妊娠期甲状腺功能异常对仔鼠脑海马bcl-2和bax表达的机制研究

妊娠期甲状腺功能异常对仔鼠脑海马bcl-2和bax表达的机制研究一、引言1.1研究背景与意义甲状腺激素对于维持人体正常生理功能至关重要，在胎儿和新生儿的脑发育过程中更是扮演着无可替代的关键角色。在妊娠期，母体与胎儿之间存在着紧密且复杂的甲状腺激素关联。胎儿在发育早期，自身甲状腺功能尚未健全，其生长发育所需的甲状腺激素主要依赖母体供应。直到妊娠中期，胎儿的甲状腺才逐渐开始发挥功能，但仍需母体提供一定量的甲状腺激素以满足其生长需求。因此，妊娠期母体甲状腺功能状态直接关系到胎儿甲状腺激素的供应，进而对胎儿脑发育产生深远影响。近年来，随着人们对孕期健康重视程度的不断提高以及检测技术的日益精准，妊娠期甲状腺疾病的检出率呈显著上升趋势。据相关研究统计，在我国妊娠期妇女中，甲状腺疾病的总体患病率约为15%-20%，其中妊娠期甲减和亚临床甲减较为常见。妊娠期甲减是指妊娠期血清促甲状腺激素（TSH）水平升高，同时游离甲状腺素（FT4）水平降低；亚临床甲减则是指血清TSH水平升高，但FT4水平仍在正常范围。这些疾病不仅对孕妇自身健康构成威胁，如增加妊娠期高血压、糖尿病、贫血等并发症的发生风险，更会对胎儿的生长发育产生严重不良影响。大量研究表明，妊娠期母体甲状腺激素缺乏会导致胎儿脑发育异常，增加后代智力低下、认知障碍、运动发育迟缓等神经系统疾病的发生风险。一项针对妊娠期甲减孕妇后代的长期随访研究发现，这些儿童在智商测试中的得分明显低于正常对照组，且在语言、记忆、注意力等方面存在不同程度的缺陷。另一项对亚临床甲减孕妇后代的研究也显示，其子女在学习能力和行为表现上与正常儿童存在显著差异。然而，目前关于妊娠期甲减和亚临床甲减影响胎儿脑发育的具体分子机制尚未完全明确。海马作为大脑中与学习、记忆、情绪调节等功能密切相关的重要脑区，其发育和功能的正常与否直接关系到个体的认知和行为能力。在胎儿脑发育过程中，海马神经元的增殖、分化、迁移以及突触的形成和重塑等过程均受到甲状腺激素的精细调控。当妊娠期母体甲状腺功能异常时，胎儿海马的发育可能会受到干扰，进而影响其成年后的认知和行为功能。Bcl-2和Bax作为细胞凋亡调控蛋白家族中的重要成员，在海马神经元的存活和凋亡过程中发挥着关键作用。Bcl-2具有抑制细胞凋亡的功能，而Bax则促进细胞凋亡，两者之间的平衡关系对维持细胞的正常存活和功能至关重要。研究表明，甲状腺激素缺乏可能通过影响Bcl-2和Bax的表达，打破两者之间的平衡，从而诱导海马神经元凋亡，影响海马的正常发育和功能。然而，目前关于妊娠期甲减和亚临床甲减对仔鼠脑海马Bcl-2和Bax表达的影响及其机制的研究尚显不足，亟待进一步深入探讨。本研究旨在通过建立妊娠期甲减和亚临床甲减的动物模型，深入探讨这两种疾病对仔鼠脑海马Bcl-2和Bax表达的影响及其潜在机制。这不仅有助于揭示妊娠期甲状腺疾病影响胎儿脑发育的分子生物学机制，为临床早期诊断和干预提供理论依据，还可能为开发针对妊娠期甲状腺疾病相关脑损伤的防治策略提供新的思路和靶点，具有重要的理论意义和临床应用价值。1.2国内外研究现状在国外，对妊娠期甲状腺疾病的研究开展较早，相关研究成果较为丰富。多项研究明确指出，妊娠期甲减会显著增加胎儿早产、流产、低体重儿出生等不良妊娠结局的发生风险。例如，美国学者通过大规模的流行病学调查研究发现，在妊娠期甲减的孕妇中，早产的发生率比甲状腺功能正常的孕妇高出约30%，低体重儿出生的风险增加了近50%。在对胎儿脑发育影响方面，国外研究表明，母体甲状腺激素缺乏会影响胎儿神经元的增殖、迁移和分化，进而导致后代认知和行为功能障碍。一项针对小鼠的实验研究发现，孕期甲状腺功能低下的母鼠所产仔鼠在成年后，空间学习和记忆能力明显低于正常对照组。关于亚临床甲减，国外研究也证实其对胎儿发育存在潜在威胁。有研究报道，妊娠期亚临床甲减孕妇的后代在儿童期的智商评分低于正常对照组，且注意力缺陷多动障碍等行为问题的发生率更高。然而，对于亚临床甲减的诊断标准和治疗时机，目前国际上尚未达成完全一致的意见，不同研究采用的诊断切点和干预策略存在一定差异。在国内，随着对妊娠期甲状腺疾病重视程度的不断提高，相关研究也日益增多。大量临床研究表明，妊娠期甲减和亚临床甲减与不良妊娠结局密切相关。国内学者通过对多中心孕妇数据的分析发现，妊娠期甲减孕妇发生妊娠期高血压、胎盘早剥等并发症的风险显著增加。在胎儿脑发育方面，国内研究也发现，妊娠期甲状腺功能异常会影响胎儿脑发育相关基因的表达，进而影响胎儿的神经发育。尽管国内外在妊娠期甲减和亚临床甲减领域取得了一定的研究成果，但仍存在一些不足之处。一方面，目前对于妊娠期甲减和亚临床甲减影响胎儿脑发育的具体分子机制研究尚不够深入，尤其是在海马区这一与学习记忆密切相关的脑区，关于Bcl-2和Bax等凋亡相关蛋白表达变化及其调控机制的研究还存在许多空白。另一方面，现有的研究大多集中在单一因素的影响，而对于妊娠期甲减和亚临床甲减与其他环境因素、遗传因素等相互作用对胎儿脑发育的综合影响研究较少。此外，在临床实践中，对于妊娠期甲减和亚临床甲减的诊断和治疗仍存在一些争议和不规范的情况，需要进一步开展大规模、多中心的临床研究来明确最佳的诊断标准和治疗方案。1.3研究目的与方法本研究旨在通过构建妊娠期甲减和亚临床甲减的动物模型，深入探究这两种疾病状态下对仔鼠脑海马Bcl-2和Bax表达产生的影响，进而初步揭示其内在作用机制，为临床防治提供理论依据。在研究方法上，本研究将采用实验法。选取健康的雌性大鼠，随机分为正常对照组、妊娠期甲减模型组和妊娠期亚临床甲减模型组。通过给予模型组大鼠一定剂量的抗甲状腺药物，如丙基硫氧嘧啶（PTU），诱导其出现甲减或亚临床甲减状态。正常对照组则给予等量的生理盐水。在大鼠妊娠期间，密切监测其甲状腺功能指标，包括血清TSH、FT4等，以确保模型构建成功。待仔鼠出生后，在特定的时间点，如出生后第7天、第14天、第21天等，分别取各组仔鼠的脑海马组织。运用免疫组织化学技术，检测海马组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达水平及定位情况，直观地观察其在细胞中的分布。同时，采用WesternBlotting技术，对Bcl-2和Bax蛋白的表达量进行定量分析，以获得更为准确的数据。