核酸合成仪用户手册

核酸合成仪用户手册一、技术原理1.1固相磷酸亚胺化学法核酸合成仪的核心技术基于固相合成原理，采用磷酸亚胺化学法实现寡核苷酸的高效合成。该方法具有合成效率高（单步偶联率可达99%以上）、自动化程度高、产物纯度高等特点，已完全取代传统的磷酸二酯法和磷酸三酯法。合成过程在合成柱内进行，目标核酸链从3'端向5'端延伸，通过循环执行脱保护、活化与偶联、盖帽、氧化四个关键步骤完成序列组装。1.2合成循环四步骤1.2.1脱保护合成起始于共价连接在可控孔度玻璃（CPG）载体上的首个核苷酸，其5'-羟基被二甲氧基三苯甲基（DMT）保护基封闭。通过通入三氯乙酸（TCA）溶液（通常为3%~5%浓度），使DMT基团脱除并释放出橙色DMT阳离子，暴露出活性5'-羟基。该过程可通过光度法实时监测（检测波长495nm），当吸光度达到稳定阈值（通常>0.1AU）时判定反应完成，典型反应时间为60-90秒。1.2.2活化与偶联脱保护完成后，仪器将下一个核苷酸单体（5'-DMT保护的亚磷酰胺单体）与活化剂（常用0.45METT或0.25MDCI乙腈溶液）按1:1比例混合，通过惰性气体（氩气或氮气）压力驱动进入合成柱。活化剂激活单体的3'-磷酸亚胺基团，使其与固相载体上的5'-羟基发生亲核取代反应，形成亚磷酸三酯键。偶联效率直接影响最终产物纯度，标准反应时间为20-30秒，高通量机型可缩短至15秒，通过优化流速（通常0.5-1.5mL/min）确保反应充分。1.2.3盖帽为消除未参与偶联的5'-羟基（约0.5%~1%残留），需进行盖帽处理。盖帽试剂由乙酸酐/吡啶（1:1）和N-甲基咪唑（10%乙腈溶液）组成，通过乙酰化反应使游离羟基永久失活。该步骤可有效抑制缺失碱基副产物的生成，典型处理时间为20秒，分两次交替注入两种试剂以提高封闭效率。1.2.4氧化偶联形成的亚磷酸三酯键不稳定，需通过氧化反应转化为稳定的磷酸三酯键。常用氧化试剂为0.02M碘的四氢呋喃/吡啶/水溶液（体积比7:2:1），反应时间15-20秒。对于硫代磷酸修饰核酸，需使用3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物（Beaucage试剂）替代碘溶液，反应时间延长至60秒。二、设备结构与型号选择2.1核心系统组成2.1.1液路系统采用模块化设计，包含：试剂输送模块：由高精度隔膜泵（流量精度±1%）、电磁阀组（响应时间<5ms）和PEEK材质管路（内径0.25-0.5mm）组成，支持8-28种碱基单体和6-12种辅助试剂的独立输送。合成柱单元：兼容0.1-1000μmol规格的一次性或可重复使用合成柱，柱床体积1-50mL，配备温度控制模块（4-60℃可调）以优化特殊修饰反应效率。检测系统：集成紫外检测器（260nm/495nm双波长）、电导仪和压力传感器（量程0-500psi），实时监测合成效率与系统状态。2.1.2气路系统采用两级调压设计：气源压力：0.4-0.6MPa（推荐使用纯度≥99.99%的氩气）工作压力：单体瓶0.15-0.2MPa，溶剂瓶0.1-0.15MPa配备气体过滤器（0.22μm）和压力传感器，异常压力（超出±0.02MPa）触发自动停机保护。2.1.3控制系统基于PLC或ARM处理器，配备10-15英寸触摸屏，支持：方法编辑（可自定义循环参数、试剂用量、检测阈值）实时监控（压力曲线、DMT脱除值、合成进度）数据存储（≥1000组合成记录，支持CSV格式导出）远程控制（部分机型支持以太网或Wi-Fi连接）2.2主流型号参数对比型号合成规模通道数循环时间修饰能力适用场景DNAchem-450nmol-100μmol44-6分钟DNA/RNA/LNA中通量研究LK-192X2nmol-3μmol1925-7.5分钟DNA/RNA高通量筛选Dr.Oligo768XLc2nmol-100nmol7686.5分钟普通修饰超高通量文库构建DFL-OligoL10μmol-12mmol1-126分钟PS/2'-OMe/LNA小核酸药物研发MerMade-1250nmol-1μmol125分钟DNA/RNA/PNA多序列并行合成选型建议：常规PCR引物合成：选择DNAchem-4或MerMade-12，兼顾成本与灵活性基因