总则

微生物检验是评估样品中微生物污染程度、种类及活动性的重要手段，广泛应用于食品、药品、环境、生物制品等领域。本手册旨在提供一套标准化、系统化的微生物检验流程与操作指南，确保检验结果的准确性与可靠性。

二、检验前的准备

（一）环境与设备

1.检验环境：应在洁净、恒温（20-25℃）、恒湿（45%-55%）的实验室进行，避免交叉污染。

2.设备要求：

(1)超净工作台：净化效率≥99.9%。

(2)恒温培养箱：温度控制精度±0.5℃。

(3)显微镜：分辨率≥1000倍。

(4)天平：精度达0.1mg。

（二）试剂与耗材

1.培养基：常用包括麦肯锡琼脂（MAC）、血琼脂平板（BAP）、TSB液体培养基等。

2.试剂：

(1)无菌生理盐水：用于样品稀释。

(2)洗脱剂：如0.1%吐温80生理盐水，用于食品样品处理。

3.耗材：无菌试管、培养皿、接种环、移液器等，均需高压灭菌（121℃，15min）。

三、样品采集与处理

（一）采样原则

1.随机、均匀、无菌取样。

2.样品量：固体样品≥25g，液体样品≥100mL。

3.采样工具：使用一次性无菌采样勺/吸管。

（二）样品处理方法

1.固体样品：

(1)剪碎混匀，取足量样品。

(2)加入9倍无菌生理盐水，均质振荡（200rpm，1min）。

(3)稀释系列：10⁻¹至10⁻⁴梯度稀释。

2.液体样品：

(1)直接接种或加入1%氯化钠溶液稀释。

(2)混匀后取1mL加入9mL生理盐水。

四、微生物计数方法

（一）平板计数法（MPN法）

1.步骤：

(1)将10⁻¹、10⁻²、10⁻³稀释液各1mL加入含9mL生理盐水的试管中。

(2)每管接种3个平板，倾注30mL培养基。

(3)37℃培养48h，计数菌落数。

2.计算公式：

MPN（每100g/mL）=（C₁×a+C₂×b+C₃×c）/Σd×稀释倍数

其中，C为稀释倍数，a/b/c为各管菌落数，d为总接种量。

（二）直接计数法（显微镜法）

1.步骤：

(1)样品与染液（如美蓝）混合。

(2)滴加到载玻片上，覆盖盖玻片。

(3)油镜计数（≥200个视野），计算CFU/mL。

五、菌种鉴定

（一）形态学观察

1.显微镜检查：革兰染色区分细菌类型（如球菌、杆菌）。

2.培养特征：记录菌落颜色、形状、大小等。

（二）生化鉴定

1.常用试验：

(1)硝酸盐还原试验。

(2)酚红蛋白胨试验（pH指示）。

(3)动力试验（半固体培养基）。

2.仪器鉴定：API鉴定系统或MALDI-TOF质谱分析。

六、质量控制

（一）阳性对照

1.每批检验必须设置阳性对照（已知菌落数的培养基）。

2.控制范围：±20%误差。

（二）重复性检验

1.关键项目（如菌落总数）需双份平行检测。

2.结果差异＞10%需重新检验。

七、结果报告

（一）报告内容

1.样品信息：名称、批次、采样日期。

2.检验项目：菌落总数、大肠菌群等。

3.单位：CFU/g或CFU/mL。

（二）异常处理

1.超标样品需标注“拒收”并复检。

2.无法鉴定的菌株送专业机构确认。

八、注意事项

1.每次操作后需彻底消毒工作台面。

2.培养基过期或开封超过2个月不得使用。

3.严禁手直接接触样品或培养基表面。

一、总则

微生物检验是评估样品中微生物污染程度、种类及活动性的重要手段，广泛应用于食品、药品、环境、生物制品等领域。本手册旨在提供一套标准化、系统化的微生物检验流程与操作指南，确保检验结果的准确性与可靠性。

微生物检验的核心在于模拟微生物在适宜环境中的生长规律，通过特定的培养、计数、鉴定方法，判断样品的微生物状态。检验过程需严格遵循无菌操作原则，避免环境污染导致假阳性结果。同时，检验人员应熟悉各类培养基的特性和适用范围，选择最合适的检测方法。本手册将详细阐述从样品准备到结果报告的完整流程，并强调质量控制的重要性。