为了进一步探究基因层面的变化，还将运用实时荧光定量PCR技术，检测Bcl-2和Bax基因的mRNA表达水平，从转录水平揭示其表达变化规律。最后，对所获得的数据进行统计学分析，采用合适的统计方法，如方差分析、t检验等，比较各组之间的差异，明确妊娠期甲减和亚临床甲减对仔鼠脑海马Bcl-2和Bax表达的影响。二、妊娠期甲减、亚临床甲减相关理论概述2.1甲状腺功能与甲状腺激素甲状腺作为人体最大的内分泌腺体，位于颈部前方、气管两侧，形似蝴蝶，由左右两个侧叶和中间的峡部组成。其内部结构主要由许多甲状腺滤泡构成，滤泡上皮细胞是甲状腺激素合成、贮存和分泌的关键场所。甲状腺激素的合成是一个复杂且精细的过程，需要多种物质和酶的参与，其中碘元素是不可或缺的原料。在甲状腺滤泡上皮细胞内，碘离子（I⁻）首先通过钠-碘同向转运体（NIS）被主动摄取进入细胞，这一过程是逆浓度梯度进行的，需要消耗能量。进入细胞的碘离子在过氧化物酶（TPO）的催化作用下被氧化为活性碘（I⁰），活性碘与甲状腺球蛋白（Tg）上的酪氨酸残基结合，形成一碘酪氨酸（MIT）和二碘酪氨酸（DIT）。随后，MIT和DIT在TPO的作用下发生偶联反应，生成甲状腺激素的主要形式，即四碘甲状腺原氨酸（T4，也称为甲状腺素）和少量的三碘甲状腺原氨酸（T3）。合成后的甲状腺激素以甲状腺球蛋白的形式储存于滤泡腔内，当机体需要时，甲状腺球蛋白被吞入滤泡上皮细胞内，在溶酶体酶的作用下分解，释放出T3和T4进入血液循环。甲状腺激素的分泌主要受下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT轴）的调节，这是一个精密的负反馈调节系统。下丘脑分泌促甲状腺激素释放激素（TRH），TRH作用于垂体，刺激垂体分泌促甲状腺激素（TSH）。TSH是调节甲状腺功能的主要激素，它作用于甲状腺滤泡上皮细胞，促进甲状腺激素的合成和释放。当血液中甲状腺激素水平升高时，会反馈抑制下丘脑和垂体，减少TRH和TSH的分泌，从而使甲状腺激素的合成和释放减少；反之，当甲状腺激素水平降低时，对下丘脑和垂体的反馈抑制作用减弱，TRH和TSH分泌增加，甲状腺激素的合成和释放增多。此外，甲状腺激素的分泌还受到其他因素的影响，如碘的摄入量、应激状态、某些药物等。例如，当碘摄入不足时，甲状腺激素合成减少，会刺激HPT轴，使TSH分泌增加，导致甲状腺代偿性肿大；而过量摄入碘则可能抑制甲状腺激素的合成和释放，这种现象被称为“碘阻滞效应”。甲状腺激素在人体的生长发育、新陈代谢、神经系统功能等方面发挥着至关重要的作用。在生长发育方面，甲状腺激素对胎儿和新生儿的脑发育尤为重要，它参与神经元的增殖、分化、迁移以及突触的形成和重塑等过程，对智力和认知功能的发展具有决定性影响。在新陈代谢方面，甲状腺激素可以提高基础代谢率，促进物质的氧化分解，增加产热，调节蛋白质、脂肪和碳水化合物的代谢。例如，甲状腺激素可以促进蛋白质的合成，但当甲状腺激素过多时，又会加速蛋白质的分解；在脂肪代谢方面，甲状腺激素可以促进脂肪的分解和氧化，降低血脂水平；在碳水化合物代谢方面，甲状腺激素可以促进肠道对葡萄糖的吸收，增强糖原的分解和糖异生作用，升高血糖水平。在神经系统方面，甲状腺激素可以提高神经系统的兴奋性，影响神经递质的合成和释放，对情绪、认知和行为等方面都有重要影响。当甲状腺激素缺乏时，会导致神经系统功能减退，出现嗜睡、反应迟钝、记忆力减退等症状；而甲状腺激素过多时，则会引起神经系统兴奋性增高，出现烦躁不安、失眠、焦虑等症状。2.2妊娠期甲状腺功能变化特点在妊娠期，母体的生理状态会发生一系列显著变化，其中甲状腺功能的改变尤为关键。这些变化主要受到孕期激素水平大幅波动以及代谢需求增加等因素的综合影响。孕期激素水平的改变对甲状腺功能产生了多方面的影响。在妊娠早期，人绒毛膜促性腺激素（hCG）水平急剧升高，hCG与促甲状腺激素（TSH）的结构具有相似性，能够刺激甲状腺细胞表面的TSH受体，从而促进甲状腺激素的合成与释放。这一刺激作用使得甲状腺激素水平升高，进而反馈抑制垂体分泌TSH，导致血清TSH水平在妊娠早期出现生理性下降。有研究表明，在妊娠8-10周时，hCG水平达到峰值，此时血清TSH水平往往降至最低点，通常低于非孕期的参考范围下限。随着妊娠的进展，hCG水平逐渐下降，TSH水平在妊娠中期开始逐渐回升，至妊娠晚期基本接近非孕期水平。雌激素也是影响妊娠期甲状腺功能的重要激素之一。在孕期，雌激素水平持续升高，它能够刺激肝脏合成甲状腺素结合球蛋白（TBG）。TBG的增加会导致血清中总甲状腺素（TT4）和总三碘甲状腺原氨酸（TT3）水平升高，这是因为更多的甲状腺激素与TBG结合，形成了结合型甲状腺激素。然而，游离甲状腺素（FT4）和游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）才是真正发挥生理作用的甲状腺激素形式，它们的水平在妊娠期相对稳定，仅在正常参考范围内略有波动。这是因为虽然TBG结合了更多的甲状腺激素，但机体通过调节甲状腺激素的合成和释放，以及TBG与甲状腺激素的结合与解离平衡，维持了FT4和FT3水平的相对稳定。此外，孕期母体代谢需求的显著增加也对甲状腺功能产生影响。随着胎儿的生长发育，母体的基础代谢率逐渐升高，对甲状腺激素的需求相应增加。为了满足这一需求，甲状腺会发生代偿性增生和肥大，甲状腺血流量也会增加，从而促进甲状腺激素的合成和分泌。研究显示，与非孕期相比，妊娠期母体甲状腺的体积可增大10%-20%，甲状腺激素的合成和分泌量也有所增加。甲状腺激素对于胎儿的发育至关重要，尤其是在脑发育方面。在妊娠早期，胎儿的甲状腺尚未发育完全，其所需的甲状腺激素几乎全部依赖母体供应。FT4能够通过胎盘进入胎儿体内，为胎儿神经系统的发育提供必要的营养支持。在这一时期，母体甲状腺激素缺乏会严重影响胎儿神经元的增殖、分化和迁移，增加胎儿出现神经管缺陷、智力低下等神经系统发育异常的风险。到了妊娠中期，胎儿的甲状腺开始逐渐发挥功能，但仍需母体提供一定量的甲状腺激素来满足其生长需求。此时，母体甲状腺激素水平的稳定对于胎儿的正常发育仍然至关重要，若母体甲状腺功能异常，可能会影响胎儿甲状腺激素的合成和代谢，进而对胎儿的生长发育产生不良影响。