基因工程的基本操作程序课件-高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节基因工程的基本操作程序【知识准备】

基因的结构原核基因非编码区非编码区(不编码蛋白质合成)(调控基因的表达)编码区(编码蛋白质的合成)DNA片段基因B基因D基因h1.原核基因的结构真核基因启动子RNA聚合酶识别结合位点驱动基因转录出mRNA终止子(终止转录)外显子(编码蛋白质)内含子(不编码蛋白质)★外显子、内含子交替排列外显子数=内含子数+12.真核基因的结构转录AUG起始密码子终止密码子AUAmRNA启动子：基因上游的非编码区、DNA片段、RNA聚合酶识别和结合位点终止子：基因下游的非编码区、DNA片段、终止转录起始密码子：mRNA上3个相邻碱基、翻译开始并编码氨基酸终止密码子：mRNA上3个相邻碱基、终止翻译概念辨析转录AUG起始密码子终止密码子AUAmRNA真核基因启动子终止子3.原核基因的表达非编码区编码区非编码区5‘3‘3‘5‘启动子终止子5‘3‘mRNA肽链H2NCOOH终止密码子转录翻译边转录边翻译

(无核膜阻隔、无mRNA加工)外显子内含子先转录后翻译

(有核膜阻隔、有mRNA加工)4.真核基因的表达思考：仅考虑运载体，为插入目的基因，最好用何种限制酶切割质粒？启动子终止子标记基因1EcoRⅠ复制原点标记基因2BamHⅠSpeⅠXhoⅠSmaⅠ质粒【从社会中来】转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？转基因抗虫棉(害虫死亡)非转基因抗虫棉(害虫不死亡)第2节基因工程的基本操作程序培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤质粒重组质粒①目的基因的筛选与获取②基因表达载体的构建③将目的基因导入受体细胞④目的基因的检测与鉴定第一步目的基因的筛选与获取在基因工程中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。抗虫棉的抗虫大肠杆菌产人胰岛素调节因子苏云金杆菌Bt基因重组质粒受体细胞植物组织培养Bt抗虫蛋白害虫死亡①②③④苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。这个“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉用到的目的基因----Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因

(生物防治)★目的基因需在体外“改造”----促进其在受体细胞内复制和表达胰岛素基因含内含子，在大肠杆菌中，转录出的mRNA中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出胰岛素。【思考1】从基因组文库中获得的胰岛素基因(含内含子)，若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是_________________________________________________P77【相关信息】

①当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。抗虫棉Bt抗虫蛋白Bt抗虫蛋白分解为多肽多肽与肠上皮细胞受体结合，导致细胞穿孔②Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性。③人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响筛选合适的目的基因①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用测序技术、序列数据库(如GenBank)、序列对比工具(如BLAST)等，找到合适的目的基因测序技术(测定核酸序列)DNA测序仪序列数据库(以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库)序列比对工具把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具获取目的基因的方法1.人工合成目的基因2.通过构建基因文库来获取目的基因基因组DNA限制酶DNA自体插入载体重组载体感染宿主菌基因组文库推测推测化学合成蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因★逆转录法密码子有兼并性，基因不唯一3.用PCR获取和扩增目的基因利用PCR获取和扩增目的基因【基础知识回顾】DNA的复制①时期：②复制方向：③酶：④特点：沿母链3‘5’解旋酶、DNA连接酶、DNA连接酶有间、减Ⅰ前的间边解旋边复制、半保留复制、碱基互补配对①PCR是聚合酶链式反应的缩写它是一项根据②DNA半保留复制的原理③在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件④对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶(体外用高温代替)打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链引物(2种)使DNA聚合酶能够从引物的3‘端开始连接脱氧核苷酸2.DNA复制所需要的基本条件1.概念参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶(体外用高温代替)打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链引物(2种)使DNA聚合酶能够从引物的3‘端开始连接脱氧核苷酸dATP、dGTP、dTTP、dCTP①断裂2个高能磷酸键②作为合成DNA子链的原料③为合成DNA提供能量【相关信息】①真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。

②PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。③体外、耐高温ATP与dATP的区别AAOHH腺苷腺嘌呤核糖核苷酸ADPATP腺苷腺嘌呤脱氧核苷酸dADPdATPOHOH①引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸②用于PCR的引物长度通常为20〜30个核苷酸③细胞外(PCR)一般以DNA单链为引物细胞内通常以RNA单链为引物什么是引物？引物的作用：DNA聚合酶结合引物，才启动复制引物的位置：DNA模板链的3'端DNA聚合酶

