2025年临床基因扩增试题及答案

2025年临床基因扩增试题及答案一、单选题（每题1分，共30分。每题只有一个正确答案，错选、多选、未选均不得分）1.在实时荧光PCR中，若使用TaqMan探针，探针5'端标记的荧光基团最常用的是A.FAM  B.ROX  C.TAMRA  D.HEX答案：A解析：FAM（6羧基荧光素）发射峰在518nm左右，与大多数实时PCR仪的检测通道匹配度最高，且荧光强度高、稳定性好，因此成为TaqMan探针5'端报告基团的首选。2.下列哪项不是PCR反应体系中的必需组分A.模板DNA  B.引物  C.dNTPs  D.甘油答案：D解析：甘油可作为增强剂提高扩增效率，但非必需；模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶及缓冲液才是基本组分。3.逆转录PCR（RTPCR）中，若靶基因为高GC含量（>70%）的mRNA，首选的逆转录酶是A.MMLV野生型  B.SuperScriptIV  C.AMV  D.TthDNA聚合酶答案：B解析：SuperScriptIV经工程改造，可在55–60℃下保持活性，有利于打开高GC二级结构，提高全长cDNA合成效率。4.数字PCR（dPCR）中，分区数从20000提高到100000，对检测下限（LOD）的影响是A.LOD升高5倍  B.LOD降低至1/5  C.LOD不变  D.LOD降低至1/√5答案：B解析：dPCR的LOD与分区数N近似成反比，N提高5倍，LOD降至1/5，即可靠检测0.002%的突变频率。5.临床实验室采用内标法进行HBVDNA定量，若内标为质粒且与靶基因无同源序列，可导致的最大风险是A.抑制物干扰无法识别  B.提取效率差异无法校正  C.交叉污染  D.假阴性答案：B解析：非同源内标无法与靶基因共提取，仅能监控扩增过程，不能校正提取效率差异，导致结果偏差。6.下列哪种突变检测技术不依赖PCR扩增A.ARMSPCR  B.Sanger测序  C.高分辨率熔解曲线（HRM）  D.荧光原位杂交（FISH）答案：D解析：FISH利用荧光标记探针与染色体原位杂交，无需PCR步骤，其余三项均以PCR为基础。7.实时PCR标准曲线斜率为–3.42，则扩增效率为A.90%  B.95% C.96% D.100%答案：C解析：效率E=10^(–1/斜率)–1=10^(1/3.42)–1≈0.96，即96%。8.临床检测EGFRT790M突变，灵敏度要求达到0.1%，下列哪种策略最佳A.突变富集PCR+Sanger B.ARMSPCR C.NGS500×覆盖 D.dPCR答案：D解析：dPCR无需标准曲线即可实现绝对定量，灵敏度可低至0.01%，且重复性好，是检测低丰度突变的金标准。9.下列哪项不是避免假阴性的质控措施A.内参基因监控提取 B.无模板对照（NTC） C.阳性对照 D.扩增后产物电泳答案：B解析：NTC用于监控污染，无法提示假阴性；其余三项均可发现提取失败或抑制物导致的假阴性。10.临床实验室进行BCRABL1融合基因定量，采用国际标准（IS）换算，其参照基因是A.ABL1 B.GUSB C.BCR D.GAPDH答案：A解析：WHO2016推荐以ABL1作为内参，建立国际单位（IS）换算，保证室间可比性。11.多重PCR设计时，引物二聚体ΔG值应满足A.<–9kcal/mol B.>–9kcal/mol C.<–5kcal/mol D.>–5kcal/mol答案：B解析：ΔG>–9kcal/mol可显著降低引物二聚体形成概率，保证多重体系稳定。12.下列哪种荧光通道组合最适合四重实时PCRA.FAM/ROX/Cy5/HEX B.FAM/VIC/ROX/Cy5 C.FAM/TAMRA/JOE/Cy5 D.SYBR/FAM/ROX/Cy5答案：B解析：VIC发射峰554nm，与FAM（518nm）及Cy5（667nm）间隔大，通道串扰<0.5%，且ROX作为被动参比，组合最优。13.临床样本中常含肝素，可抑制PCR，其机制是A.螯合Mg²⁺ B.结合DNA聚合酶 C.降解引物 D.氧化dNTPs答案：B解析：肝素带负电荷，可与DNA聚合酶碱性区域结合，阻碍酶与模板结合，导致扩增失败。14.采用磁珠法提取全血DNA，若裂解液中SDS残留过高，对后续PCR的影响是A.促进引物退火 B.抑制Taq活性 C.增加荧光背景 D.无影响答案：B解析：SDS可变性Taq酶，抑制其活性，需通过乙醇洗涤彻底去除。15.下列哪项不是临床基因扩增实验室分区管理原则A.试剂配制与提取分区 B.扩增与产物分析分区 C.样本接收与提取可同区 D.单向流动答案：C解析：样本接收与提取必须分区，防止原始样本污染提取洁净区，违背CLIA与ISO15189要求。