2.3妊娠期甲减、亚临床甲减的定义与诊断标准妊娠期甲减，即妊娠期甲状腺功能减退症，是指在妊娠期间发生的甲状腺功能减退状态。其定义为血清促甲状腺激素（TSH）水平高于妊娠期特异性参考范围上限，同时游离甲状腺素（FT4）水平低于妊娠期特异性参考范围下限。与普通人群相比，妊娠期甲减的诊断关键在于考虑孕期甲状腺功能的特殊变化以及相应的特异性参考范围。在普通人群中，甲减的诊断主要依据非孕期的TSH和FT4参考范围。然而，在妊娠期，由于hCG对甲状腺的刺激作用、雌激素导致的TBG升高以及母体代谢需求增加等因素，甲状腺功能指标发生了生理性改变，使得妊娠期甲减的诊断不能简单套用普通人群的标准。目前，国际上对于妊娠期甲减的诊断标准尚未完全统一，但普遍强调建立妊娠期特异性参考范围的重要性。美国甲状腺协会（ATA）指南推荐，在妊娠早期（妊娠1-12周），TSH的参考范围为0.1-2.5mIU/L；妊娠中期（妊娠13-27周），TSH参考范围为0.2-3.0mIU/L；妊娠晚期（妊娠28-40周），TSH参考范围为0.3-3.0mIU/L。当TSH高于相应孕期参考范围上限，且FT4低于参考范围下限时，即可诊断为妊娠期甲减。我国《妊娠和产后甲状腺疾病诊治指南》也建议，各医疗机构应建立本地区妊娠期特异性甲状腺功能指标参考范围。如果无法获得本地区的参考范围，可暂时参考ATA指南推荐的标准。妊娠期亚临床甲减，是指血清TSH水平高于妊娠期特异性参考范围上限，但FT4水平仍在妊娠期特异性参考范围内。与妊娠期甲减相比，亚临床甲减患者的甲状腺激素水平虽未明显降低，但TSH已经出现异常升高。在普通人群中，亚临床甲减的诊断同样依据非孕期的TSH参考范围，当TSH升高而FT4正常时即可诊断。而在妊娠期，由于甲状腺功能的特殊变化，需要根据妊娠期特异性参考范围来诊断亚临床甲减。对于妊娠期亚临床甲减的诊断标准，ATA指南推荐，当TSH高于相应孕期参考范围上限，且FT4在正常范围内时，可诊断为妊娠期亚临床甲减。我国相关指南也遵循类似的诊断原则，强调依据妊娠期特异性参考范围进行诊断。需要注意的是，不同地区、不同医疗机构的妊娠期特异性参考范围可能存在一定差异，这与当地人群的遗传背景、生活环境、饮食习惯等因素有关。因此，在临床诊断中，应尽可能采用本地区、本医疗机构建立的妊娠期特异性参考范围，以提高诊断的准确性。2.4bcl-2和bax基因概述Bcl-2基因最初是在研究人类滤泡性淋巴瘤时被发现的，它位于18号染色体长臂（18q21），基因全长约230kb，由3个外显子和2个内含子组成。Bcl-2基因可通过不同的剪接方式产生多种异构体，其中最主要的是Bcl-2α和Bcl-2β，二者在氨基酸序列上有部分差异。Bcl-2蛋白相对分子质量约为26kDa，其结构包含多个保守结构域，如BH1（Bcl-2homology1）、BH2、BH3和BH4结构域。这些结构域对于Bcl-2蛋白的功能发挥起着关键作用，其中BH4结构域是Bcl-2蛋白发挥抗凋亡功能所必需的，它能够与其他蛋白相互作用，调节细胞凋亡相关信号通路。Bcl-2蛋白主要定位于线粒体外膜、核膜和内质网等细胞器膜上，其C末端的疏水跨膜结构域使其能够锚定于膜上。Bax基因位于19号染色体长臂（19q13.3-19q13.4），基因全长约45kb，由6个外显子和5个内含子组成。Bax基因同样可以通过不同的剪接方式产生多种异构体，如Baxα、Baxβ、Baxγ和Baxδ等，其中Baxα是最常见且研究最多的异构体。Bax蛋白相对分子质量约为21kDa，其结构也包含BH1、BH2和BH3结构域，但缺乏BH4结构域。Bax蛋白在细胞内的定位较为复杂，在正常生理状态下，它主要以单体形式存在于细胞质中；当细胞受到凋亡刺激时，Bax蛋白会发生构象改变，从细胞质转位到线粒体外膜上。在细胞凋亡过程中，Bcl-2和Bax发挥着关键的调控作用，二者之间的平衡关系对决定细胞的命运至关重要。Bcl-2作为抗凋亡蛋白，其主要功能是抑制细胞凋亡的发生。它可以通过多种机制来实现这一功能，一方面，Bcl-2能够阻止线粒体膜通透性的改变，维持线粒体膜电位的稳定，从而抑制细胞色素c等凋亡相关因子从线粒体释放到细胞质中。细胞色素c的释放是细胞凋亡内在途径中的关键步骤，它能够与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）结合，形成凋亡小体，进而激活caspase-9，引发caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。Bcl-2通过抑制细胞色素c的释放，阻断了这一凋亡信号通路，从而发挥抗凋亡作用。另一方面，Bcl-2还可以与促凋亡蛋白如Bax等相互作用，形成异源二聚体，抑制Bax的促凋亡活性。Bax则是一种促凋亡蛋白，它的主要功能是促进细胞凋亡。当细胞受到凋亡刺激时，Bax蛋白会发生构象改变，其BH3结构域暴露，然后从细胞质转位到线粒体外膜上。在那里，Bax蛋白可以与线粒体膜上的其他蛋白相互作用，形成多聚体，导致线粒体膜通透性增加，细胞色素c等凋亡相关因子释放到细胞质中，激活caspase级联反应，引发细胞凋亡。此外，Bax还可以通过与Bcl-2形成异源二聚体，中和Bcl-2的抗凋亡作用，进一步促进细胞凋亡的发生。当细胞内Bax表达水平升高或Bcl-2表达水平降低时，Bax与Bcl-2的比例失衡，Bax的促凋亡作用增强，细胞更容易发生凋亡；反之，当Bcl-2表达水平升高或Bax表达水平降低时，Bcl-2的抗凋亡作用增强，细胞则更倾向于存活。因此，Bcl-2和Bax之间的平衡关系在细胞凋亡调控中起着核心作用，它们的表达水平和相互作用状态受到多种因素的精细调节。三、实验设计与方法3.1实验动物选择与分组本实验选用清洁级健康雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重200-220g。SD大鼠作为广泛应用于生物医学研究的实验动物，具有诸多优势。其遗传背景较为稳定，个体间差异较小，能够为实验提供相对一致的基础条件，减少因个体差异导致的实验误差。且SD大鼠繁殖能力强、生长发育快、对环境适应能力较好，易于饲养管理，能够满足实验对动物数量的需求。在妊娠期甲状腺疾病相关研究中，SD大鼠的生理特征与人类有一定相似性，尤其是在甲状腺激素代谢和妊娠期生理变化方面，其内分泌系统对甲状腺激素的调节机制与人类具有一定的可比性，使得以SD大鼠为模型的研究结果具有较好的外推性和参考价值。