多囊肾病的基因治疗进展

最新：多囊肾病的基因治疗进展

多囊肾病(polycystickidneydisease,PKD)是一种遗传性疾患，其典

型特征为肾脏内部形成大量囊肿，这些囊肿随时间增长而逐渐恶化，严重

影响肾功能［l］oPKD按遗传模式分为两种类型：常染色体显性多囊肾

病(autosomaldominantpolycystickidneydisease,ADPKD)和常

染色体隐性多囊肾病(autosomalrecessivepolycystickidneydisease,

ARPKD)°ADPKD是比较常见的形式,其发病率约为1/1500〜1/1000,

我国约有120万ADPKD患者，症状通常在成年期出现［2］;而ARPKD

相对较罕见，其发病率约为1/2。000,多在婴幼儿期显现。除了肾脏损

害外，PKD还可能影响身体其他部位，包括肝脏、胰腺及心血管系统［2］。

目前，对PKD的治疗主要集中在缓解症状和延缓疾病进展，尚缺乏根治

性治疗方法［3］o托伐普坦(tolvaptan),作为一种选择性血管升压素

V2受体拮抗剂，是目前唯一获批可减缓ADPKD患者肾体积增加和肾功

能恶化速度的药物。然而，由于其可能引起多尿和肝酶升高等不良反应，

因此患者需要在医师指导下谨慎使用［4］o近年来，基因编辑技术和分子

生物学的快速进展，为PKD尤其是ADPKD的治疗提供了新的希望。基

因治疗，尤其是针对致病基因的直接修正或调节，为根木解决PKD的致

病因素提供了可能性。本综述将深入探讨基因治疗在ADPKD和ARPKD

研究及治疗中的最新进展，包括其潜在的治疗价值、面临的挑战及未来发

展方向。

一、PKD相关基因

PKD的遗传学基础揭示了其复杂的病理生理过程。引起ADPKD的两个

主要基因分别为Pkdl和Pkd20Pkdl位于第16染色体短臂(16pl3.3)

区域，该区域还存在6个假基因，且G-C含量高，这给基因突变检测带

来很大困难。Pkd2位于第4染色体长臂(4q22-23)o在ADPKD病例

中，由Pkdl和Pkd2基因突变弓1起的分别占78%和15%[5]o值得注

意的是，仍有7%的ADPKD家系未检出Pkdl和Pkd2突变。Pkdl巨

大的基因长度和46个外显子构成了编码多囊蛋白1(polycystin-1,PC1)