16.实时PCR采用SYBRGreenI，熔解曲线出现双峰，最可能原因A.引物特异性高 B.存在非特异扩增 C.ROX浓度低 D.探针降解答案：B解析：SYBRGreenI结合所有双链DNA，非特异产物导致额外熔解峰。17.临床检测HCVRNA，若样本冻融3次，对结果的影响是A.拷贝数升高2倍 B.拷贝数降低0.5log C.无影响 D.拷贝数降低2log答案：B解析：RNA易降解，冻融3次可导致约0.3–0.5log拷贝数下降，需避免反复冻融。18.下列哪种突变可导致PCR扩增失败但测序成功A.引物结合区单碱基缺失 B.编码区同义突变 C.内含子点突变 D.终止密码突变答案：A解析：引物结合区缺失导致引物无法退火，PCR失败；但测序可用其他区域引物，不受影响。19.临床实验室进行NGS建库，若使用PCR富集，需特别关注A.扩增子长度均一性 B.引物5'端修饰 C.碱基平衡 D.以上均是答案：D解析：扩增子不均一导致覆盖度差异；5'修饰影响接头连接；碱基不平衡降低测序质量。20.下列哪项不是数字PCR的优势A.绝对定量 B.高灵敏度 C.依赖标准曲线 D.抗抑制能力强答案：C解析：dPCR无需标准曲线即可绝对定量，是其核心优势之一。21.临床检测SARSCoV2，若ORF1ab与N基因双靶标，ORF1abCt=38，N基因Ct=40，应判读为A.阳性 B.阴性 C.复检 D.不确定答案：C解析：单靶标高Ct需复检排除低载量或污染，依据《WHO2023技术指南》。22.下列哪种酶具有5'→3'外切酶活性A.Pfu B.KOD C.Taq D.Phusion答案：C解析：Taq具有5'→3'外切酶活性，可用于TaqMan探针切割；高保真酶通常无此活性。23.临床检测FLT3ITD突变，若PCR产物电泳出现野生带170bp与突变带190bp，比例1:1，突变负荷为A.10% B.25% C.50% D.无法确定答案：C解析：条带亮度比≈分子数比，1:1提示突变型占50%，即突变负荷50%。24.下列哪项不是临床基因扩增实验室生物安全要求A.负压提取区 B.产物分析区正压 C.紫外照射30min/日 D.人员单向流动答案：B解析：产物区应负压防止扩增子外泄，正压会增加污染风险。25.实时PCR采用一步法RTPCR，逆转录温度50℃，若引物Tm58℃，可能导致A.引物二聚体 B.逆转录效率低 C.RNaseH活性高 D.无影响答案：A解析：50℃下引物可能非特异退火，形成二聚体，需提高RT温度或优化引物。26.临床检测BRCA1大片段缺失，首选方法A.qPCR B.MLPA C.ARMS D.dPCR答案：B解析：MLPA（多重连接探针扩增）可检测外显子级缺失，为金标准。27.下列哪种质粒最适合作为内标A.高拷贝 B.低拷贝 C.线性质粒 D.无启动子答案：A解析：高拷贝质粒易于定量，信号强，便于监控抑制物。28.临床实验室进行PCR抑制物对照，常用策略是A.内参+外源质粒 B.稀释样本 C.加热裂解 D.增加酶量答案：A解析：外源质粒与内参共同监控提取与扩增，可识别抑制物。29.下列哪项不是临床基因扩增报告必备要素A.检测方法 B.灵敏度 C.临床意义解读 D.实验室主任签名答案：D解析：ISO15189要求报告含方法、灵敏度、结果及临床意义，主任签名为管理要求非技术要素。30.实时PCR采用TaqMan探针，若探针3'端标记BHQ1，其作用是A.报告荧光 B.淬灭荧光 C.增强信号 D.延长探针寿命答案：B解析：BHQ1为黑洞淬灭基团，吸收报告基团能量，防止背景信号。二、共用题干单选题（每题1分，共10分。每题只有一个最佳答案）【题干】患者男，55岁，肺腺癌术后，送检组织行EGFR基因突变检测，实验室采用ARMSPCR法，结果如下：19号外显子缺失突变阳性，L858R阴性，T790M阴性。后续给予吉非替尼治疗，3个月后疾病进展，再次活检血浆ctDNA检测。31.若血浆检测T790M突变阳性，最可能机制是A.原发耐药 B.获得性耐药 C.样本污染 D.假阳性答案：B解析：一代TKI治疗后出现T790M为经典获得性耐药，占60%。32.此时首选的检测方法是A.ARMSPCR B.dPCR C.FISH D.IHC答案：B解析：dPCR灵敏度可达0.01%，适合低载量ctDNA检测。33.若dPCR检测T790M突变负荷0.3%，建议治疗方案A.继续吉非替尼 B.换奥希替尼 C.化疗 D.放疗答案：B解析：奥希替尼为三代TKI，靶向T790M，FDA批准用于耐药后治疗。34.若dPCR未检出T790M，下一步应A.重复dPCR B.NGSpanel C.Sanger D.放弃检测答案：B解析：NGS可发现C797S、L792F等罕见耐药突变，指导治疗。35.实验室发现血浆样本溶血，对ARMSPCR的影响是A.