二、检验前的准备

（一）环境与设备

1.检验环境：

(1)实验室应设置独立检验区域，与清洁区、污染区分隔。

(2)空气洁净度要求：生物安全柜或超净工作台内≥3.5×10⁴CFU/m³（30min沉降菌）。

(3)温湿度控制：培养期间温度波动≤±2℃，相对湿度维持在45%-55%。

2.设备要求：

(1)超净工作台：定期使用紫外灯照射（30min）消毒，开启前用70%-75%酒精喷洒表面。

(2)恒温培养箱：校准温度计（每年1次），确保培养箱内温度均匀性（使用热分布测试仪）。

(3)显微镜：油镜需用专用镜油，使用后用擦镜纸蘸酒精清洁。

(4)天平：称量时需调平，避免气流干扰。

（二）试剂与耗材

1.培养基：

(1)麦肯锡琼脂（MAC）：用于分离肠道杆菌。成分包括胰蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、伊红美蓝。

(2)血琼脂平板（BAP）：用于培养需氧菌及鉴定β溶血性。需使用新鲜血（采后4h内使用）。

(3)TSB液体培养基：用于增菌培养，含胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母提取物。

2.试剂：

(1)无菌生理盐水：使用纯化水配制，分装于10mL无菌瓶，高压灭菌。

(2)洗脱剂：0.1%吐温80生理盐水，适用于食品表面取样。

3.耗材：

(1)无菌试管：熔封口需平整，灭菌后检查有无破损。

(2)接种环：金属环需用酒精灯火焰烧至红热，冷却后使用。

(3)移液器：校准刻度（每月1次），避免胶头污染。

三、样品采集与处理

（一）采样原则

1.目标：采集具有代表性的样品，减少微生物污染。

2.方式：

(1)固体样品：使用无菌采样铲或勺，避开表层及异常区域。

(2)液体样品：用无菌吸管或注射器直接吸取，避免接触容器内壁。

3.量要求：

(1)食品：25g（肉类）、100mL（饮料）、10cm²（表面）。

(2)环境：使用无菌棉签擦拭样表面（旋转5次）。

（二）样品处理方法

1.固体样品：

(1)剪碎混匀：将样品置于无菌研钵中，加9倍生理盐水研磨。

(2)稀释系列：梯度稀释至10⁻⁷，每级取1mL接种平板。

(3)注意：避免玻璃碎片混入，每次转移后用酒精灯火焰灭菌容器边缘。

2.液体样品：

(1)直接接种：100mL液体样品加入含9mL生理盐水的试管中，混匀后倾注平板。

(2)沉淀法：离心（3000rpm，5min）取上清液，沉淀物用生理盐水重悬。

3.表面样品：

(1)棉签法：旋转擦拭后，将棉签放入1mL生理盐水中匀浆。

(2)浸泡法：将表面放入含100mL生理盐水的容器中，震荡30min。

四、微生物计数方法

（一）平板计数法（MPN法）

1.步骤：

(1)稀释液制备：取样品10g/mL，依次稀释至10⁻¹至10⁻⁴。

(2)接种平板：每个稀释度取1mL加入含9mL生理盐水的试管，各接种3个平板。

(3)培养：37℃培养48h，计数30-300CFU的平板。

2.计算公式：

MPN（每100g/mL）=（C₁×a+C₂×b+C₃×c）/Σd×稀释倍数

其中，C为稀释倍数，a/b/c为各管菌落数，d为总接种量。

（二）直接计数法（显微镜法）

1.步骤：

(1)样品制备：取0.1g/mL样品，加1滴美蓝染液，混匀。

(2)制片：滴加到载玻片上，覆盖盖玻片，边缘用指甲油封边。

(3)计数：油镜观察，每视野计数≥200个，计算CFU/mL。

2.注意事项：

(1)美蓝染色时间：3-5min，过长会抑制嗜碱性细菌。

(2)重复计数：每个样品需计数2张玻片。

五、菌种鉴定

（一）形态学观察

1.显微镜检查：

(1)革兰染色：按顺序加热复红（30s）、碘液（1min）、95%酒精（5s）、复红（30s）。

(2)菌落观察：记录形状（圆形/卵圆形）、边缘（整齐/波状）、颜色（黄色/粉色）。

2.生化特性：

(1)API鉴定：选择革兰阳性菌鉴定条（如API20E），按说明书接种、培养。

(2)代谢试验：检测氧化酶、凝固酶、乳糖发酵等。

六、质量控制

（一）阳性对照

1.设置要求：

(1)每批次检验必须添加已知菌落数的培养基（如10⁵CFU/mL）。

(2)对照值偏差：±20%内为合格。

2.操作：

(1)将阳性对照与样品同步培养，结果需在允许范围内。

(2)若超标需重新检验并查找原因。

