《医学科研实践技能》课件-微量热泳动分子互作仪MST培训

微

量

热

泳

动

分

子

互

作仪MicroscaleThermophoresis,

MST目

录0 微量热泳动技术原理02 实验流程及软件应用实验问题和优化方案应用案例分享01PART微量热泳动技术原理

微量热泳动技术原理 HUMANMST术语TARGET

→

荧光分子LIGAND

→

不激发荧光分子，配体

微量热泳动技术原理 HUMAN工作原理红外激光荧光激发毛细管检测器逐个扫描荧光分子结合初始荧光 红外激光开启红外激光关闭MST

trace

微量热泳动技术原理 HUMANMST

信号变化来源于热泳动和温度依赖的荧光强度变化热泳动（Thermophoresis）分子在温度梯度内的定向运动会改变荧光分子的浓度；荧光浓度变化的程度取决于分子的整体性质，例如大小，水化层和电荷温度依赖的荧光强度变化（TRIC）荧光强度与温度有关荧光强度与荧光团的化学环境密切相关TemperatureTemperature

微量热泳动技术原理 HUMANunboundbound由MST结合曲线得出平衡解离常数KdF0 F1FitKdRelative

fluorescenceKd越小，亲和力越强02PART实验流程及软件应用

实验流程及软件使用 HUMANMST实验流程1.

蛋白质控 2.

Target制备3.

Pretest4.

亲和力检测5.

数据分析

实验流程及软件使用 HUMANMST实验流程

实验流程及软件使用 HUMAN样品生物活性

实验流程及软件使用 HUMAN1.

蛋白质控2.

Target制备3.

Pretest4.

亲和力检测5.

数据分析HUMANNHS

kit:

通过赖氨酸侧链氨基偶联Maleimide

kit:

通过半胱氨酸偶联tris-NTAkit:

His-tag特异性标记表达融合蛋白(i.e.

GFP)

实验流程及软件使用 Target制备——选择标记方式SNAP-tagkit:SNAP

tag特异性标记NanoTemper蛋白标记试剂盒专为MST实验优化直接合成荧光样品(核酸、多肽…)Cy5

实验流程及软件使用 HUMAN选择合适的通道 推荐使用红色通道

实验流程及软件使用 HUMAN1.

蛋白质控2.

Target制备3.

Pretest4.

亲和力检测5.

数据分析

实验流程及软件使用 HUMAN确定产生足够荧光强度的Target浓度（应低于预估的Kd值）检查Target是否与毛细管吸附检测Target是否聚集Aggregated

sampleHomogeneous

sampleAdsorptionNo

adsorptionPretest检测器荧光强度Nano200~2000Pico

RED3000-20000

实验流程及软件使用 HUMAN1.

蛋白质控2.

Target制备3.

Pretest4.

亲和力检测5.

数据分析

实验流程及软件使用 HUMANBinding

Check（定性）Targetonly

3根毛细管+Target

&

高浓度ligand分子3根毛细管判断是否有结合结合buffer筛选

实验流程及软件使用 HUMAN1.

Ligand稀释Binding

Affinity（定量）准备20μl

Ligand（浓度为Kd的20~50倍）向其他15个PCR管中各加入10μl

Buffer依次完成梯度稀释，最后一管弃去10μl

实验流程及软件使用 HUMAN2.

加入Target准备200μl

Target（浓度<Kd，通常20~100nM）向所有PCR管中各加入10μl

Target并混匀使用毛细管吸取样品，上机检测Binding

Affinity厂0 云 M

尸云Bindine:

affinity样品配

实验流程及软件使用 HUMAN1.

蛋白质控2.

Target制备3.

Pretest4.

亲和力检测5.

数据分析HUMAN软件应用MO.Control自动生成实验protocol及时反馈问题并给出优化意见检测完成后可立即查看Kd结果MO.Affinity

Analysis分析Kd数据合并/对比分析导出图片/数据/报告

实验流程及软件使用 03PART实验问题与优化方案

实验问题与优化方案 HUMANPretest---Target浓度荧光值过低荧光值过高Target浓度：低于预估的Kd值+符合仪器荧光范围HUMANPretest---吸附和聚集吸附更换毛细管(Standard→Premium)添加去垢剂(0.05%

Tween

20,

0.1%

PluronicF-127)调整缓冲液成分(pH,salt

concentration...)聚集离心

(10min >15,000

xg,

4℃)，添加去垢剂(0.05%Tween20,0.1%Pluronic

F-127)调整缓冲液成分(pH,

salt

concentration...)检查有机溶剂浓度

(DMSO...)

实验问题与优化方案 HUMAN样品制备中的注意事项Target浓度:

低于预估Kd值；符合仪器荧光要求Ligand最高浓度:

预估Kd值的20-50倍每个样品最终体积:

~20

µL使用小体积离心管进行梯度稀释:

如PCR管或8联排梯度稀释使用的缓冲液中DMSO等组分需保持不变精确移液为关键移液器吹打而非涡旋混匀不要触碰毛细管中心区域

实验问题与优化方案 HUMAN托盘放置

实验问题与优化方案 04PART应用案例分享

应用案例分享 HUMAN蛋白抗体，膜蛋白，受体，酶，纳米抗体小分子片段，离子，纳米颗粒，多核酸DNA,

RNA

，适配体囊泡外泌体，脂质体血小板，细胞病毒颗粒肽，糖类

应用案例分享 HUMAN小分子肿瘤抑制剂开发

应用案例分享 HUMANPan-

RAS肿瘤抑制剂开发RAS家族蛋白与多种癌症发生相关分析KRAS蛋白结构找到三个潜在位点结合计算机模拟分子对接能够同时结合2个或3个位点的化合物得到候选化合物3144

应用案例分享 HUMANPan-

RAS肿瘤抑制剂开发MST和ITC、NMR等方法共同验证了化合物3144和KRAS的结合活性MST技术样品用量少，检测速度快(0.4ug，10min一组Kd）使用MST完成了17对Kd检测Kd=9μM

±1μM

应用案例分享 HUMAN神经退行性疾病的研究——靶向降解蛋白聚集体应用案例分享HUMAN自噬小体绑定化合物——治疗亨廷顿舞蹈症新思路亨廷顿舞蹈症病因：突变型亨廷顿蛋白CAG三核苷酸重复扩增导致蛋白错误折叠而形成聚集物自噬过程中，LC3扩增形成膜结构，并将目标蛋白等降解目标包裹于其中，形成自噬小体，与溶酶体融合后，其中包裹的物质得以降解

应用案例分享 HUMANMST对小分子化合物的结合进行快速表征难点：mHTT（350KDa）与化合物（500Da） 分子量差700倍，SPR实验检测信噪比很低MST基于荧光值变化的互作检测技术，不受分子量所限制，不挑缓冲液，检测蛋白聚集体有显著的优势

应用案例分享 HUMAN中药活性成分验证蛋白免纯化检测

应用案例分享 HUMAN应用案例分享HUMANTRAF2蛋白与LDA结合Pif1蛋白

为阴性对照确认LDA结合位点(免纯化检测)Ligand

[M]TRAF2蛋白不与LDA类似物结合中药小分子抑制结肠癌Wnt/β-catenin通路1、MST实验结果证明:

LDA可直接结合TRAF2,而不与Pif1蛋白

(阴性对照)

结合