的基础。PC1具有4303个氨基酸残基，是一种与钙信号传导紧密相关

的蛋白质，对维持肾小管上皮细胞的极性和功能至关重要。Pkd2基因则

位于4q22.1,编码多囊蛋白2,与PC1协同作用，参与细胞的钙调节过

程。这两个基因的突变会导致相关蛋白的功能丧失，进而影响细胞的增殖、

分化以及液体的分泌，最终促使囊肿的形成并导致肾功能逐渐衰竭。Pkdl

基因的突变点广泛分布于其编码区的各个区域，加剧了ADPKD的遗传异

质性。梅奥PKD基因数据库(https://pkdb.mayo.edu/)目前已报

道2077个家系的2322种Pkdl突变，和462个家系的278种Pkd2

突变。上海长征医院肾内科对98个中国ADPKD家系进行突变分析，共

检测到93个致病突变，其中85个位于Pkdl、8个位于Pkd2;在这93

个突变中，55个(59.1%)为首次报道的新突变[6]。随后长征团队又

对我国44个ADPKD家系的Pkd2基因变异体进行了全面的搜索，共鉴

定出37个变异，首次报道11个突变：其中包括18个无义突变、10个

移码突变、4个错义突变和5个剪接位点突变[7]o

ARPKD主要由PKHD1基因突变引起，该基因位于6pl2.2,编码纤维

囊蛋白。尽管PKHD1基因的突变机制不同于ADPKD的Pkdl和Pkd2,

其致病过程也涉及肾脏细胞信号传导的异常和肾脏结构的变化。一项研究

报道，在78例ARPKD患者中鉴定出了77种PKHD1基因突变（包括

41种新突变）[8]o

随着高通量基因测序技术的应用，研究人员发现了更多与ADPKD和

ARPKD相关的新突变基因，如GANAB和DNAJB11,这些发现进一步

丰富了我们对PKD遗传异质性的理解。GANAB基因的突变可导致

ADPKD的非典型表现，而DNAJBU的发现揭示了内质网应答在PKD

发展中的作用[5],为个性化医疗和精准治疗提供了新的视角和可能性。

这些基因的发现不仅加深了我们对PKD发病机制的认识，也为开发针对

性的基因治疗策略提供了重要的靶点。

二、基因治疗的分类

基因治疗，作为一种通过引入、删除或替换基因来治疗或预防疾病的前沿

方法，随着科技的发展，已从理论概念阶段迈向实践应用阶段，成为了现

代医学研究的重要领域。根据其作用机制和应用目标的不同，基因治疗主

要分为以下几类：（1）替换疗法：最直观的基因治疗方式，通过将正常基

因插入患者细胞中，替换或补充功能缺失或异常的基因，从而恢复细胞的

正常功能，主要应用于由单一基因缺陷引起的遗传性疾病。（2）敲除疗法：

利用技术手段禁用或“敲除”特定的致病基因，阻止疾病的发展，常用于

治疗基因过度表达或突变引起的疾病，如某些癌症类型。成簇规律间隔短

回文重复序歹(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromic

repeats,CRISPR)及其关联蛋白9(CRISPR-associatedprotein9,

CRISPR-Cas9）技术的出现为这种治疗提供了强有力的工具。（3）修复

疗法：侧重于直接修正基因突变，恢复其正常功能。（4）增强疗法：通过

向细胞内引入特定基因来增强细胞的某种功能，而不是替换或修复突变基

因。这种疗法适用于治疗某些代谢疾病，其原理是通过添加新基因来增加

缺失或不足的酷或蛋白。（5）RNA干扰疗法：利用小RNA分子抑制特定

基因表达的技术，通过降低疾病相关基因的表达水平来治疗疾病，在癌症

治疗和遗传性疾病中显示出巨大的潜力。每种基因治疗方法都有其特定的

应用领域，并在实践中面临多方面的挑战，这主要包括安全性、递送效率

和治疗持久性。

研究人员开发出各种技术，如病毒载体和CRISPR-Cas9技术[9],以更

有效地将治疗基因递送到靶细胞中。CRISPR-Cas9技术的兴起为基因编

辑领域带来了革命性的进展和希望。通过设计特定的导向RNA指导Cas9

酶精确切割DNA特定序列，随后激活细胞自身的DNA修复机制，从而实

现对特定基因的精确编辑。在生命科学领域，CRISPR-Cas9技术不仅改

