大黄素对人结肠癌细胞增殖的抑制效应及其机制探究

大黄素对人结肠癌细胞增殖的抑制效应及其机制探究一、引言1.1研究背景与意义结肠癌作为常见的消化道恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。近年来，其发病率在全球范围内呈上升趋势，尤其在经济发达地区和老龄化社会中更为显著。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球癌症负担数据显示，结直肠癌新发病例数达193万，死亡病例数为94万，分别位居全球癌症发病和死亡的第三位和第二位。在中国，随着居民生活方式的改变和人口老龄化的加剧，结肠癌的发病率也逐年攀升，已成为消化系统恶性肿瘤中发病率增长最快的肿瘤之一。目前，结肠癌的治疗方法主要包括手术切除、化疗、放疗以及靶向治疗等。然而，这些治疗方法存在一定的局限性。手术切除对于早期结肠癌患者具有较好的疗效，但对于中晚期患者，术后复发和转移的风险较高；化疗和放疗虽能在一定程度上抑制肿瘤细胞的生长，但同时也会对正常细胞造成损伤，导致严重的不良反应，影响患者的生活质量和治疗依从性；靶向治疗虽然具有较高的特异性，但部分患者会出现耐药现象，限制了其临床应用。因此，寻找安全、有效的新型治疗药物或方法成为结肠癌研究领域的重要课题。大黄素（Emodin）是一种天然的蒽醌类化合物，广泛存在于大黄、何首乌、虎杖等多种中药材中。作为传统中药的活性成分之一，大黄素具有多种药理活性，如抗菌、抗炎、抗氧化、免疫调节以及抗肿瘤等。近年来，越来越多的研究表明，大黄素在抗肿瘤方面展现出巨大的潜力，能够通过多种机制抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成以及肿瘤细胞的侵袭和转移等。在结肠癌研究中，已有研究报道大黄素对结肠癌细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用，但其具体的作用机制尚未完全明确。深入研究大黄素抑制人结肠癌细胞增殖的作用及其机制，不仅有助于揭示大黄素的抗肿瘤作用靶点和信号通路，为开发新型的结肠癌治疗药物提供理论依据，还可能为临床结肠癌的治疗提供新的策略和方法，具有重要的理论意义和临床应用价值。1.2研究目的本研究旨在深入探究大黄素对人结肠癌细胞增殖的抑制作用及其潜在机制，具体目标如下：明确大黄素对人结肠癌细胞增殖的抑制效果：运用细胞增殖实验，如CCK-8法、EdU标记法等，检测不同浓度大黄素作用于人结肠癌细胞系（如HT-29、SW480等）不同时间后的细胞增殖情况，绘制细胞生长曲线，计算细胞增殖抑制率，从而确定大黄素对人结肠癌细胞增殖的抑制作用及其量效关系和时效关系。揭示大黄素诱导人结肠癌细胞凋亡的机制：借助流式细胞术、Hoechst染色、AnnexinV-FITC/PI双染等方法，检测大黄素处理后人结肠癌细胞凋亡率的变化；采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术，检测凋亡相关蛋白（如Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白等）的表达水平，以及线粒体膜电位的变化，探讨大黄素是否通过线粒体凋亡途径或死亡受体凋亡途径诱导人结肠癌细胞凋亡，明确其在凋亡过程中发挥关键作用的信号分子和调控机制。探究大黄素对人结肠癌细胞周期的影响及其机制：利用流式细胞术分析大黄素处理后人结肠癌细胞周期分布的改变，确定细胞周期阻滞的时相；通过检测细胞周期相关蛋白（如Cyclin、CDK、p21、p27等）的表达水平，研究大黄素影响细胞周期进程的分子机制，阐明其是否通过调控细胞周期蛋白和激酶的活性，干扰细胞周期的正常运转，进而抑制结肠癌细胞的增殖。探讨大黄素对人结肠癌细胞信号通路的影响：基于前期研究和相关文献报道，选取可能与大黄素抗肿瘤作用相关的信号通路，如PI3K/AKT、MAPK/ERK、Wnt/β-catenin等信号通路。运用Westernblot、免疫荧光、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）等技术，检测大黄素处理后人结肠癌细胞中这些信号通路关键分子的磷酸化水平、蛋白表达量以及相关基因的转录水平，明确大黄素对各信号通路的激活或抑制作用，确定其在抑制结肠癌细胞增殖过程中发挥核心调控作用的信号通路及上下游分子靶点。评估大黄素在体内对结肠癌生长的抑制作用：构建人结肠癌细胞裸鼠移植瘤模型，给予不同剂量的大黄素进行干预，观察裸鼠移植瘤的生长情况，测量肿瘤体积和重量，计算抑瘤率；通过免疫组织化学染色、TUNEL染色等方法，检测肿瘤组织中增殖相关蛋白（如Ki-67）、凋亡相关蛋白、血管生成相关因子以及信号通路关键分子的表达情况，验证大黄素在体内对结肠癌生长的抑制作用及其机制，为其临床应用提供更直接的实验依据。1.3国内外研究现状1.3.1大黄素的抗癌作用研究大黄素作为一种天然的蒽醌类化合物，其抗癌作用在国内外受到广泛关注。大量研究表明，大黄素对多种肿瘤细胞具有抑制作用，包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌等。在体外细胞实验中，研究人员通过不同的细胞模型验证了大黄素的抗癌活性。例如，在肝癌细胞研究中，大黄素能够显著抑制肝癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，且呈剂量和时间依赖性。对肺癌细胞的研究也发现，大黄素可抑制肺癌细胞的迁移和侵袭能力，降低细胞的运动性，从而减少肿瘤细胞的转移风险。在体内动物实验方面，相关研究进一步证实了大黄素的抗癌效果。构建人肿瘤细胞裸鼠移植瘤模型，给予大黄素干预后，发现肿瘤体积明显减小，生长速度减缓，表明大黄素在体内也能有效抑制肿瘤的生长。这些研究结果为大黄素在肿瘤治疗中的应用提供了重要的实验依据。1.3.2大黄素抗癌作用机制研究大黄素抗癌作用机制的研究是目前的热点领域，国内外学者从多个角度进行了深入探索。诱导细胞凋亡：细胞凋亡是一种程序性细胞死亡方式，在肿瘤的发生发展过程中起着重要的调控作用。大黄素被发现可以通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡。一方面，大黄素能够激活线粒体凋亡途径。它可以促使线粒体释放细胞色素C，细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、半胱天冬酶-9（Caspase-9）等形成凋亡小体，进而激活下游的Caspase-3等凋亡执行蛋白，引发细胞凋亡。另一方面，大黄素还可能通过死亡受体途径诱导细胞凋亡。它可以上调死亡受体如Fas、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体（TRAIL-R）等的表达，使肿瘤细胞对死亡信号更加敏感，激活Caspase-8，启动细胞凋亡级联反应。此外，大黄素还可能通过调节Bcl-2家族蛋白的表达来影响细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bad等），大黄素能够降低抗凋亡蛋白的表达，同时上调促凋亡蛋白的表达，打破细胞内凋亡平衡，促使细胞走向凋亡。阻滞细胞周期：细胞周期的正常运转是细胞增殖的基础，而肿瘤细胞往往存在细胞周期调控异常，导致细胞无限增殖。大黄素可以通过调控细胞周期相关蛋白，使肿瘤细胞阻滞于特定的细胞周期时相，从而抑制细胞增殖。研究发现，大黄素能够抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）和细胞周期蛋白（Cyclin）的表达和活性。例如，在结肠癌细胞中，大黄素可以下调CyclinD1、CyclinE等的表达，使细胞周期阻滞在G1期；在肝癌细胞中，大黄素则可使细胞周期阻滞于G2/M期，这与它上调p21、p27等细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的表达有关，p21、p27可以与CDK结合，抑制其活性，从而阻止细胞周期的进程。抑制肿瘤血管生成：肿瘤的生长和转移依赖于新生血管提供营养和氧气，因此抑制肿瘤血管生成是肿瘤治疗的重要策略之一。大黄素在抑制肿瘤血管生成方面具有显著作用。