（二）重复性检验

1.检测项目：菌落总数、大肠菌群等。

2.要求：

(1)平行样品差值＞10%需复检。

(2)记录每次检测的变异系数（CV）。

七、结果报告

（一）报告内容

1.样品信息：名称、批号、采样日期、检测人。

2.检验项目：菌落总数、大肠菌群、致病菌等。

3.单位：CFU/g或CFU/mL。

（二）异常处理

1.超标样品：标注“不合格”并记录复查结果。

2.无法鉴定的菌株：送第三方实验室进一步检测。

八、注意事项

1.操作流程：

(1)每次接种后用酒精灯火焰灭菌接种环。

(2)培养基开封后需标注日期，超过2个月禁止使用。

2.安全防护：

(1)穿戴无菌手套，避免接触非无菌区域。

(2)污染培养基用10%漂白水浸泡30min后丢弃。

3.记录规范：

(1)每步操作需在检验记录表上签字确认。

(2)电子版报告需双人审核。

一、总则

微生物检验是评估样品中微生物污染程度、种类及活动性的重要手段，广泛应用于食品、药品、环境、生物制品等领域。本手册旨在提供一套标准化、系统化的微生物检验流程与操作指南，确保检验结果的准确性与可靠性。

二、检验前的准备

（一）环境与设备

1.检验环境：应在洁净、恒温（20-25℃）、恒湿（45%-55%）的实验室进行，避免交叉污染。

2.设备要求：

(1)超净工作台：净化效率≥99.9%。

(2)恒温培养箱：温度控制精度±0.5℃。

(3)显微镜：分辨率≥1000倍。

(4)天平：精度达0.1mg。

（二）试剂与耗材

1.培养基：常用包括麦肯锡琼脂（MAC）、血琼脂平板（BAP）、TSB液体培养基等。

2.试剂：

(1)无菌生理盐水：用于样品稀释。

(2)洗脱剂：如0.1%吐温80生理盐水，用于食品样品处理。

3.耗材：无菌试管、培养皿、接种环、移液器等，均需高压灭菌（121℃，15min）。

三、样品采集与处理

（一）采样原则

1.随机、均匀、无菌取样。

2.样品量：固体样品≥25g，液体样品≥100mL。

3.采样工具：使用一次性无菌采样勺/吸管。

（二）样品处理方法

1.固体样品：

(1)剪碎混匀，取足量样品。

(2)加入9倍无菌生理盐水，均质振荡（200rpm，1min）。

(3)稀释系列：10⁻¹至10⁻⁴梯度稀释。

2.液体样品：

(1)直接接种或加入1%氯化钠溶液稀释。

(2)混匀后取1mL加入9mL生理盐水。

四、微生物计数方法

（一）平板计数法（MPN法）

1.步骤：

(1)将10⁻¹、10⁻²、10⁻³稀释液各1mL加入含9mL生理盐水的试管中。

(2)每管接种3个平板，倾注30mL培养基。

(3)37℃培养48h，计数菌落数。

2.计算公式：

MPN（每100g/mL）=（C₁×a+C₂×b+C₃×c）/Σd×稀释倍数

其中，C为稀释倍数，a/b/c为各管菌落数，d为总接种量。

（二）直接计数法（显微镜法）

1.步骤：

(1)样品与染液（如美蓝）混合。

(2)滴加到载玻片上，覆盖盖玻片。

(3)油镜计数（≥200个视野），计算CFU/mL。

五、菌种鉴定

（一）形态学观察

1.显微镜检查：革兰染色区分细菌类型（如球菌、杆菌）。

2.培养特征：记录菌落颜色、形状、大小等。

（二）生化鉴定

1.常用试验：

(1)硝酸盐还原试验。

(2)酚红蛋白胨试验（pH指示）。

(3)动力试验（半固体培养基）。

2.仪器鉴定：API鉴定系统或MALDI-TOF质谱分析。

六、质量控制

（一）阳性对照

1.每批检验必须设置阳性对照（已知菌落数的培养基）。

2.控制范围：±20%误差。

（二）重复性检验

1.关键项目（如菌落总数）需双份平行检测。

2.结果差异＞10%需重新检验。

七、结果报告

（一）报告内容

1.样品信息：名称、批次、采样日期。

2.检验项目：菌落总数、大肠菌群等。

3.单位：CFU/g或CFU/mL。

（二）异常处理

1.超标样品需标注“拒收”并复检。

2.无法鉴定的菌株送专业机构确认。

八、注意事项

1.每次操作后需彻底消毒工作台面。

2.培养基过期或开封超过2个月不得使用。

3.严禁手直接接触样品或培养基表面。

一、总则

微生物检验是评估样品中微生物污染程度、种类及活动性的重要手段，广泛应用于食品、药品、环境、生物制品等领域。本手册旨在提供一套标准化、系统化的微生物检验流程与操作指南，确保检验结果的准确性与可靠性。

