《医学科研实践技能》课件-活体成像系统培训

IVIS小动物活体成像系统简介及应用目

录01

成像系统与原理02操作流程03

具体应用

01

PART

成像系统与原理活体光学成像系统--技术核心HUMAN无创性降低成本提升准确度长期连续动态高通量

提升效率分子影像HUMANHEALTHIENVIREMENTAL

HEALTHCurre

odology活体光学成像系统--技术优势HUMANLabeledProkaryoticCellsGeneticReportersSmartProbes是通过一定的方式对

研究对象进行光学标记，

使其具有发光的性质，再通过成像技术及设备对光信号进行采集成像。HUMAN

HEALTHI

ENVIREMENTALHEALTH光学标记

成像技术及设备LabeledEukaryoticCellsLabeledProteins小动物活体光学成像活体光学成像系统HUMAN

主要采用生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence)两种技术。

生物发光是用荧光素酶基因标记细胞或DNA；

荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt等)进行标记。

利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。荧光分子十激发光Bioluminescence荧光蛋白荧光探针

荧光染料荧光素酶荧光素酶十底物CARAd5encoding

luciferaseHUMAN

HEALTHIENVIREMENTALHEALTHlp:Substrate活体光学成像系统--标记方式HUMANHUMAN成像模式选择-生物发光VS荧光荧光成像背景信号强度～9.5×10³p/s光信号强度～7.1×107p/s信噪比～7500背景信号强度～1.0×10⁹p/s-光信号强度～7.8×10⁹p/s

-信噪比～7.83×106

PC3M-luc/DsRed

cells

injected

s.c.荧光成像灵敏度通常比生物发光成像低1000倍生物发光：灵敏度

荧光成像：信噪比T.L.Troy,et

al.(2004).Molecular

Imaging3:9-23.生物发光成像HUMAN成像模式选择-生物发光VS荧光荧光素酶：

载体构建

稳转细胞系

转基因动物

荧光素酶底物：

成像设备：选择萤光素酶种类

载体构建

建立稳定细胞系

细胞注射动物

注射底物

成像仪成像o

IVIS

Lumina

ⅢIo

IMIS

Lumina

S5

&X5o

IVIS

Spectrumo

IVISSpectrum

CT

cellsof

intereststablytransfect

withluciferaseconstructo

D-Lucuferino

Coelenterazine

ho

Inflammation

Probeo

………o

Firefly

Luciferaseo

Renilla

Luciferaseo

NanoLuc

LuciferaseInjectLuciferaseSubstrates生物发光活体成像试验流程HUMANHUMAN三种常用荧光素酶差异o

Firefly

Luciferase萤火虫荧光素酶发射波长560nm,体内会红移至610nm,

组织穿透性更好，适用于动物内脏等较深部位的组织成像；o

Renilla

Luciferase海肾荧光素酶发射波长480nm,产生的蓝光组织穿透能力较弱，适用于动物浅表组织成像；o

NanoLuc

Luciferase海虾荧光素酶发射波长460nm,自然界提取光型号强度较弱，但有改良版本，适用于病毒等对报告基因片段大小有限制的标记场景。

Renilla….NanoLuc

FireflyHemoglobinμ₂(cm¹)Wavelength(nm)细胞生物发光效率测试-孔板定量HUMANHUMAN生物发光底物注射底

物

注

射

后10~20min

进入成像平台期2h后信号消失底物注射后约2min

进入信号峰值强度数倍于腹腔注射

约30min

信号消失底物剂量：150mg

D-Luciferin/kg鼠体重对每个生物发光实验动物模型，首先需测一条生物发光动力学曲线，得出最适成像时间点····

·尾静脉注射腹腔注射·依据上述曲线选取最佳成像时间点。·一般情况下，大多数实验模型的最佳成像时间点位于荧光素腹腔注射后10-20分钟。1.

注射荧光素酶底物(建议在动物清醒时注射);2.

3min后，麻醉动物(建议使用气体麻醉);3.

将麻醉后的动物放入成像仓中，在荧光素注射后约5min

时刻拍摄第一张图片；4.