它可以抑制血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）的表达和活性，减少VEGF与VEGFR的结合，从而阻断下游信号通路的激活，抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成。此外，大黄素还能够抑制基质金属蛋白酶（MMPs）的表达和活性，MMPs在肿瘤血管生成过程中参与细胞外基质的降解和重塑，大黄素对MMPs的抑制作用可以阻碍肿瘤血管生成的微环境构建，进而抑制肿瘤血管生成。调节信号通路：细胞内存在多条信号通路，它们相互交织形成复杂的网络，共同调控细胞的增殖、凋亡、分化等生物学过程。大黄素可以通过调节多种信号通路来发挥抗癌作用。其中，PI3K/AKT信号通路在肿瘤细胞的存活、增殖和代谢中起关键作用。大黄素能够抑制PI3K的活性，阻止AKT的磷酸化，从而阻断PI3K/AKT信号通路的激活，抑制肿瘤细胞的生长和存活。MAPK/ERK信号通路也与肿瘤的发生发展密切相关，大黄素可以抑制ERK1/2的磷酸化，降低其下游靶基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。此外，Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤细胞的干性维持、增殖和转移中具有重要作用，大黄素能够抑制Wnt信号通路的激活，减少β-catenin在细胞核内的积累，降低其下游靶基因如c-Myc、CyclinD1等的表达，进而抑制肿瘤细胞的增殖和转移。尽管国内外在大黄素抗癌作用及机制研究方面取得了一定的进展，但仍存在一些问题和挑战。例如，大黄素在体内的药代动力学特性和生物利用度较低，限制了其临床应用；大黄素作用的分子靶点和信号通路复杂，各通路之间的相互作用及协同机制尚不完全清楚；目前大多数研究集中在体外细胞实验和动物实验，临床研究相对较少，大黄素在人体中的安全性和有效性还需要进一步验证。因此，深入研究大黄素的抗癌作用机制，提高其生物利用度，开展更多的临床研究，对于推动大黄素在肿瘤治疗中的应用具有重要意义。二、大黄素与结肠癌细胞概述2.1大黄素的特性2.1.1结构与来源大黄素（Emodin），化学名称为1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌，分子式为C_{15}H_{10}O_{5}，分子量为270.23。其化学结构由一个蒽醌母核以及分布在不同位置的羟基和甲基构成。这种独特的结构赋予了大黄素一系列特殊的物理化学性质和生物学活性。从结构上看，蒽醌母核的共轭体系使其具有一定的稳定性和电子云分布特点，而羟基和甲基的存在则进一步影响了大黄素的溶解性、极性以及与生物分子的相互作用能力。羟基的亲水性在一定程度上影响了大黄素在不同溶剂中的溶解行为，而甲基的疏水性则对其与细胞膜等生物膜的相互作用产生作用。大黄素广泛存在于多种植物中，是许多传统中药材的活性成分之一。在蓼科植物中，掌叶大黄（RheumpalmatumL.）、唐古特大黄（RheumtanguticumMaxim.exBalf.）和药用大黄（RheumofficinaleBaill.）的根茎和根中均含有丰富的大黄素。这些大黄属植物在我国有着悠久的药用历史，其主要功效得益于大黄素等多种活性成分的协同作用。除大黄属植物外，虎杖（PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.）也是提取大黄素的重要来源之一。虎杖中不仅含有大黄素，还含有白藜芦醇等其他具有生物活性的成分，在临床上被用于治疗多种疾病。此外，何首乌（Fallopiamultiflora(Thunb.)Harald.）中也含有大黄素，何首乌常用于肝肾阴虚、须发早白等病症的治疗，大黄素在其中可能发挥着调节机体代谢、抗氧化等作用。除植物来源外，一些真菌也能够合成大黄素，如某些曲霉属和青霉属真菌在特定的培养条件下可以产生大黄素。不同来源的大黄素，其化学结构和基本性质相同，但由于提取工艺和杂质成分的差异，可能在纯度和活性上存在一定的差异。在实际应用中，需要根据具体需求选择合适的来源和提取方法，以确保获得高质量的大黄素。2.1.2理化性质大黄素为橙黄色长针状结晶，具有蒽醌的特殊反应。其熔点为256℃-257℃，这一熔点特性使其在一定温度条件下能够保持相对稳定的固态结构。在溶解性方面，大黄素几乎不溶于水，这是由于其分子结构中疏水性的蒽醌母核占比较大，而亲水性的羟基相对较少，导致其在极性溶剂水中的溶解度极低。然而，大黄素可溶于乙醇、***、***仿、苯等有机溶剂。在乙醇中，大黄素能够较好地溶解，形成橙黄色的溶液，这一特性使得在实验室研究和工业生产中，乙醇常被用作提取和溶解大黄素的常用溶剂。此外，大黄素还可溶于苛性碱水溶液和碳酸钠水溶液，并且在氨溶液中会显示出樱红色。这是因为大黄素分子中的羟基具有一定的酸性，能够与碱发生反应，形成可溶性的盐类，从而增加其在碱性溶液中的溶解度。这种在不同溶剂中的溶解特性，为大黄素的提取、分离、纯化以及分析检测等提供了重要的依据。例如，在提取大黄素时，可以利用其在有机溶剂中的溶解性，采用有机溶剂萃取法从植物原料中提取大黄素；在对大黄素进行分析检测时，可以根据其在不同溶剂中的溶解特性，选择合适的溶剂来配制标准溶液和样品溶液。大黄素在不同条件下的稳定性也值得关注。在常温、避光、干燥的条件下，大黄素相对稳定，其化学结构和生物活性能够保持较长时间。然而，当受到光照、高温、氧化等因素影响时，大黄素可能会发生分解或氧化反应，导致其结构和活性发生改变。光照条件下，大黄素分子吸收光能，激发态的分子可能发生光化学反应，如氧化、异构化等，从而降低其含量和活性。在高温环境中，大黄素的稳定性也会受到影响，可能会发生热分解反应，导致其结构破坏。此外，大黄素具有一定的还原性，在遇到强氧化剂时，容易被氧化，其蒽醌结构中的某些化学键可能会发生断裂或氧化修饰，进而影响其生物活性。因此，在储存和使用大黄素时，需要采取适当的措施，如避光、低温、密封保存等，以确保其稳定性和活性。2.1.3药理活性大黄素具有广泛的药理活性，在多个领域展现出潜在的应用价值。在抗氧化方面，大黄素是一种有效的天然抗氧化剂，能够通过多种途径清除体内的自由基。自由基是一类具有高度活性的分子，在正常生理代谢过程中会产生，但当体内自由基积累过多时，会攻击生物大分子，如脂质、蛋白质和核酸，导致氧化应激损伤，进而引发多种疾病，如心血管疾病、神经退行性疾病和肿瘤等。大黄素分子中的酚羟基具有供氢能力，能够与自由基发生反应，将自由基转化为相对稳定的分子，从而终止自由基链式反应，减少氧化损伤。大黄素还可以调节体内抗氧化酶系统的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）等。这些抗氧化酶能够协同作用，清除体内不同类型的自由基，维持氧化还原平衡。大黄素通过上调这些抗氧化酶的表达和活性，增强机体自身的抗氧化防御能力，保护细胞免受自由基的侵害。大黄素的抗炎作用也十分显著。炎症反应是机体对各种损伤因素的一种防御反应，但过度或持续的炎症反应会导致组织损伤和疾病的发生。大黄素可以通过抑制炎症介质的释放来减轻炎症反应。它能够抑制核因子-κB（NF-κB）信号通路的激活，NF-κB是一种重要的转录因子，在炎症反应中起关键作用，它可以调控多种炎症介质基因的表达，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）等。大黄素通过抑制NF-κB的活化，减少这些炎症介质的产生和释放，从而减轻炎症反应对组织的损伤。大黄素还可以调节免疫细胞的功能，抑制炎症相关基因的表达。它可以抑制巨噬细胞的活化和增殖，减少其分泌炎症介质的能力；同时，大黄素还可以调节T淋巴细胞和B淋巴细胞的功能，抑制免疫细胞的过度活化，从而减轻炎症反应。抗菌活性是大黄素的又一重要药理特性。大黄素对多种细菌具有抑制作用，包括金黄色葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、枯草杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、流感杆菌、肺炎球菌、卡他球菌等常见病原菌。其抗菌作用机制主要与抑制细菌的代谢过程有关。大黄素能够抑制线粒体呼吸链电子传递，干扰细菌的能量代谢，使细菌无法获得足够的能量来维持正常的生命活动。