不同点场所解旋方式酶引物温度能量子链合成结果相同点原则、方式条件子链延伸方向体外复制主要在细胞核内DNA在高温下解旋解旋酶催化PCR技术DNA复制耐高温的DNA聚合酶DNA聚合酶、解旋酶一般为单链DNA片段一小段RNA需控制温度，在较高温度下进行体内温和条件dNTP提供能量ATP提供能量两条子链都是连续合成一条子链连续合成，另一条不连续合成大量的DNA片段或基因形成整个DNA分子碱基互补配对、半保留复制模板、酶、能量、原料等5’3’(母链3’5’)待扩增的DNA片段5’5’3’3’PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行DNA模板4种脱氧核苷酸AGCTA引物耐高温的DNA聚合酶变性当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链5’5’3’3’变性①_______(需要/不需要)解旋酶②当温度上升到_______以上时，______断裂，双链DNA解聚为两条___________。③当DNA片段中G、C比例越高，变性(解旋)时所需的温度越_____。不需要90℃氢键DNA单链高复性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合5’5’3’3’5’3’5’3’延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。5’5’3’3’3’3’5’5’思考：1.为什么温度要上升至72℃？

2.Taq酶结合在引物的3’还是5’端？72℃是耐高温的DNA聚合酶的最适温度3’端5’5’3’3’5’5’3’3’3’3’5’5’第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。扩增的过程目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3‘端如此重复循环多次

(一般25～30次)

PCR仪变性复性延伸P79【

旁栏思考】

用PCR可以扩增mRNA吗？根据上图回答问题：(1)酶1是___________酶，它以____________为模板合成一条与RNA互补的___________，两条链间的碱基是________的，两条链形成____________________链；(2)核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的________链，使之变成单链DNA；(3)酶2是_____________________酶，它以_______________为模板，合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。mRNA不能直接扩增，需要将它逆转录成DNA再进行扩增酶1酶2逆转录单链RNA单链DNA互补RNA-DNA杂交分子RNA耐高温的DNA聚合单链DNAPCR完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。PCR仪下图2是PCR扩增技术相关过程，回答问题：5’5’3’3’5’5’3’3’3’5’5’①③3’②5’5’3’④5’5’3’3’3’3’5’5’3’②5’5’3’④3’5’①③5’3’3’5’5’3’5’5’3’5’5’3’3’3’3’5’5’3’3’3’5’5’⑤③5’5’3’3’④⑤1.PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？并说明理由。只复制两种引物之间的DNA片段2.在第____轮循环产物中开始出现两条链等长的DNA片段，比例是______三1/43’3’①②5’5’3.PCR中，引物设计是关键。①引物自身不能环化②两种引物间不能配对③目的基因在两引物之间3’5’5’①③3’②5’5’3’④5’5’3’3’5’5’3’3’3’3’①②5’5’5’5’3’3’3’3’5’5’3’②5’5’3’④3’5’①③5’3’3’5’5’3’5’5’3’5’5’3’3’3’3’5’5’3’3’3’5’5’⑤③5’5’3’3’④⑤3.PCR中，引物设计是关键。④要在两种引物的5′端分别加上限制酶的识别序列3’3’5’5’5’5’3’3’引物1引物2限制酶识别序列限制酶识别序列目的基因4.PCR中的数量关系(复制N次)DNA分子数=__________含引物的DNA分子数=__________含引物1的DNA分子数=__________含两种引物的DNA分子数=__________共消耗引物的对数=__________等长DNA分子数=__________5’5’3’3’5’5’3’3’3’5’5’①③3’②5’5’3’④3’3’①②5’5’5’5’3’3’3’3’5’5’3’②5’5’3’④3’5’①③5’3’3’5’5’3’5’5’3’5’5’3’3’3’3’5’5’3’3’3’5’5’⑤③5’5’3’3’④⑤2N2N2N-12N-22N-12N–2NA.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到子链的3′端B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/42.如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列有关叙述错误的是问题：获得了足量的Bt基因后，是否能直接将它导入棉花细胞呢？第二步：基因表达载体的构建(核心环节)获取Bt基因后不能直接将它导入受体细胞，是因为游离的DNA进入受体细胞，一般会________________；即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着____________而进行复制，导致子代细胞中_________________。因此，获取Bt基因后，还需要________________________________，才能使棉花植株获得抗虫特性。直接被分解细胞分裂不含目的基因借助载体将其导入棉花细胞获取了足够量的Bt基因后①下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代