变了基因操作的方式，还为基因编辑及其应用提供了无限的可能性，目前

已被广泛应用于构建PKD模型和疾病模型的基因治疗研究中。递送基因

的载体包括病毒载体和非病毒载体，病毒载体最常见使用的有腺病毒、腺

相关病毒（adeno-associatedvirus,AAV）以及逆转录病毒等。非病毒

递送方法包括脂质纳米颗粒、电穿孔以及其他纳米颗粒等。AAV载体以其

低毒性、低免疫原性、稳定的基因表达、易于制备和低成本等特点，成为

基因治疗载体的首选。与逆转录病毒载体相比，AAV载体避免了基因整合

引起的风险，为基因治疗提供了重要的工具[10]o

三、基因治疗的临床研究重要进展

基因治疗领域的首次临床试验于20世纪90年代由美国国立卫生研究院

的Anderson领头开展，这一里程碑的事件标志着这一技术从理论探索走

向人类应用的重大突破。在这项开创性的试验中，通过逆转录病毒载体，

转基因自体T细胞被输注入2例患有腺甘脱氢酶缺乏引起的严重联合免疫

缺陷病的年轻女孩[15]o尽管这一尝试面临诸多挑战，如传递机制的优

化、免疫反应的管理以及基因转移效率的提高等，但无疑为该领域奠定了

坚实的基础。此后，随着科技的进步，多种基因治疗方法相继获得了监管

机构批准并投入市场，为众多先前难以治疗疾病患者带来了新的希望。例

如，2017年批准用于治疗遗传性失明的Luxturna[11],以及2019年

批准用于治疗脊髓性肌萎缩症的Zolgensma[16],均是值得注意的成功

案例。

在基因治疗载体的选择上，AAV因其低免疫原性、稳定的基因表达及良好

的安全性记录而成为理想选择。最近，一个针对遗传性耳聋的全球首次临

床试验展示了使用携带OTOF基因的AAVl-hOTOF载体治疗常染色体

隐性耳聋9型患者的安全性和有效性[13]。此外，在肾小球肾炎治疗领

域，针对NPHS2基因突变的AAV基因治疗策略显示出潜在的应用价值。

具体而言,研究团队利用AAV-LK03载体成功地在体外传导人类足细胞，

并通过特异性启动子驱动NPHS2基因的表达，进一步在体内通过AAV

血清型2/9对模型小鼠进行了治疗，在疾病的不同阶段有效地靶向足细胞,

显著降低了模型小鼠的尿白蛋白水平，缓解了疾病进展[12]。这些研究

进展不仅展现了基因治疗在多种疾病治疗中的潜力，也凸显了继续探索和

优化治疗策略的必要性，以便为更广泛的病患群体带来希望和改善。在名

为FACTs的Fabry病基因治疗临床试验中(,

NCT02800070),首次尝试了通过体外重组慢病毒介导的a-半乳糖甘酶A

cDNA基因转移来治疗Fabry病［14］。该试验利用基因转移技术，将经

过基因修饰的自体造血干/祖细胞重新输回患者体内口4］。首位患者于

2017年1月接受了这种一次性的治疗，迄今为止，所有参与试验的Fabry

病患者均未出现严重不良事件［14］。持续两年的研究结果显示，治疗后

患者体内/半乳糖苜酶A活性显著提高，血浆和尿液中的酶底物及代谢产

物有所减少，说明经过基因修饰的造血干/祖细胞能持续产生a-半乳糖首

酶A［14］0

四、PKD基因治疗的临床前和临床研究

(一)ADPKD的基因治疗

1.反义寡核甘酸(antisenseoligonucleotides,ASO)治疗：在PKD

的复杂发病机制中，异常表达的非编码RNA,尤其是微小RNA(miRNA,

miR),扮演着关键角色。miRNA通过调控特定的蛋白质编码基因的表达,

影响细胞的功能。近期研究强调了miRNA在抑制囊肿形成中的关键作用，

提出了利用miRNA作为治疗ADPKD的新策略。例如，miR-17-5P可

通过特异性靶向Pkdl和Pkd2基因，以及调控转录因子肝细胞核因子-1

来影响PKD进程，导致肾囊肿的增多以及miR-200家族表达的下调

［17-18］。在ADPKD模型中，降低RNA解旋酶p68的表达可以减少

特定miRNA的成熟，进而抑制囊肿的形成［19］。此外，针对PKD过度

表达的转录因子调节miRNA的研究也展示了通过调整miRNA表达来防

止囊肿形成的可能性[20]o

既往研究发现，miR-17的表达水平在人和鼠型ADPKD中上调，且