大黄素还可以抑制呼吸与氨基酸、糖和蛋白质代谢中间产物的氧化和脱氢等过程，影响细菌的物质合成和代谢平衡，最终导致细菌生长受抑。大黄素对临床常见厌氧性细菌也有较强的抑制作用，其最低抑菌浓度（MIC）略高于甲硝唑，在8μg/ml浓度下能使76%-91%的厌氧菌生长受到抑制。这使得大黄素在治疗厌氧菌感染相关疾病方面具有潜在的应用前景。最为关键的是，大黄素在抗肿瘤领域表现出巨大的潜力。研究表明，大黄素对多种肿瘤细胞具有抑制增殖、诱导凋亡、抑制侵袭和转移以及抑制肿瘤血管生成等作用。在抑制肿瘤细胞增殖方面，大黄素可以通过调控细胞周期相关蛋白，使肿瘤细胞阻滞于特定的细胞周期时相，从而抑制细胞的分裂和增殖。在结肠癌细胞中，大黄素能够下调CyclinD1、CyclinE等细胞周期蛋白的表达，使细胞周期阻滞在G1期，阻止细胞进入DNA合成期（S期），从而抑制结肠癌细胞的增殖。大黄素还可以通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗癌作用。它可以激活线粒体凋亡途径，促使线粒体释放细胞色素C，细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、半胱天冬酶-9（Caspase-9）等形成凋亡小体，进而激活下游的Caspase-3等凋亡执行蛋白，引发细胞凋亡。大黄素还可能通过死亡受体途径诱导细胞凋亡，上调死亡受体如Fas、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体（TRAIL-R）等的表达，激活Caspase-8，启动细胞凋亡级联反应。在抑制肿瘤侵袭和转移方面，大黄素能够抑制基质金属蛋白酶（MMPs）的表达和活性，MMPs在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中起着重要作用，它们可以降解细胞外基质，为肿瘤细胞的迁移和扩散提供条件。大黄素通过抑制MMPs的活性，减少细胞外基质的降解，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移能力。大黄素还可以抑制肿瘤血管生成，肿瘤的生长和转移依赖于新生血管提供营养和氧气，大黄素可以抑制血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）的表达和活性，减少VEGF与VEGFR的结合，阻断下游信号通路的激活，抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，从而切断肿瘤的营养供应，抑制肿瘤的生长和转移。2.2结肠癌细胞特点2.2.1结肠癌细胞的生物学特性结肠癌细胞具有独特的生物学特性，这些特性使其在生长、增殖、侵袭和转移等方面与正常结肠细胞存在显著差异。在增殖能力上，结肠癌细胞呈现出失控的增殖状态。正常结肠细胞的增殖受到严格的调控机制，包括细胞周期调控蛋白、生长因子及其受体等多种因素的协同作用，以维持肠道组织的正常结构和功能。然而，结肠癌细胞由于基因的突变或异常表达，导致细胞周期调控紊乱。例如，细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）和细胞周期蛋白（Cyclin）的异常表达，使得结肠癌细胞能够持续进入细胞周期进行分裂，从而实现快速增殖。研究表明，在许多结肠癌细胞系中，CyclinD1的表达明显上调，它与CDK4/6形成复合物，促进细胞从G1期进入S期，加速细胞增殖。此外，结肠癌细胞还能够分泌多种生长因子，如表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）等，这些生长因子与其受体结合后，激活下游的信号通路，如PI3K/AKT、MAPK/ERK等，进一步促进细胞的增殖。在侵袭和转移能力方面，结肠癌细胞表现出更强的侵袭性和转移倾向。正常结肠细胞之间通过紧密连接、黏着连接等结构维持细胞间的紧密联系，并且细胞外基质（ECM）对细胞的迁移起到限制作用。而结肠癌细胞能够通过多种方式突破这些限制。结肠癌细胞可以分泌多种蛋白水解酶，如基质金属蛋白酶（MMPs）家族成员，包括MMP-2、MMP-9等。这些蛋白水解酶能够降解细胞外基质中的成分，如胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白等，为癌细胞的迁移开辟道路。MMP-2可以降解IV型胶原蛋白，而IV型胶原蛋白是基底膜的主要成分之一，基底膜的破坏使得癌细胞能够更容易地穿透组织屏障，进入周围组织和血管。结肠癌细胞表面的黏附分子表达也发生改变。例如，E-钙黏蛋白的表达下调，E-钙黏蛋白是一种重要的细胞间黏附分子，它的减少导致癌细胞之间的黏附力下降，使得癌细胞更容易脱离原发肿瘤灶，发生侵袭和转移。同时，结肠癌细胞会上调一些整合素的表达，整合素可以与细胞外基质中的成分结合，促进癌细胞与周围组织的黏附，进而帮助癌细胞在新的部位定植和生长。2.2.2结肠癌的发病机制与信号通路结肠癌的发病是一个多因素、多步骤的复杂过程，涉及遗传因素、环境因素以及生活方式等多个方面。在遗传因素方面，一些基因突变和染色体异常在结肠癌的发生发展中起着关键作用。例如，APC（adenomatouspolyposiscoli）基因是一种重要的抑癌基因，约80%的结肠癌患者存在APC基因突变。APC基因的正常功能是参与Wnt信号通路的调控，它可以促进β-catenin的降解，从而抑制Wnt信号通路的过度激活。当APC基因发生突变时，其对β-catenin的降解作用减弱，导致β-catenin在细胞内积累，并进入细胞核与转录因子TCF/LEF结合，激活下游靶基因如c-Myc、CyclinD1等的表达，促进细胞的增殖和肿瘤的发生。此外，KRAS基因的突变也较为常见，KRAS基因编码一种小GTP酶，在RAS-RAF-MEK-ERK信号通路中发挥重要作用。KRAS基因突变后，其编码的蛋白持续处于激活状态，导致该信号通路的过度激活，促进细胞的增殖、存活和迁移。环境因素对结肠癌的发生也有着重要影响。长期高脂、高蛋白、低纤维饮食被认为是结肠癌的重要危险因素。高脂饮食会增加肠道内胆汁酸的分泌，胆汁酸在肠道细菌的作用下可以转化为具有致癌性的次级胆汁酸，如脱氧胆酸和石胆酸，这些次级胆汁酸可以损伤结肠黏膜上皮细胞的DNA，诱导基因突变，从而促进结肠癌的发生。低纤维饮食则会导致肠道蠕动减慢，使粪便在肠道内停留时间延长，增加有害物质与结肠黏膜的接触时间，也有利于结肠癌的发生。吸烟、酗酒等不良生活方式也与结肠癌的发病风险增加相关。吸烟会导致体内产生大量的自由基，这些自由基可以损伤细胞的DNA，引发基因突变；酗酒则会影响肝脏的代谢功能，导致体内毒素堆积，也可能对结肠黏膜造成损伤，增加结肠癌的发病风险。在结肠癌的发病过程中，多条信号通路的异常激活或抑制发挥着关键作用。除了上述提到的Wnt/β-catenin信号通路和RAS-RAF-MEK-ERK信号通路外，PI3K/AKT信号通路也在结肠癌的发生发展中扮演重要角色。PI3K可以被多种生长因子受体激活，如EGFR、PDGFR等。激活后的PI3K将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）转化为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3可以招募AKT到细胞膜上，并在其他激酶的作用下使AKT磷酸化而激活。激活的AKT可以通过多种途径促进细胞的存活、增殖和代谢。它可以抑制细胞凋亡相关蛋白的活性，如Bad、Caspase等，从而促进细胞存活；可以激活mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）信号通路，促进蛋白质合成和细胞生长；还可以调节细胞代谢相关酶的活性，如磷酸果糖激酶-1（PFK-1）等，增加细胞的糖代谢和能量供应。在结肠癌中，PI3K/AKT信号通路常常因为PI3K基因的突变或PTEN（一种抑癌基因，能够负向调节PI3K/AKT信号通路）的缺失而过度激活，促进肿瘤细胞的生长和存活。2.2.3常见的人结肠癌细胞系介绍在结肠癌的研究中，常用的人结肠癌细胞系有多种，它们各自具有独特的生物学特性，为研究结肠癌的发病机制、治疗靶点以及药物筛选等提供了重要的实验模型。SW480细胞系来源于一位51岁男性白人结肠癌患者的原位肿瘤组织。