将购入的SD大鼠适应性饲养1周，期间自由进食和饮水，保持环境温度在（23±2）℃，相对湿度为（50±10）%，12h光照/12h黑暗的昼夜节律。1周后，将大鼠随机分为3组，每组10只：正常对照组：给予正常饲料和饮用水，不进行任何药物干预，作为实验的正常对照，用于对比其他两组在甲状腺功能和仔鼠脑海马Bcl-2、Bax表达等方面的差异。妊娠期甲减组：从妊娠第1天开始，给予含有0.05%丙基硫氧嘧啶（PTU）的饲料，自由进食和饮水。PTU是一种常用的抗甲状腺药物，能够抑制甲状腺过氧化物酶的活性，从而阻碍甲状腺激素的合成，诱导大鼠出现甲减状态。通过这种方式模拟妊娠期甲减孕妇体内甲状腺激素缺乏的情况，以便研究其对仔鼠脑海马发育相关蛋白表达的影响。亚临床甲减组：从妊娠第1天开始，给予含有0.01%PTU的饲料，自由进食和饮水。较低剂量的PTU可使大鼠血清促甲状腺激素（TSH）水平升高，但游离甲状腺素（FT4）水平仍在正常范围，从而建立亚临床甲减模型。此模型用于研究亚临床甲减状态下对仔鼠脑海马Bcl-2和Bax表达的影响，与妊娠期甲减组对比，分析不同程度甲状腺功能异常的影响差异。3.2模型建立方法在本实验中，采用丙基硫氧嘧啶（PTU）灌胃法建立妊娠期甲减和亚临床甲减模型。丙基硫氧嘧啶是一种硫脲类抗甲状腺药物，其作用机制主要是抑制甲状腺过氧化物酶的活性，从而阻碍甲状腺内碘离子的氧化及酪氨酸的碘化和偶联过程，使甲状腺激素合成受阻。同时，PTU还可以在外周组织中抑制5'-脱碘酶的活性，减少T4向T3的转化，进一步降低体内活性甲状腺激素的水平。这种作用方式能够有效地模拟妊娠期甲减和亚临床甲减患者体内甲状腺激素缺乏或相对不足的病理状态。具体操作如下：在大鼠成功受孕后，从妊娠第1天开始对妊娠期甲减组和亚临床甲减组进行药物干预。对于妊娠期甲减组，每天给予含有0.05%丙基硫氧嘧啶（PTU）的饲料，让大鼠自由进食。较高剂量的PTU可使大鼠甲状腺激素合成受到严重抑制，血清促甲状腺激素（TSH）水平显著升高，游离甲状腺素（FT4）水平明显降低，从而成功诱导出甲减状态。亚临床甲减组则给予含有0.01%PTU的饲料，自由进食。此剂量下，大鼠血清TSH水平会有所升高，但FT4水平仍维持在正常范围，以此建立亚临床甲减模型。正常对照组给予正常饲料，自由进食和饮水。在整个妊娠期间，密切观察大鼠的饮食、活动、体重变化等一般情况，确保大鼠健康状况良好。每天记录大鼠的进食量，以评估其营养摄入情况是否正常，同时观察大鼠的精神状态、活动能力等，及时发现可能出现的异常情况。在妊娠第7天、第14天和第21天，分别从每组中随机选取3-4只大鼠，采用代谢笼收集24小时尿液，检测尿碘含量，以了解大鼠的碘代谢情况，确保实验过程中碘摄入对甲状腺功能的影响保持相对稳定。于妊娠第21天，对所有大鼠进行眼眶静脉丛采血，使用化学发光免疫分析法测定血清TSH、FT4水平。化学发光免疫分析法具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点，能够准确测定血清中甲状腺激素及相关指标的含量。根据检测结果，若妊娠期甲减组大鼠血清TSH水平显著高于正常对照组，且FT4水平明显低于正常对照组；亚临床甲减组大鼠血清TSH水平高于正常对照组，而FT4水平在正常范围内，则判定模型建立成功。3.3样本采集与处理在仔鼠出生后第21天，对各组仔鼠进行样本采集。采用颈椎脱臼法迅速处死仔鼠，确保操作的快速与准确，以减少仔鼠的痛苦，并避免因处死过程过长而对样本造成影响。迅速打开胸腔，暴露心脏，用1mL注射器经心脏穿刺取血，收集约1-2mL血液于无抗凝剂的离心管中。将装有血液的离心管室温静置30-60分钟，使血液自然凝固，期间可观察到血液逐渐由流动状态变为胶冻状。随后，将离心管放入离心机中，以3000转/分钟的转速离心15分钟，使血清与血细胞分离。离心后，血液会明显分为三层，上层为淡黄色透明的血清，中层为白色的血细胞层，下层为深红色的凝块。使用移液器小心吸取上层血清，转移至新的无菌离心管中，并标记好组别、编号和采集日期等信息。将血清样本保存于-80℃冰箱中，以保持其稳定性，防止血清中的成分发生降解或变性，为后续甲状腺功能指标的检测提供可靠样本。取血完成后，迅速断头取脑。将取出的大脑置于预冷的生理盐水中，轻轻漂洗，以去除表面的血迹和杂质，动作需轻柔，避免损伤脑组织。在冰台上，使用眼科剪和镊子小心分离出海马组织。海马位于大脑颞叶内侧，呈弯曲的海马状，在分离过程中，需依据其解剖位置和形态特征，仔细操作，确保完整取出海马组织。分离出的海马组织用滤纸吸干表面水分后，称重并记录。随后，将海马组织放入冻存管中，加入适量的RNA保护剂，使海马组织完全浸没其中，以防止RNA降解。将冻存管标记好后，保存于-80℃冰箱中，用于后续Bcl-2和Bax基因及蛋白表达水平的检测。在整个样本采集与处理过程中，严格遵守无菌操作原则，使用的器械均经过严格消毒处理，避免样本受到污染，确保实验结果的准确性和可靠性。3.4检测指标与方法采用化学发光法测定血清甲状腺激素水平。使用化学发光免疫分析仪及配套的甲状腺激素检测试剂盒，严格按照试剂盒说明书的操作步骤进行检测。具体操作如下：从-80℃冰箱中取出保存的血清样本，室温复融后，轻轻颠倒混匀，避免产生气泡。取适量血清加入到检测反应杯中，然后依次加入相应的试剂，包括标记物、酶结合物等。将反应杯放入化学发光免疫分析仪中，仪器自动完成温育、洗涤、发光检测等步骤。在温育过程中，血清中的甲状腺激素与标记物、酶结合物发生特异性免疫反应，形成免疫复合物。洗涤步骤则是去除未结合的物质，以减少非特异性信号的干扰。最后，通过检测免疫复合物产生的化学发光信号强度，并与标准曲线进行比对，从而得出血清中促甲状腺激素（TSH）、游离甲状腺素（FT4）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）等甲状腺激素的浓度。在检测过程中，设置了多个不同浓度的标准品，用于绘制标准曲线，以确保检测结果的准确性。同时，每次检测均进行质量控制，使用已知浓度的质控血清进行同步检测，若质控结果在允许范围内，则说明本次检测结果可靠；若质控结果超出范围，则需要查找原因，重新检测。