miR-17可与Pkdl和Pkd2基因的3'UTR区域结合并抑制它们的表达。

故针对miR-17序列，研究人员设计出了抗miR-17的ASO——

RGLS4326[21]oASO是经化学修饰的单链寡核甘酸，能够抑制miRNA

并下调目标mRNA及蛋白质的表达。RGLS4326是一种单链、化学修饰

的9-nt短寡核昔酸，与miR-17序列完全互补。RGLS4326处理后的人

ADPKD供体原代囊肿培养物中，PC1和多囊蛋白2的表达均明显升高,

且可以明显减缓体外囊肿的生长。在Pkd2-KO（Pkd2敲除模型）、

Pcy/CDl（Pkdl突变CD-I小鼠）、Pcy/DBA（Pkdl突变DBA小鼠）

等多个PKD小鼠模型中，RGLS4326治疗组小鼠的肾重体重比、囊肿指

数与对照组相比均有明显下降。此外，与对照组的肾脏整体基因表达谱相

比，RGLS4326对治疗组Pkd2-KO、Pcy/CDl两种模型肾脏中的

miR-17靶基因有全面去阻遏效应，尤其可对Pkdl和Pkd2实现去阻遏

[21]o且RGLS4326对miR-17靶基因的去阻遏效应不限于集合管细

胞，在正常小鼠和PKD小鼠以及离体小鼠肾切片培养物中，对近端小管、

远端小管和集合管来源的6种不同肾细胞系均有作用[21]。体内药代动

力学显示，野生型小鼠单次皮下注射30mg/kgRGLS4326后，

RGLS4326可优先分布于肾小管和肾囊肿[22]。

安全性方面，由于RGLS4326含有2，-脱氧-2二氟核甘，可能抑制DNA

修复并诱导线粒体毒性。然而，在猴和CD1小鼠的实验中，给药后其心

脏和肝脏组织中未观察到线粒体毒性，并且对造血细胞群和肾功能均无不

利影响［22］O此外，由于RGLS4326在高剂量下对中枢神经系统AMPA

受体存在潜在毒性，促使研究人员开发了RGLS8429,其具有类似的疗

效但不影响AMPA受体［23］。该药物已获美国食品药品监督管理局批准，

于2022年第二季度启动了一项I期临床试验(,

NCT05429073),目前该试验正处于进行阶段。

2.通过腺病毒载体敲低晚期糖基化终产物受体(receptorofadvanced

glycationendproduct,RAGE)以抑制ADPKD小鼠囊肿发生：RAGE

是一种跨膜受体，已有研究表明RAGE介导胞内信号转导通路的激活，参

与炎性反应，并促进细胞增殖和生存相关信号的传导［24］。研究者们通

过腺病毒载体将抗RAGE的短发夹RNA转导入ADPKD小鼠体内，证实

了RAGE基因下调的ADPKD小鼠肾脏大小、囊肿生成及肾功能均得到

改善［24］。这些结果提示，RAGE相关的信号通路与PKD的发病机制

密切相关。RAGE基因可能成为PKD的一个新的潜在治疗靶点。

3.Pkdl基因增强疗法：先前的研究提示Pkdl的表达水平降低到一个临

界阈值以下即可导致肾囊肿的形成及其他ADPKD临床症状［25］。

Kurbegovic等［26］发现将全长基因组Pkdl构建至ijPkdl失活小鼠模

型中可挽救因Pkdl缺失而受损的小鼠。引入的高拷贝数的肾靶向基因

SBPkdl及PkdlMinigene显示出与内源性Pkdl基因相似的表达水平，

能够在小鼠体内产生功能性的PC1蛋白，从而延缓甚至消除肾囊肿的形

成，并将延长寿命至4倍以完全挽救PKD小鼠。这些证据为第一代Pkdl

基因转移用于基因增强治疗提供了理论支持。对于PC1表达减少的PKD

患者来说，基因增强治疗方法可能是一种更有前景、更合适的治疗策略。

4.通过Pkdl突变的诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,

iPSCs)的自发基因修复行为来治愈ADPKD:ADPKD的治疗研究中，

iPSCs技术展现出了潜在的革命性前景。iPSCs技术是一种通过将个体的

体细胞进行表观遗传重新编程，转换成干细胞，从而使科学家可以研究特

定遗传突变的影响及其可能的修复方法。研究发现，通过自发的有丝分裂

重组，携带Pkdl基因突变的iPSCs可以实现遗传修复，即从Pkdl(+/・)