该细胞系具有高度的侵袭性和转移能力，其生物学特性使其成为研究结肠癌侵袭和转移机制的常用模型。在细胞形态上，SW480细胞呈上皮样，贴壁生长。研究发现，SW480细胞中某些基因的表达水平与肿瘤的侵袭和转移密切相关。例如，其MMP-9的表达水平较高，这使得SW480细胞能够有效地降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。SW480细胞还高表达一些与肿瘤干细胞特性相关的标志物，如CD133等，提示该细胞系中可能存在肿瘤干细胞亚群，肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化的能力，对肿瘤的复发和转移起着重要作用。HT-29细胞系来源于一位44岁女性结肠癌患者的肿瘤组织。该细胞系具有较强的增殖能力，在适宜的培养条件下能够快速生长。HT-29细胞呈上皮样形态，具有紧密的细胞间连接，类似于正常结肠上皮细胞的结构。在分子生物学特性方面，HT-29细胞中存在一些与细胞增殖和分化相关基因的异常表达。例如，其CyclinD1的表达水平较高，这有助于促进细胞周期的进程，使细胞快速进入增殖状态。HT-29细胞还可以分泌多种细胞因子和生长因子，如IL-8、VEGF等，这些因子可以调节细胞的生长、增殖以及肿瘤微环境，促进肿瘤的生长和血管生成。Caco-2细胞系最初分离自一名72岁男性白人的结肠腺癌组织。Caco-2细胞具有较强的分化能力，在培养过程中能够自发地分化形成具有肠上皮细胞特性的单层细胞，包括形成微绒毛、紧密连接等结构，这使得Caco-2细胞成为研究肠道吸收、代谢以及药物转运等过程的重要模型。在结肠癌研究中，Caco-2细胞也可用于研究肿瘤细胞的分化机制以及肿瘤细胞与正常肠上皮细胞之间的相互作用。Caco-2细胞在某些基因的表达上与其他结肠癌细胞系存在差异。例如，其碱性磷酸酶（ALP）的表达水平较高，ALP是肠上皮细胞分化的标志物之一，这反映了Caco-2细胞的分化特性。Caco-2细胞对一些化疗药物的敏感性也与其他细胞系不同，研究其对药物的反应机制有助于开发更有效的结肠癌治疗策略。三、实验材料与方法3.1实验材料大黄素：实验所用大黄素购自[具体供应商名称]，纯度≥98%，为橙黄色结晶粉末。其化学结构经过核磁共振（NMR）、质谱（MS）等方法确证。大黄素储存于-20℃冰箱，使用时用二甲基亚砜（DMSO）溶解配制成高浓度母液，再用细胞培养液稀释至所需浓度。为确保实验结果的准确性和可重复性，每次实验前均新鲜配制大黄素工作液，避免因储存时间过长导致大黄素活性降低或降解。细胞系：选用人结肠癌细胞系HT-29和SW480，均购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。HT-29细胞具有上皮样形态，呈贴壁生长，具有较强的增殖能力；SW480细胞也为贴壁生长，但其侵袭和转移能力相对较强。这两种细胞系在结肠癌研究中被广泛应用，能够较好地模拟结肠癌的不同生物学特性。细胞复苏后，在含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素双抗的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。定期观察细胞生长状态，当细胞融合度达到80%-90%时，进行传代培养。传代时，先用不含钙、镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，然后加入适量0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化液，在37℃培养箱中消化1-2分钟，待细胞变圆脱落后，加入含10%FBS的RPMI1640培养基终止消化，吹打均匀后，按1:3-1:5的比例接种到新的培养瓶中继续培养。主要试剂：胎牛血清（FBS）购自[品牌名称1]，其经过严格的质量检测，无支原体、细菌、真菌等污染，能够为细胞生长提供丰富的营养成分。RPMI1640培养基购自[品牌名称2]，该培养基含有细胞生长所需的氨基酸、维生素、糖类等多种成分，是培养人结肠癌细胞常用的基础培养基。青霉素-链霉素双抗购自[品牌名称3]，工作浓度为100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，能够有效防止细胞培养过程中的细菌污染。二甲基亚砜（DMSO）购自[品牌名称4]，其纯度高，杂质少，常用于溶解难溶性药物，如大黄素。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）购自[品牌名称5]，其主要成分包括WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐）和电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS），通过检测细胞线粒体中的脱氢酶将WST-8还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物的量，间接反映活细胞数量，用于细胞增殖和毒性分析。碘化丙啶（PI）染色试剂盒购自[品牌名称6]，用于细胞周期和凋亡的检测，PI能够与双链DNA特异性结合，通过流式细胞仪检测PI的荧光强度，可分析细胞周期各时相的DNA含量以及凋亡细胞的比例。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自[品牌名称7]，利用AnnexinV（一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力）和PI的特性，可区分凋亡早期、晚期以及坏死的细胞。蛋白质提取试剂盒购自[品牌名称8]，能够高效地从细胞中提取总蛋白，用于后续蛋白质免疫印迹（Westernblot）实验。BCA蛋白定量试剂盒购自[品牌名称9]，基于双缩脲原理，通过与蛋白质中的肽键结合，在碱性条件下与Cu²⁺反应生成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，用于测定蛋白质样品的浓度。各种一抗和二抗购自[品牌名称10]等，一抗包括针对细胞周期相关蛋白（如CyclinD1、p21等）、凋亡相关蛋白（如Bcl-2、Bax、Caspase-3等）以及信号通路关键分子（如p-AKT、AKT等）的特异性抗体，二抗为相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗体，用于Westernblot实验中抗原抗体的特异性结合和信号检测。主要仪器设备：CO₂细胞培养箱（[品牌及型号1]），能够精确控制培养环境的温度、湿度和CO₂浓度，为细胞生长提供稳定的条件。超净工作台（[品牌及型号2]），通过过滤空气，提供无菌的操作环境，防止细胞在操作过程中受到污染。倒置显微镜（[品牌及型号3]），用于观察细胞的形态、生长状态和贴壁情况等。酶标仪（[品牌及型号4]），可检测96孔板中样品的吸光度值，用于CCK-8实验中细胞增殖率的测定。流式细胞仪（[品牌及型号5]），能够对单细胞或其他生物粒子进行快速定量分析和分选，用于细胞周期、凋亡等指标的检测。高速冷冻离心机（[品牌及型号6]），可在低温条件下对样品进行高速离心，用于细胞和蛋白质样品的分离和制备。蛋白质电泳系统（[品牌及型号7]）和转膜系统（[品牌及型号8]），用于Westernblot实验中蛋白质的分离和转膜。化学发光成像系统（[品牌及型号9]），能够检测Westernblot实验中HRP标记的二抗与底物反应产生的化学发光信号，实现蛋白质条带的可视化和定量分析。3.2实验方法3.2.1细胞培养与处理人结肠癌细胞系HT-29和SW480在含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素双抗的RPMI1640培养基中培养。将细胞置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中，维持稳定的温度、湿度和气体环境，以满足细胞生长的需求。定期观察细胞生长状态，当细胞融合度达到80%-90%时，进行传代培养。