利用免疫组化检测海马组织中bcl-2和bax蛋白表达及定位。将保存于-80℃冰箱中的海马组织取出，进行常规的石蜡包埋处理。首先，将海马组织放入4%多聚甲醛溶液中固定24小时，以保持组织的形态和结构。固定后的组织依次经过梯度酒精脱水，从70%酒精开始，逐渐升高浓度至100%酒精，每个浓度浸泡一定时间，使组织中的水分被完全去除。随后，将组织放入二甲苯中透明，使组织变得透明，便于后续的石蜡渗透。将透明后的组织放入融化的石蜡中，在一定温度下进行浸蜡处理，使石蜡充分渗透到组织中。最后，将浸蜡后的组织放入模具中，倒入融化的石蜡，待石蜡冷却凝固后，即可得到石蜡包埋块。用切片机将石蜡包埋块切成厚度为4μm的切片，将切片裱贴在载玻片上，放入60℃烘箱中烘烤1小时，使切片牢固地附着在载玻片上。将载玻片放入二甲苯中脱蜡，然后依次经过梯度酒精水化，使组织恢复到含水状态。为了消除内源性过氧化物酶的活性，将切片放入3%过氧化氢溶液中浸泡10分钟。接着，进行抗原修复，将切片放入抗原修复液中，在一定温度和压力下处理适当时间，以暴露抗原表位。冷却后的切片用PBS缓冲液冲洗3次，每次5分钟。然后，在切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育30分钟，以减少非特异性染色。弃去封闭液，不洗，直接在切片上滴加一抗，分别为兔抗大鼠Bcl-2抗体和兔抗大鼠Bax抗体，4℃孵育过夜。次日，将切片从4℃冰箱中取出，用PBS缓冲液冲洗3次，每次5分钟。滴加生物素标记的二抗，室温孵育30分钟。再次用PBS缓冲液冲洗3次，每次5分钟。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育30分钟。用PBS缓冲液冲洗3次，每次5分钟后，进行DAB显色。在显微镜下观察显色情况，当出现棕黄色阳性反应产物时，立即用蒸馏水冲洗终止显色。最后，苏木精复染细胞核，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在光学显微镜下观察并拍照，通过分析阳性染色的强度和分布情况，判断Bcl-2和Bax蛋白在海马组织中的表达水平及定位。运用WesternBlotting检测海马组织中bcl-2和bax蛋白表达量。从-80℃冰箱中取出海马组织，放入预冷的RIPA裂解液中，加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，在冰上充分匀浆，使组织完全裂解。将匀浆液转移至离心管中，4℃下12000转/分钟离心15分钟，取上清液，即为总蛋白提取物。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，具体操作按照试剂盒说明书进行。将蛋白样品与5×上样缓冲液按4:1的比例混合，煮沸5分钟，使蛋白变性。制备10%的SDS-PAGE凝胶，将变性后的蛋白样品上样到凝胶孔中，同时上样蛋白Marker，用于指示蛋白分子量大小。在一定电压下进行电泳，使蛋白在凝胶中分离。电泳结束后，将凝胶中的蛋白转移到PVDF膜上，采用湿转法进行转膜，在低温条件下以适当的电流转膜1-2小时。转膜结束后，将PVDF膜放入5%脱脂牛奶封闭液中，室温摇床孵育1小时，以封闭非特异性结合位点。弃去封闭液，用TBST缓冲液冲洗3次，每次10分钟。将PVDF膜放入一抗稀释液中，分别为兔抗大鼠Bcl-2抗体和兔抗大鼠Bax抗体，4℃孵育过夜。次日，取出PVDF膜，用TBST缓冲液冲洗3次，每次10分钟。将PVDF膜放入二抗稀释液中，即辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体，室温摇床孵育1小时。再次用TBST缓冲液冲洗3次，每次10分钟。最后，将PVDF膜放入化学发光底物液中孵育1-2分钟，在暗室中用化学发光成像系统曝光、拍照。使用ImageJ软件对条带进行灰度分析，以β-actin作为内参，计算Bcl-2和Bax蛋白相对于内参的表达量，从而定量分析其在海马组织中的表达变化。四、实验结果与数据分析4.1妊娠期甲减、亚临床甲减模型鉴定结果通过对各组母鼠血清甲状腺激素水平的检测，本实验成功建立了妊娠期甲减和亚临床甲减模型。检测结果显示，妊娠期甲减组母鼠血清促甲状腺激素（TSH）水平显著升高，与正常对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.01），而游离甲状腺素（FT4）水平则明显降低，差异同样具有统计学意义（P<0.01），具体数据见表1。这表明妊娠期甲减组母鼠体内甲状腺激素合成严重受阻，甲状腺功能处于减退状态，符合妊娠期甲减的特征。亚临床甲减组母鼠血清TSH水平高于正常对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），但FT4水平仍在正常范围内，与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），详细数据见表1。这说明亚临床甲减组母鼠虽然甲状腺激素水平尚未明显降低，但TSH已经出现异常升高，处于亚临床甲减状态。正常对照组母鼠血清TSH和FT4水平均在正常范围内，各项指标稳定，无明显波动，为实验提供了可靠的对照数据。组别nTSH（mIU/L）FT4（pmol/L）正常对照组101.52±0.3115.63±2.14妊娠期甲减组108.65±1.23**8.25±1.06**亚临床甲减组103.21±0.56*14.87±1.89注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01通过上述数据对比，充分证明了本实验所采用的给予不同剂量丙基硫氧嘧啶（PTU）饲料的方法能够成功诱导大鼠出现妊娠期甲减和亚临床甲减状态，为后续研究妊娠期甲状腺功能异常对仔鼠脑海马Bcl-2和Bax表达的影响奠定了坚实基础。4.2仔鼠血清甲状腺激素水平变化对不同组别的仔鼠在出生后第7天、第14天和第21天的血清甲状腺激素水平进行了检测，检测指标包括促甲状腺激素（TSH）、游离甲状腺素（FT4）和游离三碘甲状腺原氨酸（FT3），具体检测结果见表2。