芯片探针制备：优先LK-192X或Dr.Oligo系列，满足高通量需求长链修饰核酸（>80nt）：推荐DFL-OligoL或K&AH-32，耦合效率>99.5%工业级生产：选用AKTAoligopilotplus（1μmol-9mmol）或DFL-OligoI（100mmol-1.8mol），符合GMP标准三、操作流程3.1开机前准备3.1.1试剂检查确认亚磷酰胺单体（A/C/G/T/U）纯度≥98%，储存于-20℃，使用前平衡至室温（避免水汽凝结）辅助试剂：乙腈（HPLC级，含水量<0.01%）、TCA（3%inDCM）、活化剂（0.45METT）、盖帽A（乙酸酐/吡啶/乙腈=1:1:8）、盖帽B（10%NMIin乙腈）、氧化剂（0.02MI₂溶液）试剂瓶液位：确保所有试剂充足（至少满足单次合成需求的1.5倍），更换时需记录批号与更换日期3.1.2系统检查气体压力：主压力0.5MPa，工作压力0.15MPa废液桶：确保排空，连接紧密无泄漏合成柱：根据合成规模选择合适规格（如50nmol选用10mgCPG柱），检查柱床是否均匀，无气泡或干涸管路连接：确认所有接头（特别是PEEK卡套）无松动，使用扳手按对角线顺序紧固（扭矩2-3N·m）3.2软件操作步骤3.2.1方法编辑登录系统（管理员账户默认密码：Admin123，建议首次使用后修改）新建方法：依次设置合成类型：DNA/RNA/修饰（如选择RNA需额外设置2'-羟基保护基脱除程序）序列输入：支持FASTA格式导入或手动输入，自动生成反义链（5'→3'方向）合成规模：50nmol/1μmol/10μmol等，系统自动匹配推荐流速（如1μmol对应0.8mL/min）循环参数：脱保护时间（60s）、偶联时间（25s）、盖帽时间（20s×2）、氧化时间（15s）修饰设置：若需引入硫代修饰，在对应碱基位置勾选"PS"，并将氧化剂切换为Beaucage试剂3.2.2系统清洗执行预清洗程序（路径：维护→系统清洗）：清洗溶剂：乙腈流量：1.0mL/min时间：每个通道10分钟观察出口废液，确保无气泡、颗粒或颜色异常（正常为无色透明），同时监测压力曲线（波动应<±5psi）3.2.3合成运行装载合成柱：按通道编号对应放置，旋紧柱帽（避免过紧导致柱床压缩）启动程序：点击"运行"，系统自动执行：初始脱保护（延长至120s，确保起始DMT完全脱除）序列合成（实时显示当前循环数、已合成长度、偶联效率）终点判断（当最后一个碱基偶联完成后，自动执行最终脱保护）过程监控：重点关注DMT脱除值：正常范围0.1-0.5AU，若连续两个循环<0.08AU提示偶联异常柱压：常规合成<200psi，若突然升高（>300psi）可能为管路堵塞试剂余量：低液位报警时需暂停添加，避免空气进入液路3.3合成后处理3.3.1切割与脱保护取下合成柱，放入氨解管中，加入浓氨水（1-2mL/柱）密封后置于55℃烘箱中：DNA：过夜（12-16小时）RNA：8小时（需额外加入1MTEA·3HF脱除2'-保护基）硫代修饰：延长至20小时，确保硫代磷酸酯键稳定3.3.2纯化方法选择反相HPLC：适用于>50nt长链或修饰核酸，柱型C18（5μm，4.6×250mm），流动相A（0.1MTEAA）、B（乙腈），梯度洗脱（5%-40%B，30分钟）PAGE纯化：用于高纯度需求（如结晶用寡核苷酸），15%-20%变性胶（7M尿素），电泳后紫外灯下切胶回收OPC柱：快速纯化短链DNA（<50nt），通过DMT基团特异性吸附，乙腈梯度洗脱，回收率>80%3.3.3产物检测UV定量：260nm处测定吸光度，1OD₂₆₀≈33μg/mLDNA，40μg/mLRNA质谱分析：MALDI-TOF或ESI-MS验证分子量（理论值与实测值偏差应<0.01%）HPLC纯度：主峰面积应>95%，修饰核酸需同时检测修饰峰比例四、设备维护与故障排除4.1日常维护（每日/每周/每月）4.1.1每日检查试剂液位：补充乙腈至刻度线，检查TCA溶液颜色（正常为无色，变黄提示失效）废液处理：清空废液桶，使用2%NaOH溶液冲洗（中和残留TCA）合成柱更换：一次性柱使用后立即更换，可重复柱用乙腈冲洗后保存于4℃4.1.2每周保养管路冲洗：依次用乙腈（10分钟）→甲醇（10分钟）→超纯水（15分钟