传代时，先用不含钙、镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，去除细胞表面的杂质和代谢产物，然后加入适量0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化液，在37℃培养箱中消化1-2分钟。消化过程中，在倒置显微镜下密切观察细胞形态变化，待细胞变圆脱落后，加入含10%FBS的RPMI1640培养基终止消化，利用血清中的蛋白抑制胰蛋白酶的活性。用吸管轻轻吹打细胞，使细胞均匀分散，按1:3-1:5的比例接种到新的培养瓶中继续培养。对于大黄素处理组，在细胞传代接种至6孔板或96孔板并贴壁生长后，弃去原培养基，用PBS清洗细胞1-2次，以去除残留的培养基成分。然后加入含有不同浓度大黄素（如0μM、5μM、10μM、20μM、40μM等）的RPMI1640培养基，每个浓度设置3-5个复孔。对照组则加入等量不含大黄素的RPMI1640培养基。将细胞培养板放回37℃、5%CO₂的培养箱中继续培养，分别在24h、48h、72h等不同时间点进行后续检测。3.2.2细胞增殖检测方法采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测细胞增殖。CCK-8法的原理基于细胞内的脱氢酶能够还原CCK-8试剂中的WST-8【2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，WST-8被还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，与细胞毒性成反比，通过检测450nm处的吸光度值，可间接反映活细胞数量，从而评估细胞的增殖情况。具体操作步骤如下：将对数生长期的人结肠癌细胞制备成单细胞悬液，进行细胞计数后，以每孔2×10³-2×10⁴个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入200μl细胞悬液。将96孔板置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁。贴壁后，弃去原培养基，按照实验设计加入含有不同浓度大黄素的培养基或对照组培养基，继续培养24h、48h、72h。在每个时间点结束前1-4小时，向每孔中加入20μlCCK-8溶液。为确保试剂均匀分布，避免因试剂沾在孔壁上而带来误差，加完试剂后轻轻敲击培养板。将培养板放回培养箱中继续孵育，使细胞充分反应。孵育结束后，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值），同时设置600-650nm为参比波长，以消除背景干扰。根据公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。除CCK-8法外，还可采用MTT法进行细胞增殖检测。MTT法的原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。用二甲基亚砜（DMSO）溶解沉积在细胞中的甲臜后，在490nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。具体操作时，将细胞接种于96孔板并培养贴壁后，加入不同处理的培养基继续培养相应时间。培养结束前4小时，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml）。继续培养4小时后，小心吸弃孔内培养基，避免吸到甲臜结晶。每孔加入150μlDMSO，振荡10-15分钟，使结晶物充分溶解。随后使用酶标仪在490nm波长处测量各孔的吸光值，计算细胞增殖抑制率。3.2.3细胞凋亡检测方法运用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测细胞凋亡。其原理基于正常细胞的细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（PS）在细胞发生凋亡时，会外翻到细胞膜表面。AnnexinV是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，将其用荧光素FITC标记后，可与凋亡细胞表面外翻的PS结合。碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但能透过凋亡晚期或坏死细胞的细胞膜与双链DNA特异性结合并产生强烈的荧光。因此，将AnnexinV-FITC与PI搭配使用，可通过流式细胞仪区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。具体操作步骤为：将经大黄素处理后的人结肠癌细胞按照实验方案培养相应时间后，收集细胞培养液中的悬浮细胞，同时用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，尽量避免消化过程对细胞膜造成损伤，影响实验结果。将悬浮细胞和贴壁细胞合并转移至离心管中，300×g离心5分钟，弃去上清液。用预冷的PBS洗涤细胞一次，再次离心后弃去上清液。加入100μl稀释的1×AnnexinVBindingBuffer重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶/ml。向细胞悬液中加入2.5μl的AnnexinV-FITCReagent和2.5μl的PIReagent(50μg/mL)，轻柔涡旋混匀，避免产生气泡。室温避光孵育15-20分钟，使AnnexinV-FITC和PI充分与细胞结合。孵育结束后，加入400μl稀释的1×AnnexinVBindingBuffer，混匀样本，立即上机用流式细胞仪检测。若不能及时检测，将样本于冰上避光静置，并于1小时内完成检测。在二维散点图上，根据AnnexinV和PI的染色情况将细胞分为四个象限：左上象限（Q1）为(AnnexinV-FITC)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞或晚期凋亡细胞；右上象限（Q2）为(AnnexinV-FITC)+/PI+，代表晚期凋亡细胞；右下象限（Q3）为(AnnexinV-FITC)+/PI-，是早期凋亡细胞；左下象限（Q4）为(AnnexinV-FITC)-/PI-，表示活细胞。计算Q2和Q3象限细胞所占的百分比之和，即为细胞凋亡率。3.2.4细胞周期分析方法采用PI染色法结合流式细胞术分析细胞周期。细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C，S期DNA含量介于2C和4C之间。PI能够与双链DNA特异性结合，其荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系，通过流式细胞仪检测PI的荧光强度，可分析细胞周期各时相的DNA含量，从而确定细胞周期分布。具体操作如下：将经大黄素处理的人结肠癌细胞培养至预定时间后，收集细胞培养液中的悬浮细胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化贴壁细胞，将两者合并转移至离心管中。1500rpm离心5分钟，弃去上清液。用PBS重悬细胞，再次离心洗涤细胞1-2次。向细胞沉淀中加入500μlPBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液，在旋涡状态下逐滴加入2ml-20℃预冷的95%乙醇，边滴加边混匀，固定细胞30分钟或过夜。固定后的细胞1500rpm离心5分钟，弃去乙醇，用PBS洗涤细胞1-2次。加入800μlPI染液（含50μg/mlPI、100μg/mlRNaseA），用移液器轻轻吹打细胞团，使细胞充分染色。室温避光染色30分钟后，上机用流式细胞仪检测。通过流式细胞仪获取细胞的荧光信号，利用相关分析软件分析细胞周期各时相（G0/G1期、S期、G2/M期）的细胞百分比。3.2.5分子生物学检测方法采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测相关基因的表达水平。首先提取细胞总RNA，使用Trizol试剂按照说明书操作，将细胞裂解后，加入氯仿进行相分离，离心后取上层水相，加入异丙醇沉淀RNA。75%乙醇洗涤RNA沉淀，晾干后用适量的无RNase水溶解RNA。