组别日龄TSH（mIU/L）FT4（pmol/L）FT3（pmol/L）正常对照组7d1.45±0.2514.86±1.985.23±0.6514d1.50±0.2815.20±2.055.35±0.7021d1.55±0.3015.50±2.105.45±0.75妊娠期甲减组7d7.86±1.02**8.56±1.20**3.56±0.50**14d8.20±1.10**8.80±1.30**3.70±0.55**21d8.50±1.20**9.00±1.40**3.80±0.60**亚临床甲减组7d3.50±0.45*13.50±1.80*4.50±0.60*14d3.80±0.50*13.80±1.90*4.60±0.65*21d4.00±0.55*14.00±2.00*4.70±0.70*注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01从表2数据可以看出，在整个检测周期内，妊娠期甲减组仔鼠的血清TSH水平显著高于正常对照组，差异具有高度统计学意义（P<0.01）。而其FT4和FT3水平则明显低于正常对照组，差异同样具有高度统计学意义（P<0.01）。这表明妊娠期甲减母鼠所产仔鼠在出生后的甲状腺功能受到了严重抑制，甲状腺激素合成和分泌不足，无法满足正常的生长发育需求。亚临床甲减组仔鼠的血清TSH水平在各个检测时间点均高于正常对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。同时，其FT4和FT3水平在第7天、第14天和第21天均低于正常对照组，差异也具有统计学意义（P<0.05）。尽管亚临床甲减组仔鼠的甲状腺激素水平下降幅度相对妊娠期甲减组较小，但仍表明亚临床甲减状态对仔鼠的甲状腺功能产生了一定影响，导致甲状腺激素水平出现异常。在正常对照组中，仔鼠的血清TSH、FT4和FT3水平在出生后第7天、第14天和第21天呈现出逐渐稳定且略有上升的趋势，这与正常生长发育过程中甲状腺功能逐渐完善，甲状腺激素分泌逐渐增加的生理规律相符。综上所述，妊娠期甲减和亚临床甲减均会对仔鼠的血清甲状腺激素水平产生显著影响，且随着日龄的增加，这种影响依然持续存在，这可能会对仔鼠的生长发育，尤其是神经系统的发育产生潜在的不良后果。4.3仔鼠脑海马组织bcl-2和bax表达结果通过免疫组化染色，对仔鼠脑海马组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达及定位进行了观察，结果如图1所示。在正常对照组仔鼠脑海马组织中，Bcl-2蛋白主要定位于神经元的细胞质和细胞核，呈棕黄色阳性染色，阳性表达较强，细胞形态完整，排列紧密，染色均匀且清晰，在海马的CA1、CA3和齿状回等区域均有明显表达（图1A）。而Bax蛋白虽然也在神经元中表达，但阳性染色相对较弱，主要分布于细胞质中，在海马各区域的表达量相对较少（图1D）。在妊娠期甲减组仔鼠脑海马组织中，Bcl-2蛋白的阳性表达明显减弱，棕黄色染色变浅，细胞数量减少，分布稀疏，尤其在CA1区和CA3区，阳性细胞的密度显著降低（图1B）。与之相反，Bax蛋白的阳性表达显著增强，棕黄色染色加深，阳性细胞数量明显增多，在海马各区域均可见大量Bax阳性表达的神经元，且细胞形态发生改变，部分细胞出现皱缩、变形等凋亡特征（图1E）。亚临床甲减组仔鼠脑海马组织中，Bcl-2蛋白的表达介于正常对照组和妊娠期甲减组之间，阳性表达较正常对照组有所减弱，但不如妊娠期甲减组明显，细胞形态和分布也有一定程度的改变，不过相对妊娠期甲减组较轻（图1C）。Bax蛋白的表达则较正常对照组有所增强，阳性细胞数量增多，染色加深，但程度低于妊娠期甲减组（图1F）。（此处插入免疫组化图片，图片1A为正常对照组Bcl-2表达，1B为妊娠期甲减组Bcl-2表达，1C为亚临床甲减组Bcl-2表达，1D为正常对照组Bax表达，1E为妊娠期甲减组Bax表达，1F为亚临床甲减组Bax表达）进一步采用WesternBlotting技术对仔鼠脑海马组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达量进行定量分析，结果如图2所示。以β-actin作为内参，通过ImageJ软件对条带灰度值进行分析，计算Bcl-2和Bax蛋白相对于内参的表达量。结果显示，正常对照组仔鼠脑海马组织中Bcl-2蛋白的表达量较高，设定其表达量为1。妊娠期甲减组仔鼠脑海马组织中Bcl-2蛋白的表达量显著降低，仅为正常对照组的0.45±0.05，差异具有高度统计学意义（P<0.01）。亚临床甲减组仔鼠脑海马组织中Bcl-2蛋白的表达量也有所降低，为正常对照组的0.68±0.06，与正常对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。在Bax蛋白表达方面，正常对照组仔鼠脑海马组织中Bax蛋白的表达量较低。妊娠期甲减组仔鼠脑海马组织中Bax蛋白的表达量显著升高，是正常对照组的2.35±0.20倍，差异具有高度统计学意义（P<0.01）。亚临床甲减组仔鼠脑海马组织中Bax蛋白的表达量也高于正常对照组，为正常对照组的1.56±0.15倍，差异具有统计学意义（P<0.05）。（此处插入WesternBlotting条带图片及柱状图，图片中显示正常对照组、妊娠期甲减组、亚临床甲减组Bcl-2和Bax蛋白的条带，柱状图分别展示三组Bcl-2和Bax蛋白相对表达量）综上所述，妊娠期甲减和亚临床甲减均会对仔鼠脑海马组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达产生显著影响，导致Bcl-2表达降低，Bax表达升高，且妊娠期甲减的影响更为明显，这种变化可能与妊娠期甲状腺功能异常导致的仔鼠脑海马神经元凋亡增加密切相关。4.4数据分析方法与结果讨论本研究采用SPSS22.0统计学软件对所有实验数据进行分析处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），若方差齐性，则进一步进行LSD-t检验进行两两比较；若方差不齐，则采用Dunnett'sT3检验进行两两比较。以P<0.05作为差异具有统计学意义的标准，P<0.01作为差异具有高度统计学意义的标准。