②使Bt基因能够表达和发挥作用，这就需要构建基因表达载体①基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子、终止子等质粒限制酶切割位点启动子终止子标记基因复制原点③有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。②启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNARNA聚合酶RNA聚合酶诱导物诱导物诱导物激活表达诱导物抑制表达启动子终止子标记基因1EcoRⅠ复制原点标记基因2BamHⅠSpeⅠXhoⅠSmaⅠ终止子使转录在所需要的地方停下来它位于基因的下游

一段有特殊序列结构的DNA片段★目的基因应插入______________________________且不能_______。启动子下游和终止子上游之间反向质粒限制酶切割位点启动子终止子标记基因复制原点限制酶①用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。目的基因限制酶切割位点限制酶获得目的基因②在构建抗虫棉的基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口DNA连接酶重组DNA分子③利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成了一个重组DNA分子启动子HindⅢ氯霉素抗性基因四环素素抗性基因PstⅠSmaⅠAluⅠSmaⅠ甲乙目的基因RNA聚合酶移动方向外源DNAPstⅠSmaⅠHindⅢAluⅠ例1：某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列不正确的是A.用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段B.不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因C.构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNAD.导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长例2：多溴联苯醚（分子式C12H5Br4O，简称BDE-47）是一种电子垃圾分解后产生的环境污染物，进入人体会对神经系统、生殖系统等产生毒害。为了提高好氧细菌的降解效率，将GB-2细菌内获取的BDE-47降解基因导入WT-G受体菌，构建成基因工程菌1、2、3，如图是对三种菌相关基因的电泳结果。下列叙述错误的是A.由图可知，工程菌2必为为降解BDE-47能力强的目的菌株B.从GB-2细菌内获取的BDE-47降解基因可通过PCR技术进行扩增C.将含有BDE-47降解基因的重组质粒导入WT-G受体菌时，用Ca2+处理会增大导入率D.若要增加筛选GB-2细菌的可能性，应从多溴联苯醚污染区取样并进行菌体培养例3：某双子叶植物种子胚的颜色受两对等位基因（A/a，B/b）控制，表型有橙、黄、红三种。橙色植株甲与黄色植株乙杂交，F1均为红色，F1自交，F2中红：橙：黄的比例为9：4：3。用A、B、a、b四种基因的特异性引物对甲、乙细胞的DNA进行PCR扩增，并用A基因特异性引物对F2中红色丙、用B基因特异性引物对F2中红色丁的DNA进行PCR扩增作为标准参照。PCR产物电泳结果如图所示。在不考虑变异的情况下，下列叙述错误的是A.条带1、2、3、4对应的基因分别为A、a、B、bB.甲的基因型为AAbb、乙的基因型为aaBBC.F1的基因型为AaBb，丙基因型不可能是AAbbD.F2的橙色个体之间随机传粉，子代的表型均为橙色例4：纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶能使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。科研人员从某菌株中获得了C1酶基因，将其与HT质粒进行连接，构建基因表达载体生产高效C1酶。过程如图所示，已知C1酶基因以B链为转录模板链，下列说法错误的是A.在含有纤维素的固体培养基中加入刚果红，能形成红色复合物，滴加适量C1酶和Cx酶后周围会出现透明圈

B.酶切位点1加上SmaI的识别序列，酶切位点2加上BamHⅠ的识别序列

C.启动子是一段有特殊序列的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的位点

D.基因工程的载体除了质粒外，还可以是噬菌体或动植物病毒启动子BamHⅠSamⅠHT质粒酶切连接A链B链5’3’5’3’酶切位点1酶切位点2C1酶基因例5：

(1)PvuⅠ和EcoRⅠ是两种限制酶，在4my3基因和质粒上均有它们的酶切位点，据图分析，在构建基因表达载体时适合选用的限制酶是________。

(2)质粒是基因工程中常用的运载体，选择质粒作为运载体的意义是____________________________________________________________________________________________________。

质粒A、C不能作为载体的原因是________________________________________________。(Ampr为氨苄青霉素抗性基因，Tetr为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因)

(3)将由4my3基因和质粒B构建的重组质粒用EcoRⅠ进行完全酶切并电泳，会出现____种长度的电泳带。构建基因表达载体时，在载体中会人工构建诱导型启动子，其目的是___________________________________________________________________。用选择培养基筛选时，_____________________________的菌落为导入重组质粒成功的大肠杆菌形成的菌落。PvuⅠ质粒分子上有一至多个限制酶切割位点；携带外源DNA的质粒进入受体细胞随受体DNA同步复制A质粒无标记基因、质粒C用PvuⅠ切割时会破坏复制原点2当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达抗氨苄青霉素，不显蓝色第三步：将目的基因导入受体细胞