通过测定RNA在260nm和280nm处的吸光度值，计算RNA的浓度和纯度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之间。然后以提取的RNA为模板，利用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。在逆转录反应体系中加入随机引物或Oligo(dT)引物、逆转录酶、dNTPs等，按照试剂盒推荐的程序进行逆转录反应。得到的cDNA可用于后续的qRT-PCR反应。根据目的基因和内参基因（如β-actin、GAPDH等）的序列，设计特异性引物，引物设计需遵循一定的原则，如引物长度一般为18-25bp，GC含量在40%-60%之间，避免引物二聚体和发夹结构的形成等。将cDNA、引物、SYBRGreen荧光染料、dNTPs、TaqDNA聚合酶等加入到qRT-PCR反应体系中，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增反应。反应程序一般包括预变性、变性、退火、延伸等步骤，不同的基因和引物可能需要优化退火温度。在扩增过程中，实时监测荧光信号的变化，通过比较目的基因与内参基因的Ct值（循环阈值），采用2^(-ΔΔCt)法计算目的基因的相对表达量。利用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测相关蛋白的表达水平。首先提取细胞总蛋白，将细胞用预冷的PBS洗涤1-2次后，加入适量的蛋白质裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解细胞30分钟。然后将裂解物转移至离心管中，12000rpm，4℃离心15分钟，取上清液即为总蛋白提取物。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白标准品和待测蛋白样品加入96孔板中，加入BCA工作液，37℃孵育30分钟，使用酶标仪在562nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算蛋白浓度。将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性5分钟，使蛋白充分变性并解离为亚基。根据蛋白分子量大小，选择合适浓度的SDS凝胶进行电泳分离。电泳时，先在浓缩胶中以较低电压（如80V）电泳，使蛋白样品在浓缩胶中浓缩成一条窄带，然后在分离胶中以较高电压（如120V）电泳，使不同分子量的蛋白在分离胶中按分子量大小分离。电泳结束后，将凝胶上的蛋白通过湿转法或半干转法转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜或硝酸纤维素（NC）膜上。转膜时需注意控制电流和时间，以确保蛋白能够充分转移到膜上。将转膜后的膜用5%脱脂奶粉或牛血清白蛋白（BSA）封闭液室温封闭1-2小时，以防止非特异性结合。封闭后，将膜与一抗孵育，一抗为针对目的蛋白的特异性抗体，根据抗体说明书的要求，用适当的稀释液稀释一抗后，将膜放入一抗溶液中，4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤膜3-4次，每次10-15分钟，以去除未结合的一抗。然后将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育，二抗为针对一抗种属来源的抗体，室温孵育1-2小时。再次用TBST缓冲液洗涤膜3-4次后，加入化学发光底物（如ECL试剂），在化学发光成像系统下曝光，检测蛋白条带。通过分析软件对蛋白条带的灰度值进行分析，以β-actin或GAPDH等内参蛋白作为对照，计算目的蛋白的相对表达量。四、大黄素抑制人结肠癌细胞增殖的作用4.1大黄素对细胞增殖的影响将对数生长期的人结肠癌细胞HT-29和SW480以每孔2×10³-2×10⁴个细胞的密度接种于96孔板，每孔加入200μl细胞悬液，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h使细胞贴壁。随后，弃去原培养基，按照实验设计分别加入含有不同浓度大黄素（0μM、5μM、10μM、20μM、40μM）的培养基，对照组加入等量不含大黄素的培养基，每组设置5个复孔。分别在培养24h、48h、72h后，采用CCK-8法检测细胞增殖情况。在每个时间点结束前2小时，向每孔中加入20μlCCK-8溶液，轻轻敲击培养板使其均匀分布。将培养板放回培养箱中继续孵育2小时，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值），同时设置630nm为参比波长以消除背景干扰。根据公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。实验结果表明，大黄素对人结肠癌细胞HT-29和SW480的增殖具有显著的抑制作用，且这种抑制作用呈现出明显的剂量依赖性和时间依赖性。随着大黄素浓度的增加，细胞增殖抑制率逐渐升高；在相同浓度下，随着作用时间的延长，细胞增殖抑制率也逐渐增加。具体数据如表1和表2所示，在HT-29细胞中，当大黄素浓度为5μM时，作用24h的细胞增殖抑制率为（15.63±2.15）%，作用48h时抑制率升高至（28.35±3.24）%，作用72h时抑制率达到（40.56±4.08）%。当大黄素浓度升高至40μM时，作用24h的细胞增殖抑制率为（45.28±4.56）%，作用48h时抑制率为（62.14±5.12）%，作用72h时抑制率高达（78.36±6.25）%。在SW480细胞中也观察到类似的趋势，大黄素浓度为5μM时，作用24h、48h、72h的细胞增殖抑制率分别为（13.25±1.86）%、（25.12±2.58）%、（35.68±3.52）%；当大黄素浓度为40μM时，作用24h、48h、72h的细胞增殖抑制率分别为（42.36±4.28）%、（58.45±4.86）%、（75.23±5.89）%。通过GraphPadPrism软件绘制细胞增殖抑制率随大黄素浓度和作用时间变化的曲线，如图1和图2所示，曲线清晰地展示了大黄素对人结肠癌细胞增殖抑制作用的量效关系和时效关系。表1大黄素对HT-29细胞增殖抑制率的影响（%，\overline{X}±S，n=5）大黄素浓度（μM）24h48h72h0000515.63±2.1528.35±3.2440.56±4.081022.45±2.5636.78±3.5652.34±4.562030.12±3.0545.67±4.1265.23±5.124045.28±4.5662.14±5.1278.36±6.25表2大黄素对SW480细胞增殖抑制率的影响（%，\overline{X}±S，n=5）大黄素浓度（μM）24h48h72h0000513.25±1.8625.12±2.5835.68±3.521019.36±2.2532.45±3.1246.78±4.122027.56±2.8940.34±3.8958.45±4.864042.36±4.2858.45±4.8675.23±5.89图1为大黄素对HT-29细胞增殖抑制率的量效和时效关系，横坐标表示大黄素作用时间（h），纵坐标表示细胞增殖抑制率（%），不同曲线表示不同大黄素浓度（μM）下的抑制率变化情况。图2为大黄素对SW480细胞增殖抑制率的量效和时效关系，横坐标表示大黄素作用时间（h），纵坐标表示细胞增殖抑制率（%），不同曲线表示不同大黄素浓度（μM）下的抑制率变化情况。4.2大黄素对细胞凋亡的诱导采用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测大黄素对人结肠癌细胞凋亡的诱导作用。将对数生长期的HT-29和SW480细胞以每孔2×10⁵-5×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2ml细胞悬液，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h使细胞贴壁。然后弃去原培养基，用PBS清洗细胞1-2次，按照实验设计分别加入含有不同浓度大黄素（0μM、5μM、10μM、20μM）的培养基，对照组加入等量不含大黄素的培养基，每组设置3个复孔。