之后每2min

拍一张，持续拍摄60min,得到一条针对该实验模型的荧光素动力学曲线。原位和异位种植的Brain

tumor

的生物发光荧光素动力学曲线ROI

Flux(%)HUMAN生物发光动力学曲线HUMAN荧光-波长选择（透过率和背景噪音）l=550nm[=610nm[=740nm[=840nmTissue

Autofluorescencehttp://www.drbio.cornell.edu300400500600700800errission

wavelength(nm)SNR=Signal/AutofluorescenceAlfalfa

Free

Rodent

FoodRegular

Foodexcitatiormuiltiphotonl=740nm1TPa1emine印

鸟

5TryptophanNADH,ElastinIipofuscinIrdolamineIndolaminescollagensFibrillinFlavinsdimers

Wavelength(nM)血红蛋白和其他机体组分强烈吸收可见光。在近红外区域，组织吸收显著降低。Absorptioncoefficient

(cm--)

logscaleHUMAN荧光成像小鼠剃毛--降低光吸收Compromisedlocalzation

andquantifcation

offluorescenceDepilationrequiredNormal,haired

mouse

strains

BALB/c,C57BL/6etc...Depilation

not

requiredNudemiceSKH1-E剃毛作用：降低毛发光吸收和光散射；去除来自毛发的背景荧光实验前一天剃毛

HUMAN生物发光成像小鼠剃毛--降低光吸收HUMAN小鼠剃毛方法·

c

使用剃毛器后的效果，基于剃毛刀头的设计，有约1

mm

的体表绒毛无法剃除；·d

使用脱毛膏，可以将剩下的体表绒毛干净地去除，用完脱毛膏后用纱布蘸温水檫拭小鼠，避免脱毛膏的自发荧光干扰。·a

剃毛前，体重16

g

(约4

week)Ballb/c雄性小鼠；·b

使用PerkinEImer剃毛器对小鼠进行剃毛；

02

PART

操作流程HUMAN小动物活体成像系统结构组成HUMAN图像获取前期设置与机器降温仪器需要进行自检初始化HUMAN图像获取前期设置与机器预热正在自动进行自检初始化自检通过表示仪器正常并为工作状态HUMAN图像获取自动保存位置设置HUMAN生物发光图像获取HUMAN荧光图像获取（长波长荧光探针）HUMAN光谱分离技术不同探针信号光谱背景光分离结果

小动物活体荧光成像的一种关键技术，为了将探针信号与背景信号或不同探针信号区分开，实现对目标信号的观测和定量分析。通过多光谱扫描成像获取不同信号的光谱特征并利用分析算法对不同信号的光谱进行分离而实现。HUMAN荧光图像获取（光谱分离功能）HUMAN图像处理-自适应荧光背景扣除非特异性的光以一定角度从成像台反射并通过滤光片漏光。HUMAN图像处理-图片加载成组将图片设置为统一标尺HUMAN图像处理-定量分析图像调节亮度对比度透明度阈值调节标尺图像保存HUMAN图像处理-定量分析（生物发光）HUMAN图像处理-定量分析（生物发光）生物发光标准统一单位平均信号强度HUMAN图像处理-定量分析（荧光）荧光成像标准统一单位平均发光效率荧光成像标准统一单位

03

PART

具体应用HUMAN应用概述监测疾病的发生发展及治疗o

癌症o

免疫性疾病o

感染性疾病o

代谢性疾病o

心血管疾病o

神经疾病监测细胞动态变化o

干细胞o

免疫细胞o

存活o

分布o

迁移o

靶向o

基因与疾病关系o

疾病信号通路o

细胞因子作用14探究疾病分子机制HUMANPhotons/sec101110101091081071061051048006004002000With

Bioware

Ultra

one

can

start

collecting

datafrom

Day0,while

with

caliper

measurementsone

has

to

wait

at

least

28

days

to

see

anytumorgrowth合理评价肿瘤的生长状态——“看的早”高灵敏度：可监测微量肿瘤

细胞和转移位点Day0Day7Day

14Day21Day28Day35Day420

6

12

18

24

30

3642Days

postcell

implantBioware

Ultra:4T1-luc2TumorvolumeTumorvolumemm3Photons/sec5

cells肿瘤相关应用HUMAN肿瘤相关应用合理评价肿瘤的生长状态——“看的准”Physicalmeasurement

(tumor

still

getting

bigger)Bio-photonic

imaging

(tumorcells

being

killed)瘤体虽然在变大，但实际内部已经凋亡坏死Mendeletal2003HUMAN抗肿瘤药物评价Orthotopic

XenograftModel

ofLiver

Tumor(BLI)对入组进行实验的造模动物进行肿瘤大小的筛查，剔除偏离均值过多的实验对象46MICE为实验分组提供合理依据HUMAN抗肿瘤药物评价40MICECtrlLowMediumHighPositiveRandomizedGrouping为实验分组提供合理依据HUMAN抗肿瘤药物评价为实验分组提供合理依据39

MICECtrlLowMediumHighPositiveAfterTreatmentHUMAN光谱分离的应用hGem(1/110)hCdt(1/100)M

G2

G1Cell

cyclemiRFP670v1

miRFP709活体FUCCI监测细胞周期

ExNATURE

COMMUNICATIONS,20167:12405Ratio

(miRFP670v1

channel)(miRFP70gchannel)去除组织背景荧光多标记荧光的拆分Shcherbakova

a