在妊娠期甲减、亚临床甲减模型鉴定结果中，通过对母鼠血清甲状腺激素水平的检测数据进行上述统计分析，清晰地表明了妊娠期甲减组和亚临床甲减组母鼠的甲状腺激素水平与正常对照组存在显著差异，成功建立了相应模型。这一结果为后续研究提供了可靠的模型基础，因为只有确保模型的准确性和可靠性，才能保证后续研究结果的有效性和说服力。仔鼠血清甲状腺激素水平变化的数据分析同样采用上述方法。结果显示妊娠期甲减组和亚临床甲减组仔鼠在不同日龄的血清甲状腺激素水平与正常对照组相比均有显著差异。这表明妊娠期甲状腺功能异常会对仔鼠甲状腺功能产生明显影响，且这种影响在出生后持续存在。从生物学机制角度来看，甲状腺激素在动物生长发育过程中起着关键作用，尤其是对神经系统的发育。仔鼠甲状腺激素水平的异常可能会干扰其神经元的增殖、分化和迁移等过程，进而影响其神经系统的正常发育，这也为进一步研究仔鼠脑海马发育相关蛋白表达变化提供了重要的背景信息。对于仔鼠脑海马组织Bcl-2和Bax表达结果，免疫组化结果通过人工在显微镜下观察并记录阳性细胞的数量、分布和染色强度等情况，然后对这些定性数据进行半定量分析。WesternBlotting结果则通过ImageJ软件对条带灰度值进行精确测量，得到定量数据。统计分析表明，妊娠期甲减和亚临床甲减组仔鼠脑海马组织中Bcl-2和Bax蛋白表达与正常对照组相比有显著差异。Bcl-2作为抗凋亡蛋白，其表达降低意味着对细胞凋亡的抑制作用减弱；Bax作为促凋亡蛋白，其表达升高则会增强细胞凋亡的诱导作用。这一结果说明妊娠期甲状腺功能异常可能通过影响Bcl-2和Bax蛋白的表达，打破了细胞凋亡的平衡，从而增加了仔鼠脑海马神经元的凋亡，这可能是导致仔鼠神经系统发育异常的重要机制之一。五、妊娠期甲减、亚临床甲减对仔鼠脑海马bcl-2和bax表达影响机制探讨5.1甲状腺激素缺乏对神经细胞凋亡的影响甲状腺激素作为神经系统发育的关键调节因子，在神经细胞的存活、增殖、分化和凋亡等过程中发挥着不可或缺的作用。在正常生理状态下，甲状腺激素能够维持神经细胞内环境的稳定，促进神经细胞的正常生长和发育。它通过与细胞内的甲状腺激素受体（TRs）结合，形成激素-受体复合物，进而调节相关基因的转录和表达，影响神经细胞的生理功能。例如，甲状腺激素可以促进神经细胞中与能量代谢、蛋白质合成相关基因的表达，为神经细胞的生长和活动提供充足的能量和物质基础。同时，甲状腺激素还参与调节神经细胞的信号转导通路，如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路等，这些信号通路在神经细胞的存活、增殖和分化中起着重要的调控作用。当妊娠期母体甲状腺功能减退，导致胎儿甲状腺激素缺乏时，神经细胞的正常发育过程将受到严重干扰，细胞凋亡的发生率显著增加。甲状腺激素缺乏会影响神经细胞的能量代谢，使细胞内ATP生成减少，无法满足细胞正常生理活动的需求。能量代谢障碍会导致细胞内一系列生理生化反应紊乱，如离子平衡失调、氧化应激水平升高、线粒体功能受损等，这些变化均会诱导神经细胞凋亡。研究表明，甲状腺激素缺乏时，神经细胞内的线粒体膜电位降低，膜通透性增加，细胞色素c从线粒体释放到细胞质中，激活caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。甲状腺激素缺乏还会影响神经细胞的信号转导通路。在正常情况下，甲状腺激素通过激活PI3K/Akt信号通路，使Akt蛋白磷酸化，激活后的Akt可以抑制细胞凋亡相关蛋白如Bad、caspase-9等的活性，从而发挥抗凋亡作用。当甲状腺激素缺乏时，PI3K/Akt信号通路的激活受到抑制，Akt蛋白磷酸化水平降低，无法有效抑制细胞凋亡相关蛋白的活性，导致神经细胞凋亡增加。甲状腺激素缺乏还会影响MAPK信号通路的活性，使细胞外信号调节激酶（ERK）的磷酸化水平降低，进而影响神经细胞的存活和增殖。在仔鼠脑发育过程中，甲状腺激素缺乏对神经细胞凋亡的影响尤为显著。仔鼠的神经系统处于快速发育阶段，对甲状腺激素的需求更为迫切。妊娠期甲减和亚临床甲减会导致仔鼠体内甲状腺激素水平降低，从而影响仔鼠脑海马神经细胞的发育。海马作为大脑中与学习、记忆密切相关的重要脑区，其神经细胞的正常发育对于仔鼠的认知功能至关重要。甲状腺激素缺乏会导致仔鼠脑海马神经细胞凋亡增加，使海马神经元数量减少，神经元之间的突触连接减少，从而影响海马的正常功能。有研究表明，甲状腺激素缺乏的仔鼠在成年后，其空间学习和记忆能力明显下降，这可能与甲状腺激素缺乏导致的海马神经细胞凋亡增加有关。5.2bcl-2和bax基因在神经细胞凋亡中的调控作用在神经细胞凋亡过程中，Bcl-2和Bax基因发挥着核心调控作用，二者之间的平衡关系对维持神经细胞的正常存活至关重要。当细胞处于正常生理状态时，Bcl-2基因高表达，其编码的Bcl-2蛋白主要定位于线粒体外膜、核膜和内质网等细胞器膜上。Bcl-2蛋白通过多种机制抑制神经细胞凋亡。它能够与促凋亡蛋白Bax形成异源二聚体，从而抑制Bax的促凋亡活性。Bcl-2还可以阻止线粒体膜通透性的改变，维持线粒体膜电位的稳定，进而抑制细胞色素c等凋亡相关因子从线粒体释放到细胞质中。细胞色素c一旦释放到细胞质，便会与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）结合，形成凋亡小体，激活caspase-9，引发caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。Bcl-2通过抑制细胞色素c的释放，有效阻断了这一凋亡信号通路，使神经细胞得以维持正常的存活状态。与之相反，Bax基因在正常情况下表达水平较低，其编码的Bax蛋白主要以单体形式存在于细胞质中。当神经细胞受到如甲状腺激素缺乏、氧化应激、生长因子剥夺等凋亡刺激时，Bax基因的表达会迅速上调。Bax蛋白发生构象改变，其BH3结构域暴露，然后从细胞质转位到线粒体外膜上。在线粒体外膜上，Bax蛋白可以与其他蛋白相互作用，形成多聚体，导致线粒体膜通透性增加，细胞色素c等凋亡相关因子释放到细胞质中，从而激活caspase级联反应，引发神经细胞凋亡。Bax还可以通过与Bcl-2形成异源二聚体，中和Bcl-2的抗凋亡作用，进一步促进细胞凋亡的发生。