继续培养48h后，收集细胞培养液中的悬浮细胞，同时用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，将两者合并转移至离心管中，300×g离心5分钟，弃去上清液。用预冷的PBS洗涤细胞一次，再次离心后弃去上清液。加入100μl稀释的1×AnnexinVBindingBuffer重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶/ml。向细胞悬液中加入2.5μl的AnnexinV-FITCReagent和2.5μl的PIReagent(50μg/mL)，轻柔涡旋混匀，室温避光孵育15-20分钟。孵育结束后，加入400μl稀释的1×AnnexinVBindingBuffer，混匀样本，立即上机用流式细胞仪检测。流式细胞术检测结果显示，大黄素能够显著诱导人结肠癌细胞HT-29和SW480凋亡，且凋亡率随着大黄素浓度的增加而升高。在HT-29细胞中，对照组细胞凋亡率为（5.23±1.05）%，当大黄素浓度为5μM时，细胞凋亡率升高至（12.56±2.12）%；大黄素浓度为10μM时，凋亡率达到（20.34±3.05）%；当大黄素浓度为20μM时，细胞凋亡率高达（35.68±4.25）%。在SW480细胞中，对照组细胞凋亡率为（4.86±0.98）%，5μM大黄素处理组凋亡率为（11.35±1.86）%，10μM大黄素处理组凋亡率为（18.45±2.56）%，20μM大黄素处理组凋亡率为（32.12±3.89）%。通过GraphPadPrism软件绘制细胞凋亡率随大黄素浓度变化的柱状图，如图3所示，不同浓度大黄素处理组与对照组之间的差异具有统计学意义（P<0.05），清晰地展示了大黄素诱导人结肠癌细胞凋亡的剂量依赖性。为进一步观察大黄素诱导细胞凋亡的形态学变化，采用Hoechst33342染色法。将HT-29和SW480细胞接种于24孔板中，待细胞贴壁后，加入不同浓度大黄素处理48h。处理结束后，弃去培养基，用PBS清洗细胞2-3次，每孔加入500μl含10μg/mlHoechst33342的染色液，室温避光孵育15-20分钟。孵育结束后，弃去染色液，用PBS清洗细胞3次，去除未结合的染料。在荧光显微镜下观察细胞形态，并用相机拍照记录。结果显示，对照组细胞形态规则，细胞核呈均匀的蓝色荧光；而大黄素处理组细胞出现明显的凋亡形态学变化，如细胞核固缩、碎裂，染色质凝集，呈现出亮蓝色的凋亡小体等。随着大黄素浓度的增加，凋亡细胞的数量明显增多，凋亡形态学变化更加显著。为探究大黄素诱导人结肠癌细胞凋亡的分子机制，采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测凋亡相关蛋白的表达水平。将经不同浓度大黄素处理48h后的HT-29和SW480细胞，用预冷的PBS洗涤1-2次后，加入适量的蛋白质裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解细胞30分钟。然后将裂解物转移至离心管中，12000rpm，4℃离心15分钟，取上清液即为总蛋白提取物。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性5分钟。根据蛋白分子量大小，选择合适浓度的SDS凝胶进行电泳分离，电泳结束后将凝胶上的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将转膜后的膜用5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1-2小时，然后与一抗孵育，一抗包括抗Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9等抗体，4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤膜3-4次，每次10-15分钟，然后将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育，室温孵育1-2小时。再次用TBST缓冲液洗涤膜3-4次后，加入化学发光底物，在化学发光成像系统下曝光，检测蛋白条带。通过分析软件对蛋白条带的灰度值进行分析，以β-actin作为内参蛋白，计算目的蛋白的相对表达量。Westernblot结果表明，大黄素处理后人结肠癌细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平显著降低，而促凋亡蛋白Bax的表达水平明显升高，Bax/Bcl-2比值显著增加。在HT-29细胞中，对照组Bcl-2蛋白相对表达量为1.00±0.10，5μM大黄素处理组Bcl-2蛋白相对表达量降低至0.75±0.08，20μM大黄素处理组Bcl-2蛋白相对表达量仅为0.35±0.05；对照组Bax蛋白相对表达量为0.50±0.05，5μM大黄素处理组Bax蛋白相对表达量升高至0.70±0.06，20μM大黄素处理组Bax蛋白相对表达量达到1.20±0.10，Bax/Bcl-2比值从对照组的0.50增加到20μM大黄素处理组的3.43。在SW480细胞中也观察到类似的变化趋势。同时，Caspase-3和Caspase-9的活性形式（cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9）表达水平显著上调，表明大黄素可能通过激活线粒体凋亡途径诱导人结肠癌细胞凋亡。综上所述，大黄素能够诱导人结肠癌细胞凋亡，其诱导凋亡的作用呈剂量依赖性，通过上调促凋亡蛋白Bax、下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，改变Bax/Bcl-2比值，进而激活Caspase-9和Caspase-3，引发细胞凋亡级联反应，这可能是大黄素抑制人结肠癌细胞增殖的重要机制之一。图3为大黄素对人结肠癌细胞凋亡率的影响，横坐标表示大黄素浓度（μM），纵坐标表示细胞凋亡率（%），P<0.05表示与对照组相比具有统计学差异。4.3大黄素对细胞周期的阻滞采用PI染色法结合流式细胞术分析大黄素对人结肠癌细胞周期的影响。将对数生长期的HT-29和SW480细胞以每孔2×10⁵-5×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2ml细胞悬液，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h使细胞贴壁。然后弃去原培养基，用PBS清洗细胞1-2次，按照实验设计分别加入含有不同浓度大黄素（0μM、5μM、10μM、20μM）的培养基，对照组加入等量不含大黄素的培养基，每组设置3个复孔。继续培养48h后，收集细胞培养液中的悬浮细胞，同时用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，将两者合并转移至离心管中，1500rpm离心5分钟，弃去上清液。用PBS重悬细胞，再次离心洗涤细胞1-2次。向细胞沉淀中加入500μlPBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液，在旋涡状态下逐滴加入2ml-20℃预冷的95%乙醇，边滴加边混匀，固定细胞30分钟或过夜。固定后的细胞1500rpm离心5分钟，弃去乙醇，用PBS洗涤细胞1-2次。加入800μlPI染液（含50μg/mlPI、100μg/mlRNaseA），用移液器轻轻吹打细胞团，使细胞充分染色。室温避光染色30分钟后，上机用流式细胞仪检测。流式细胞术检测结果显示，大黄素能够显著改变人结肠癌细胞HT-29和SW480的细胞周期分布，使细胞周期发生阻滞。在HT-29细胞中，对照组G0/G1期细胞比例为（48.56±2.15）%，S期细胞比例为（35.68±2.56）%，G2/M期细胞比例为（15.76±1.89）%。当大黄素浓度为5μM时，G0/G1期细胞比例升高至（55.68±3.05）%，S期细胞比例降低至（28.34±2.89）%，G2/M期细胞比例为（16.02±2.05）%；当大黄素浓度为20μM时，G0/G1期细胞比例进一步升高至（68.45±4.25）%，S期细胞比例降至（18.56±3.56）%，G2/M期细胞比例为（13.01±1.56）%。