微生物检验的核心在于模拟微生物在适宜环境中的生长规律，通过特定的培养、计数、鉴定方法，判断样品的微生物状态。检验过程需严格遵循无菌操作原则，避免环境污染导致假阳性结果。同时，检验人员应熟悉各类培养基的特性和适用范围，选择最合适的检测方法。本手册将详细阐述从样品准备到结果报告的完整流程，并强调质量控制的重要性。

二、检验前的准备

（一）环境与设备

1.检验环境：

(1)实验室应设置独立检验区域，与清洁区、污染区分隔。

(2)空气洁净度要求：生物安全柜或超净工作台内≥3.5×10⁴CFU/m³（30min沉降菌）。

(3)温湿度控制：培养期间温度波动≤±2℃，相对湿度维持在45%-55%。

2.设备要求：

(1)超净工作台：定期使用紫外灯照射（30min）消毒，开启前用70%-75%酒精喷洒表面。

(2)恒温培养箱：校准温度计（每年1次），确保培养箱内温度均匀性（使用热分布测试仪）。

(3)显微镜：油镜需用专用镜油，使用后用擦镜纸蘸酒精清洁。

(4)天平：称量时需调平，避免气流干扰。

（二）试剂与耗材

1.培养基：

(1)麦肯锡琼脂（MAC）：用于分离肠道杆菌。成分包括胰蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、伊红美蓝。

(2)血琼脂平板（BAP）：用于培养需氧菌及鉴定β溶血性。需使用新鲜血（采后4h内使用）。

(3)TSB液体培养基：用于增菌培养，含胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母提取物。

2.试剂：

(1)无菌生理盐水：使用纯化水配制，分装于10mL无菌瓶，高压灭菌。

(2)洗脱剂：0.1%吐温80生理盐水，适用于食品表面取样。

3.耗材：

(1)无菌试管：熔封口需平整，灭菌后检查有无破损。

(2)接种环：金属环需用酒精灯火焰烧至红热，冷却后使用。

(3)移液器：校准刻度（每月1次），避免胶头污染。

三、样品采集与处理

（一）采样原则

1.目标：采集具有代表性的样品，减少微生物污染。

2.方式：

(1)固体样品：使用无菌采样铲或勺，避开表层及异常区域。

(2)液体样品：用无菌吸管或注射器直接吸取，避免接触容器内壁。

3.量要求：

(1)食品：25g（肉类）、100mL（饮料）、10cm²（表面）。

(2)环境：使用无菌棉签擦拭样表面（旋转5次）。

（二）样品处理方法

1.固体样品：

(1)剪碎混匀：将样品置于无菌研钵中，加9倍生理盐水研磨。

(2)稀释系列：梯度稀释至10⁻⁷，每级取1mL接种平板。

(3)注意：避免玻璃碎片混入，每次转移后用酒精灯火焰灭菌容器边缘。

2.液体样品：

(1)直接接种：100mL液体样品加入含9mL生理盐水的试管中，混匀后倾注平板。

(2)沉淀法：离心（3000rpm，5min）取上清液，沉淀物用生理盐水重悬。

3.表面样品：

(1)棉签法：旋转擦拭后，将棉签放入1mL生理盐水中匀浆。

(2)浸泡法：将表面放入含100mL生理盐水的容器中，震荡30min。

四、微生物计数方法

（一）平板计数法（MPN法）

1.步骤：

(1)稀释液制备：取样品10g/mL，依次稀释至10⁻¹至10⁻⁴。

(2)接种平板：每个稀释度取1mL加入含9mL生理盐水的试管，各接种3个平板。

(3)培养：37℃培养48h，计数30-300CFU的平板。

2.计算公式：

MPN（每100g/mL）=（C₁×a+C₂×b+C₃×c）/Σd×稀释倍数

其中，C为稀释倍数，a/b/c为各管菌落数，d为总接种量。

（二）直接计数法（显微镜法）

1.步骤：

(1)样品制备：取0.1g/mL样品，加1滴美蓝染液，混匀。

(2)制片：滴加到载玻片上，覆盖盖玻片，边缘用指甲油封边。

(3)计数：油镜观察，每视野计数≥200个，计算CFU/mL。

2.注