假阳性 B.假阴性 C.无影响 D.灵敏度升高答案：B解析：血红蛋白可抑制Taq酶，导致假阴性。三、多选题（每题2分，共20分。每题至少两个正确答案，多选少选均不得分）36.下列哪些措施可降低数字PCR假阳性A.微流控芯片紫外灭菌 B.引物探针HPLC纯化 C.增加模板量至10μg D.设置NTC E.使用UNG酶答案：ABDE解析：模板量过高导致微滴重叠，反而增加假阳性；其余均可降低污染。37.临床基因扩增实验室质量管理体系文件包括A.质量手册 B.程序文件 C.作业指导书 D.记录表格 E.人事档案答案：ABCD解析：人事档案属行政管理，非质量体系文件。38.下列哪些情况需重新验证检测方法A.更换引物厂家 B.更换Taq酶批次 C.更换核酸提取试剂盒 D.更换仪器通道 E.更换报告格式答案：ACD解析：更换关键试剂或仪器需验证性能；仅换批次或格式无需验证。39.实时PCR外标法定量，标准品需满足A.可溯源 B.基质与样本一致 C.浓度梯度覆盖检测范围 D.含内参 E.稳定性验证答案：ABCE解析：外标法无需内参，内参为内标法要求。40.下列哪些属于PCR污染来源A.气溶胶 B.手套 C.移液器 D.试剂 E.紫外灯答案：ABCD解析：紫外灯为去污染手段，非污染源。四、填空题（每空1分，共15分）41.实时PCR扩增效率计算公式为E=10^(–1/斜率)–1，当斜率=–3.32时，效率为________%。答案：100解析：10^(1/3.32)=2，E=1=100%。42.临床检测BCRABL1国际标准值（IS）换算系数为0.8，若实验室测得转录本水平10000copies/μL，则IS值为________。答案：8000解析：IS=实测值×CF=10000×0.8=8000。43.数字PCR中，泊松分布校正公式为________。答案：c=–ln(1–p)/V解析：c为靶分子浓度，p为阳性微滴比例，V为微滴体积。44.逆转录反应中，RNaseH活性可________cDNA第二链合成。答案：促进解析：RNaseH降解RNADNA杂合链，为DNA聚合酶提供模板，促进第二链合成。45.临床基因扩增实验室生物安全柜气流模式为________。答案：垂直层流解析：ClassIIA2型为垂直层流，70%循环30%外排。46.临床报告突变丰度为5%，对应dPCR突变拷贝数为________copes/μL（总模板1000copies/μL）。答案：50解析：1000×5%=50。47.实时PCR采用TaqMan探针，探针Tm应比引物高________℃。答案：8–10解析：保证探针优先退火，提高切割效率。48.临床检测HBVDNA，若内参为βglobin，其单倍体基因组拷贝数为________。答案：2解析：二倍体细胞含2拷贝βglobin基因。49.多重PCR引物设计时，二聚体ΔG应>________kcal/mol。答案：–9解析：>–9kcal/mol可降低二聚体。50.临床基因扩增实验室紫外照射有效波长为________nm。答案：254解析：254nm为UVC，可破坏DNA。五、名词解释（每题3分，共15分）51.扩增效率答案：指每个循环产物量相对于前一周期的增加比例，理想为100%，计算公式E=10^(–1/斜率)–1。52.突变负荷答案：指突变型分子占野生型与突变型分子总数的百分比，反映突变丰度。53.内标答案：与靶基因同步提取扩增的非人序列，用于监控抑制物与提取效率。54.获得性耐药答案：肿瘤经TKI治疗后新出现的耐药突变，如EGFRT790M。55.微滴数字PCR答案：将样本分割成数万微滴，各自独立PCR，终点检测阳性比例，实现绝对定量。六、简答题（每题10分，共30分）56.简述临床基因扩增实验室防止污染的措施。答案：（1）严格分区：试剂配制、样本提取、扩增、产物分析四区独立，负压与正压区分；（2）单向流动：人员、物品、空气单向流动，避免交叉；（3）紫外照射：每日工作后紫外30min，254nm破坏DNA；（4）UNG酶：使用dUTP+UNG，防止既往产物污染；（5）耗材管理：一次性枪头带滤芯，手套随时更换；（6）定期监测：每周擦拭实验台面，用空白对照监控污染；（7）人员培训：考核合格上岗，定期演练污染应急预案。57.比较ARMSPCR与dPCR在EGFRT790M检测中的优缺点。答案：ARMSPCR：优点—成本低、周期短、设备普及；缺点—灵敏度1%，定量能力差，易假阴。dPCR：优点—灵敏度0.01%、绝对定量、抗抑制；缺点—成本高、通量低、操作复杂。临床建议：初治组织用ARMS，耐药ctDNA用dPCR，互为补充。58.叙述实时PCR标准曲线建立步骤及接受标准。答案：步骤：（1）选择标准品：可溯源质粒或线性化DNA，浓度经数字PCR定值；（