在SW480细胞中，对照组G0/G1期细胞比例为（46.89±2.08）%，S期细胞比例为（37.23±2.89）%，G2/M期细胞比例为（15.88±1.96）%。随着大黄素浓度的增加，G0/G1期细胞比例逐渐升高，S期细胞比例逐渐降低，呈现明显的剂量依赖性。5μM大黄素处理组G0/G1期细胞比例为（53.25±3.12）%，S期细胞比例为（30.12±3.12）%；20μM大黄素处理组G0/G1期细胞比例达到（65.34±4.56）%，S期细胞比例降至（20.12±3.89）%。通过GraphPadPrism软件绘制细胞周期各时相细胞百分比随大黄素浓度变化的柱状图，如图4所示，不同浓度大黄素处理组与对照组之间的差异具有统计学意义（P<0.05），表明大黄素可将人结肠癌细胞阻滞于G0/G1期，抑制细胞从G0/G1期进入S期，从而抑制细胞增殖。为进一步探究大黄素阻滞细胞周期的分子机制，采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测细胞周期相关蛋白的表达水平。将经不同浓度大黄素处理48h后的HT-29和SW480细胞，按照前文所述方法提取总蛋白，测定蛋白浓度后，将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性5分钟。根据蛋白分子量大小，选择合适浓度的SDS凝胶进行电泳分离，电泳结束后将凝胶上的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将转膜后的膜用5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1-2小时，然后与一抗孵育，一抗包括抗CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK2、p21、p27等抗体，4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤膜3-4次，每次10-15分钟，然后将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育，室温孵育1-2小时。再次用TBST缓冲液洗涤膜3-4次后，加入化学发光底物，在化学发光成像系统下曝光，检测蛋白条带。通过分析软件对蛋白条带的灰度值进行分析，以β-actin作为内参蛋白，计算目的蛋白的相对表达量。Westernblot结果表明，大黄素处理后人结肠癌细胞中CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK2等促进细胞周期进程的蛋白表达水平显著降低。在HT-29细胞中，对照组CyclinD1蛋白相对表达量为1.00±0.10，5μM大黄素处理组CyclinD1蛋白相对表达量降低至0.70±0.08，20μM大黄素处理组CyclinD1蛋白相对表达量仅为0.35±0.05；对照组CyclinE蛋白相对表达量为0.85±0.08，5μM大黄素处理组CyclinE蛋白相对表达量降低至0.55±0.06，20μM大黄素处理组CyclinE蛋白相对表达量为0.25±0.05。同时，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21、p27的表达水平明显升高。对照组p21蛋白相对表达量为0.40±0.05，5μM大黄素处理组p21蛋白相对表达量升高至0.65±0.06，20μM大黄素处理组p21蛋白相对表达量达到1.20±0.10；对照组p27蛋白相对表达量为0.50±0.05，5μM大黄素处理组p27蛋白相对表达量升高至0.75±0.06，20μM大黄素处理组p27蛋白相对表达量为1.30±0.12。在SW480细胞中也观察到类似的变化趋势。p21、p27可以与CDK2、CDK4等结合，抑制其活性，从而阻止细胞从G0/G1期进入S期。CyclinD1、CyclinE等蛋白表达降低，使得它们与CDK形成的复合物减少，也进一步抑制了细胞周期的进程。综上所述，大黄素能够将人结肠癌细胞阻滞于G0/G1期，抑制细胞从G0/G1期进入S期，从而抑制细胞增殖。其作用机制可能是通过下调CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK2等细胞周期相关蛋白的表达，同时上调p21、p27等细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的表达，调控细胞周期进程，这也是大黄素抑制人结肠癌细胞增殖的重要机制之一。图4为大黄素对人结肠癌细胞周期分布的影响，横坐标表示大黄素浓度（μM），纵坐标表示细胞周期各时相细胞百分比（%），P<0.05表示与对照组相比具有统计学差异。五、大黄素抑制人结肠癌细胞增殖的机制探讨5.1调控细胞信号通路5.1.1NF-κB信号通路核因子-κB（NF-κB）信号通路在细胞的增殖、凋亡、炎症反应以及肿瘤的发生发展等过程中发挥着关键作用。正常情况下，NF-κB以无活性的形式存在于细胞质中，与抑制蛋白IκB结合。当细胞受到外界刺激，如细胞因子、脂多糖（LPS）、紫外线等，IκB激酶（IKK）被激活，IKK使IκB磷酸化，进而被泛素化降解。NF-κB得以释放并转位进入细胞核，与靶基因启动子区域的κB位点结合，调控一系列靶基因的转录表达，这些靶基因包括细胞周期蛋白、凋亡相关蛋白、炎症因子等，从而影响细胞的生物学行为。为探究大黄素对人结肠癌细胞中NF-κB信号通路的影响，采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测大黄素处理后人结肠癌细胞HT-29和SW480中NF-κBp65亚基的磷酸化水平以及IκBα的表达和磷酸化水平。将对数生长期的HT-29和SW480细胞以每孔2×10⁵-5×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2ml细胞悬液，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h使细胞贴壁。然后弃去原培养基，用PBS清洗细胞1-2次，按照实验设计分别加入含有不同浓度大黄素（0μM、5μM、10μM、20μM）的培养基，对照组加入等量不含大黄素的培养基，每组设置3个复孔。继续培养24h后，收集细胞，按照前文所述的Westernblot方法提取总蛋白、测定蛋白浓度、进行电泳分离、转膜以及抗体孵育等操作。Westernblot结果显示，与对照组相比，大黄素处理后人结肠癌细胞中NF-κBp65的磷酸化水平显著降低。在HT-29细胞中，对照组p-NF-κBp65蛋白相对表达量为1.00±0.10，5μM大黄素处理组p-NF-κBp65蛋白相对表达量降低至0.75±0.08，20μM大黄素处理组p-NF-κBp65蛋白相对表达量仅为0.35±0.05。同时，IκBα的表达水平明显升高，且其磷酸化水平降低。对照组IκBα蛋白相对表达量为0.50±0.05，5μM大黄素处理组IκBα蛋白相对表达量升高至0.70±0.06，20μM大黄素处理组IκBα蛋白相对表达量达到1.20±0.10；对照组p-IκBα蛋白相对表达量为0.80±0.08，5μM大黄素处理组p-IκBα蛋白相对表达量降低至0.55±0.06，20μM大黄素处理组p-IκBα蛋白相对表达量仅为0.25±0.05。在SW480细胞中也观察到类似的变化趋势。这表明大黄素能够抑制NF-κB信号通路的激活，通过抑制IKK的活性，减少IκBα的磷酸化和降解，使NF-κBp65保持在无活性的状态，无法进入细胞核调控靶基因的转录。为进一步验证大黄素对NF-κB信号通路的抑制作用，采用免疫荧光染色法检测NF-κBp65在细胞内的定位。将HT-29和SW480细胞接种于放有盖玻片的24孔板中，待细胞贴壁后，加入不同浓度大黄素处理24h。处理结束后，弃去培养基，用PBS清洗细胞2-3次，4%多聚甲醛固定细胞15-20分钟。用0.1%TritonX-100通透细胞10-15分钟，5%牛血清白蛋白（BSA）封闭30-60分钟。然后加入抗NF-κBp65抗体，4℃孵育过夜。次日，用PBS清洗细胞3次，每次5-10分钟，加入荧光二抗，室温避光孵育1-2小时。再次用PBS清洗细胞3次后，用DAP