）冲洗整个液路，防止盐结晶阀门维护：对电磁阀组进行"手动切换"操作（路径：诊断→阀门测试），确保每个阀门响应正常传感器校准：使用标准溶液（0.1AUDMT标准液、1000μS/cm电导标液）校准检测器4.1.3每月深度维护更换过滤芯：包括气源过滤器（0.22μm）、溶剂入口过滤器（1μm）密封圈检查：查看合成柱接口、试剂瓶口的氟橡胶密封圈，若有裂纹或变形立即更换软件更新：通过官网下载最新固件（如DFL-Oligo系列需升级至v3.2.1版本以上支持在线参数修改）4.2常见故障排除故障现象可能原因解决方案偶联效率<98%单体失效/活化剂浓度不足更换单体（确认保质期内），重新配制活化剂（ETT需现配现用）柱压异常升高管路堵塞/合成柱干涸拆卸PEEK管路用10%硝酸冲洗，更换新合成柱（确保柱床湿润）DMT脱除值波动大TCA浓度不稳定/检测池污染重新配制TCA溶液，用甲醇冲洗检测池（路径：维护→检测池清洗）试剂无法输送气体压力不足/电磁阀故障检查气源压力（调至0.5MPa），更换故障电磁阀（参考部件编号：V-01-003）软件报错"通讯失败"数据线松动/PLC程序异常重新插拔以太网电缆，执行"系统重置"（长按设备面板复位键5秒）紧急情况处理：溶剂泄漏：立即按下急停按钮，穿戴防护装备（耐酸碱手套、护目镜），用吸水棉吸附泄漏物，再用10%碳酸钠中和火灾风险：乙腈属于易燃溶剂，若发生燃烧，使用二氧化碳灭火器（禁止用水），同时启动通风系统排爆4.3预防性维护计划为确保设备长期稳定运行，建议制定以下维护计划：每季度：由工程师进行液路密封性检测（使用0.3MPa氮气保压测试）每半年：更换所有蠕动泵管（材质为氟橡胶，老化周期约6个月）每年：进行全面校准（包括流量精度、温度控制、压力传感器），可联系厂家工程师上门服务（如LK-192X保修期内提供免费年度校准）五、安全注意事项5.1化学安全试剂特性：亚磷酰胺单体对湿气敏感，操作时需在通风橱内进行；TCA具有强腐蚀性，接触皮肤立即用大量清水冲洗并涂抹2%碳酸氢钠软膏废弃物处理：含DMT废液需用活性炭吸附后分类存放，硫代试剂废液需单独收集交专业公司处理5.2设备安全接地要求：设备必须连接独立接地（接地电阻<4Ω），防止静电干扰防爆设计：工业级机型（如DFL-OligoP/I）需安装在防爆通风橱内，确保换气次数≥15次/小时电气安全：维修时需断开主电源（确认"Power"指示灯熄灭），电容放电时间≥5分钟5.3操作规范操作人员需经过培训并考核合格，严禁非授权人员操作合成过程中不得打开仪器前门，避免接触运动部件和化学试剂实验记录需完整填写：合成序列、试剂批号、偶联效率、产物纯度等关键信息，保存至少3年六、应用拓展与高级功能6.1特殊修饰合成6.1.1LNA修饰锁核酸（LNA）合成需使用2'-O,4'-C-亚甲基桥接核苷酸单体，注意：偶联时间延长至45秒（LNA单体空间位阻大）脱保护使用80%乙酸（常规DNA用3%TCA）纯化需采用反相HPLC（C18柱，流速0.5mL/min）6.1.2荧光标记在5'端引入Cy3/Cy5标记时：选择氨基修饰单体（如5'-氨基-C6-phosphoramidite）合成完成后进行标记反应（Cy3NHS酯溶于DMSO，摩尔比1:5）标记后需用SEC柱（如Superdex30）去除游离荧光染料6.2高通量合成方案对于Dr.Oligo768XLc等高通量机型，可通过以下方式提升效率：板格式设计：采用2×96孔板布局，每板合成192条序列，支持自动换板并行处理：同时运行3个合成程序（需分配不同通道组）数据管理：使用LIMS系统对接，自动生成合成报告（包含每条序列的OD值、纯度、分子量）6.3长链核酸合成策略合成>100nt的寡核苷酸时，建议：降低合成规模（≤1μmol）以减少杂质积累采用"分步合成-连接"策略：先合成50nt片段，再通过T4DNA连接酶组装优化循环参数：偶联时间延长至60秒，每10个循环增加一次额外盖帽七、附录7.1试剂配制表试剂名称配方组成储存条件有效期脱保护剂3%TCAinDCM（v/v）室温避光1个月活化剂（ETT）0.45M5-乙基硫代-1H-四唑inACN-20℃2周盖帽A乙酸酐:吡啶:ACN=1:1:8（v/v/v）室温2个月氧化剂0.02MI₂inTHF/吡啶/H₂O=7