1、花粉管通道法花粉花粉管精子卵细胞①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因卵细胞精子花粉管②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。目的基因外源DNA进入受精卵植物组织培养植物细胞常用的方法还有农杆菌转化法。资料卡农杆菌转化法转化是指将目的基因转入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌诱导产生冠瘿瘤实质：将目的基因整合到受体细胞基因组中Ti质粒拟核农杆菌Ti质粒T-DNAtratraRepVir农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的_________(___________________)转移到被侵染的细胞，并且将其___________________________上Ti质粒T-DNATi质粒T-DNA可转移的DNA整合到该细胞的染色体DNA目的基因农杆菌将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。表现出新性状的植株植物组织培养含重组Ti质粒的农杆菌根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别：可将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再筛选目的基因T-DNA目的基因含目的基因的重组Ti质粒T-DNATi质粒导入植物细胞农杆菌入侵植物细胞目的基因第1次拼接第2次拼接第1次导入第2次导入导入动物细胞：显微注射法(受精卵)构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中体外胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物桑葚胚、囊胚T-DNA+目的基因含目的基因的T-DNA重组的腺病毒DNA腺病毒蛋白质导入动物细胞：病毒转入法导大肠杆菌等：

Ca2+法(处于能吸收DNA状态)Ca2+真核基因导入原核细胞，难表达出原蛋白：①原核细胞无去除内含子转录的mRNA的酶②原核细胞无内质网、高尔基体等蛋白质加工系统种类项目

植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法

受体细胞转化过程农杆菌转化法体细胞、受精卵目的基因插入Ti质粒的T-DNA上转入农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞DNA中表达目的基因表达载体提纯取受精卵显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物显微注射法受精卵Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸DNA分子Ca2＋处理法原核细胞例：如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。下列相关说法不正确的是A.图中Ⅰ最好是Ti质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②的方法可以花粉管道法或农杆菌转化法C.图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞再进行植物组织培养D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达第四步：目的基因的检测与鉴定目的基因进入受体细胞后，要稳定维持和表达其遗传特性。不同长度的DNA非转基因生物目的基因被转基因操作过的个体电泳转基因生物PCR是否扩增出目的基因？提取所有DNA一、分子水平检测

(1)受体有无目的基因①提取DNAPCR电泳②DNA分子杂交技术待测DNA目的基因探针荧光(放射性)标记DNA杂交分子待测DNA目的基因探针荧光标记DNA杂交分子待测DNADNA单链有无DNA杂交分子荧光标记目的基因探针一、分子水平检测

(2)目的基因是否转录

①转基因生物的mRNA与目的基因探针杂交目的基因目的基因探针转基因的所有mRNADNA-mRNA杂交分子目的基因探针+逆转录DNA片断②提取mRNA逆转录成DNADNA分子杂交(或电泳)一、分子水平检测

(3)目的基因是否翻译苏云菌杆菌提取Bt毒蛋白抗原提取抗体抗原-抗体反应荧光标记提取蛋白质+

抗体是否抗原-抗体反应二、个体生物学水平鉴定----相应性状转基因生物鉴定方法抗虫植物抗病毒(菌)植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫接种病毒(菌)盐水浇灌喷洒除草剂提取细胞产物培育转基因抗虫棉的四个步骤，其实就反映了基因工程的基本操作程序在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文库来获取目的基因某种生物的基因组切割成许多基因构建重组载体导入受体菌群体形成基因文库将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库导入受体菌群体、形成基因文库基因组文库----含某种生物所有基因部分基因文库----只含某种生物部分基因如cDNA文库某基因的mRNAmRNA加工、拼接cDNA文库不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分我能产人乳大肠杆菌人胰岛素基因超级鼠转基因大豆将目的基因导入受体细胞的方法也不是完全相同的花粉花粉管精子卵细胞植物细胞农杆菌转化法花粉管通道法含重组Ti质粒的农杆菌将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。病毒入侵在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。单细胞、繁殖快、遗传物质少、质粒人胰岛素、生长素1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。

(1)afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。()

(2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。()

(3)只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。()研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。尝试对这个问题作出解释。2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。【实践·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA便向正极泳动。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。目的要求

1.了解PCR和电泳鉴定的基本原理。2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。材料用具4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液琼脂糖、核酸染料PCR仪微量离心管一次性吸液枪头琼脂糖凝胶电泳装置方法步骤1.用微量移液器按照右栏中的配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分10倍浓缩的扩增缓冲液5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28〜33μL1〜5U/μL的TaqDNA聚合酶1〜2U模板DNA1pg〜1μg总体积50μL2.待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在管的底部。3.参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应4.根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%〜1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。5.