状态转变为修复后的Pkdl(+/R+)状态［27］。这种遗传修复后的iPSCs

在基因型上与健康细胞无明显差异［27］。更进一步的研究表明，含有修

复后Pkdl基因(+/R+)的iPSCs衍生的成年嵌合小鼠，其肾脏囊肿形

成的频率显著低于含有原始Pkdl(+/-)突变的iPSCs衍生的小鼠，且

与正常小鼠无明显差异［27］O这为ADPKD等遗传疾病提供了一种新的

治疗途径，即通过有丝分裂重组介导的基因修复来纠正遗传缺陷。这项研

究不仅揭示了iPSCs在理解和治疗ADPKD中的潜力，也为将来临床上

应用人类iPSCs开辟了新途径。通过精确纠正遗传突变，我们可能为

ADPKD患者提供更有效、更个性化的治疗选项。

5.胚胎植入前基因检测(preimplantationgenetictesting,PGT)阻

断ADPKD遗传：PGT是一种产前基因诊断，可以早期识别异常胚胎。

PGT结合铺助生殖技术(assistedreproductivetechnology,ART)程

序可以使患者获得遗传正常的胚胎。1992年报道了PGT联合体外受精的

成功应用［28］o此后，该技术被逐步应用于多种遗传性疾病中。我们的

既往调查研究表明，有生育意愿的患者约占总体适龄ADPKD人群的

45.0%,其中大部分患者(79.6%)愿意使用PGT技术［29］。近年来，

随着新的全基因组扩增方法多次退火环状循环扩增的发展，单细胞检测

PKD突变的灵敏度大幅提高，有效保证了PGT的准确性。我们于2015

年首次对一对ADPKD夫妇使用了多次退火环状循环扩增・PGT联合

ART,并于2016年成功出生1例健康婴儿［30］。为进一步探讨ADPKD

患者使用PGT联合ART的有效性、安全性及对子代的长期影响，我们组

织并实施了1项长期随访的多中心临床队列研究［31］。该研究

（ESPERANCE）已在（NCT02948179）中注册并

于2023年完成。在该研究中，全国27家三甲医院54个科室（肾内科

与生殖医学中心联合）共纳入711例ADPKD患者进行遗传咨询。其中

459例患者同意接受Pkdl/2基因测序分析。在这459例患者中，共检

测出Pkdl突变388例。经知情谈话，53对夫妇自愿选择进入PGT阻断

遗传组。其中，6对夫妇进入PGT流程，但婴儿未活产；另外6对夫妇

因拒绝进行胎儿羊水及脐带血验证而退出；41对夫妇完成PGT流程，共

活产婴儿42例。此外，还有31对夫妇自愿选择进入对照组，共生育34

例婴儿（其中3对夫妇生育2例婴儿）。研究表明,PGT可有效阻断ADPKD

的遗传，技术成功率接近100%,且无显著不良事件。尽管是否选择PGT

取决于ADPKD患者的个人决定，我们仍然建议PGT应作为遗传咨询中

的优先生殖选项，在具有生育意愿的ADPKD患者中广泛推广应用。这项

技术有望减少全球ADPKD患者，大幅降低家庭及社会的医疗负担，使出

生人口素质越来越高。

（二）ARPKD的基因治疗

1.ASO治疗ARPKD:在ARPKD的治疗研究中，ASO技术同样展示了

很大的潜力。ASO通过介导mRNA剪切的修正，特别针对PKHD1基因

中约7.7%的剪接变异，为治疗由剪接缺陷引起的ARPKD提供了一种新

途径。这种技术能够纠正异常的基因剪接事件，增加正常PKHD1基因的

表达，为治疗剪接缺陷导致的ARPKD开辟了新的可能性［32］。研究发

现，通过使用针对c-myc的ASO处理ARPKD小鼠模型，能够有效改善

疾病症状［33］o肾脏c-mycmRNA的表达增强不仅在啮齿类的PKD动

物模型中观察到，也在人类PKD患者中得到了证实［34］。这些发现提示

c-myc在PKD囊肿形成中存在关键作用，ASO靶向c-myc可能为一种

潜在的新治疗策略。

2.CRISPR-Cas9敲除P2rx7基因延缓肾脏囊肿生长：早期实验揭示了

P2X受体，尤其是P2X7为PKD肾脏囊肿形成中的关键角色。在ARPKD

和ADPKD模型小鼠中，囊性上皮细胞中的P2X7受体蛋白表达水平显著

升高［35-36］oPannexin-1(PANX-1)血清泛连接蛋白是一种能够

释放ATP的离子通道，在囊性上皮细胞中的表达显著高于正常小管上皮细

胞。P2X7信号的激活可以促使血清泛连接蛋白-1介导的ATP释放到腔

内，同时减少囊肿壁的钠重吸收，最终导致囊肿上皮细胞的过度增殖［36］。

利用CRISPR-Cas9技术，Arkhipov等［37］对ARPKD大鼠模型进

行了P2rx7基因的全局敲除，研究发现，敲除P2rx7基因后的ARPKD

大鼠相比于携带P2rx7基因的对照组，囊肿生长速度显著减慢。这一发现

表明，靶向P2rx7可能为PKD治疗开辟了新的路径。

五、挑战与前景

尽管基因编辑和RNA干扰技术在实验室研究中显示出巨大的潜力，但将

这些技术转化为安全、有效的临床治疗手段仍面临重大挑战。技术上的挑

战主要包括提高编辑效率、确保编辑的精确性以减少脱靶效应，以及开发

高效的递送系统以确保治疗分子能够达到并进入目标细胞。例如，miRNA

疗法的开发面临包括改进药物递送机制和分子稳定性的技术限制。如何有

效地将治疗基因递送到肾脏是当前基因治疗研究的一大挑战，现有的基因

治疗