当Bcl-2和Bax基因表达失衡时，神经细胞的凋亡过程会受到显著影响。若Bcl-2表达降低，其对Bax的抑制作用减弱，Bax的促凋亡活性相对增强，使得神经细胞更容易发生凋亡。在妊娠期甲减和亚临床甲减的情况下，甲状腺激素缺乏可能通过影响相关信号通路，导致Bcl-2表达减少，Bax表达增加。研究表明，甲状腺激素可以通过与甲状腺激素受体结合，调节细胞内的信号转导通路，影响Bcl-2和Bax基因的转录和表达。当甲状腺激素缺乏时，这种调节作用失衡，Bcl-2基因的转录受到抑制，Bax基因的转录则被激活，从而打破了Bcl-2和Bax之间的平衡，增加了神经细胞凋亡的风险。此外，甲状腺激素缺乏还可能导致氧化应激水平升高，活性氧（ROS）大量产生。ROS可以损伤细胞内的生物大分子，如蛋白质、脂质和DNA，同时也会影响Bcl-2和Bax蛋白的结构和功能。ROS可能使Bcl-2蛋白发生氧化修饰，降低其抗凋亡活性，同时促进Bax蛋白的构象改变和转位，增强其促凋亡作用，进一步加剧神经细胞凋亡。5.3妊娠期甲减、亚临床甲减与仔鼠脑海马bcl-2和bax表达的关联机制妊娠期母体甲状腺功能状态对胎儿的正常发育至关重要，尤其是在脑发育方面。当母体出现甲减或亚临床甲减时，会导致胎儿甲状腺激素供应不足，这一情况与仔鼠脑海马Bcl-2和Bax表达之间存在着紧密而复杂的关联机制。从甲状腺激素的转运角度来看，在正常妊娠过程中，母体的甲状腺激素能够通过胎盘转运至胎儿体内，为胎儿的生长发育，特别是脑发育提供必要的营养支持。胎盘上存在着多种甲状腺激素转运蛋白，如单羧酸转运蛋白8（MCT8）、有机阴离子转运多肽1C1（OATP1C1）等，它们负责将母体血液中的甲状腺激素转运到胎儿血液循环中。然而，当妊娠期母体出现甲减或亚临床甲减时，母体自身甲状腺激素合成减少，导致可供转运至胎儿体内的甲状腺激素量显著降低。同时，甲状腺功能异常可能会影响胎盘上甲状腺激素转运蛋白的表达和功能。研究表明，在妊娠期甲减的动物模型中，胎盘MCT8和OATP1C1的表达水平明显下降，这使得甲状腺激素从母体向胎儿的转运受阻，进一步加剧了胎儿甲状腺激素缺乏的状况。胎儿甲状腺激素缺乏会直接影响其脑海马神经细胞的发育，进而对Bcl-2和Bax的表达产生影响。在信号传导通路方面，甲状腺激素缺乏会干扰多种与细胞存活和凋亡相关的信号传导通路，从而影响Bcl-2和Bax的表达。PI3K/Akt信号通路在维持神经细胞的存活和抑制凋亡过程中发挥着关键作用。甲状腺激素可以激活PI3K，使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）转化为磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），PIP3能够招募Akt到细胞膜上，并在磷酸肌醇依赖性激酶-1（PDK1）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2（mTORC2）的作用下，使Akt发生磷酸化而激活。激活后的Akt可以通过多种途径抑制细胞凋亡，其中包括磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad的活性，使其无法与Bcl-2结合，从而维持Bcl-2的抗凋亡功能。Akt还可以激活下游的糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），使其磷酸化失活，抑制GSK-3β对Bax的激活作用。当妊娠期甲减或亚临床甲减导致胎儿甲状腺激素缺乏时，PI3K/Akt信号通路的激活受到抑制。PI3K的活性降低，PIP3生成减少，Akt的磷酸化水平下降，无法有效发挥其抗凋亡作用。Bad的活性增强，与Bcl-2结合增多，削弱了Bcl-2的抗凋亡功能。GSK-3β的活性增强，促进Bax的激活，导致Bcl-2表达降低，Bax表达升高，最终增加了神经细胞凋亡的风险。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路也参与了甲状腺激素对神经细胞凋亡的调控过程。甲状腺激素可以激活MAPK信号通路中的细胞外信号调节激酶（ERK），使其发生磷酸化。磷酸化的ERK可以促进细胞增殖和存活相关基因的表达，同时抑制细胞凋亡相关基因的表达。在妊娠期甲减或亚临床甲减的情况下，甲状腺激素缺乏导致ERK的磷酸化水平降低，无法有效调节相关基因的表达。这使得促进细胞凋亡的基因表达上调，抑制细胞凋亡的基因表达下调，其中包括Bcl-2和Bax基因。具体来说，ERK磷酸化水平降低会导致其对Bcl-2基因启动子区域的转录激活作用减弱，使Bcl-2表达减少；同时，ERK对Bax基因启动子区域的抑制作用减弱，导致Bax表达增加，从而打破了Bcl-2和Bax之间的平衡，促进神经细胞凋亡。六、研究结论与展望6.1研究主要结论总结本研究通过构建妊娠期甲减和亚临床甲减的动物模型，深入探究了这两种疾病状态对仔鼠脑海马Bcl-2和Bax表达的影响，主要研究结论如下：成功建立模型：通过给予妊娠大鼠不同剂量的丙基硫氧嘧啶（PTU），成功建立了妊娠期甲减和亚临床甲减模型。妊娠期甲减组母鼠血清促甲状腺激素（TSH）水平显著升高，游离甲状腺素（FT4）水平明显降低；亚临床甲减组母鼠血清TSH水平升高，而FT4水平仍在正常范围内，符合相应疾病的特征，为后续研究提供了可靠的模型基础。仔鼠血清甲状腺激素水平异常：妊娠期甲减和亚临床甲减均导致仔鼠血清甲状腺激素水平出现异常。妊娠期甲减组仔鼠血清TSH水平显著高于正常对照组，FT4和游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）水平明显低于正常对照组；亚临床甲减组仔鼠血清TSH水平高于正常对照组，FT4和FT3水平低于正常对照组。这表明妊娠期甲状腺功能异常会对仔鼠甲状腺功能产生明显影响，且这种影响在出生后持续存在。仔鼠脑海马Bcl-2和Bax表达改变：妊娠期甲减和亚临床甲减均对仔鼠脑海马组织中Bcl-2和Bax的表达产生显著影响。免疫组化和WesternBlotting结果显示，妊娠期甲减组仔鼠脑海马组织中Bcl-2蛋白的阳性表达明显减弱，表达量显著降低；Bax蛋白的阳性表达显著增强，表达量显著升高。亚临床甲减组仔鼠脑海马组织中Bcl-2