非洲猪瘟病毒基因ⅠⅡ型重组毒株、基因Ⅰ型弱毒株和基因Ⅱ型毒株鉴别三重荧光PCR检测方法

ICS11.220

CCSB41

团体标准

T/CVMAXXXXX—XXXX

非洲猪瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重组毒株、基因

Ⅰ型弱毒株和基因Ⅱ型毒株鉴别三重荧光

PCR检测方法

AfricanSwineFeverVirusTriplexFluorescencePCRKitfor

DifferentiatingGenotypeⅠandⅡRecombinantStrain,GenotypeⅠLow

VirulentStrainandGenotypeⅡStrain

征求意见稿

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

中国兽医协会发布

T/CVMAXXXXX—XXXX

非洲猪瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重组毒株、基因Ⅰ型弱毒株和基因Ⅱ型毒

株鉴别三重荧光PCR检测方法

1范围

本文件规定了非洲猪瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重组毒株、基因Ⅰ型弱毒株和基因Ⅱ型毒株鉴别的荧光PCR检

测方法技术要求。

本文件适用于猪血清、组织、口腔拭子、肛门拭子等样品中的非洲猪瘟病毒核酸检测及基因Ⅰ/Ⅱ型

重组毒株、基因Ⅰ型弱毒株和基因Ⅱ型毒株的鉴别诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4符号和缩略语

下列缩略语适用于本文件。

实时荧光PCR：实时荧光聚合酶链式反应（Real-timefluorescencepolymerasechainreaction）

ASFV：非洲猪瘟病毒毒（Africanswinefevervirus）

BHQ：无荧光淬灭基团（Blackholequencher）

Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（Cyclethreshold）

DEPC：焦炭酸二乙酯（diethypyrocarbonate）

DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

FAM：羧基荧光素（Carboxyfluorescein）

HEX：六氯-6-甲基荧光素（Hexachlorofluorescein）

PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid）

ROX：无活性荧光参考染料（Carboxy-X-rhodamine）

1

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CY5：花青素荧光染料（Cyanine5）

Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApoiymerase）

TEBuffer：Tris-EDTA缓冲液（Tris-EDTAbuffersolution）

5试剂

5.1提取试剂

选取商品化的病毒DNA与RNA共提取试剂盒并参照说明书进行核酸提取。

5.2扩增试剂

选取商品化的Taq酶扩增试剂盒并参照说明书进行配液与扩增。

5.3引物探针

本方法使用引物、探针信息见表1。

表1引物、探针信息表

检测靶标名称序列

B646L-F15’-TGGTATTCCTCCCGTGGC-3’

B646LB646L-R15’-TGCAGCTCTTACATACCCTTCC-3’

B646L-Probe1FAM-5’-CCGATGATCCGGGTGCGAT-3’TAMRA-N

X64R-F15’-GGTTCCAAAACAATATTGGCC-3’

X64RX64R-R15’-TATTTCACATCCGTGGCATCT-3’

X64R-Probe1VIC-5’-ATGGCTTACATGGTATATAC-3’-MGB

MGF-F15’-AGGATTTTAGGTTGGCCACT-3’

MGF_360-1

MGF-R15’-CGGCTGTGTGCGGAACT-3’

4L

MGF-Probe1CY5-5’-CAGAAGACGGGGTTCGGATACA-3’-BHQ2

IC-F15’-TGGTACATGGCGGCGAAT-3’

IC-GIC-R15’-TCGGCGAGAAGCTGATGTCT-3’

IC-P-ROXROX-5’-ACAGCATCCAGGGCCATTCAGATGTC-3’-BHQ2

5.4阳性对照及阴性对照

阳性对照的制备见附录A.1。

阴性对照的制备见附录A.2。

5.5其它试剂

dNTPMixture（2.5mMeach），Lyo-TaqStorageBuffer，1×TE缓冲液，DEPC处理水均为商品化产品，

PBS的制备见附录A.3。

2

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6仪器和耗材

超净工作台、离心机、电脑、实时荧光PCR仪及配套反应管（板）、组织研磨器、-20℃冰箱、微

量移液器（0.5～10μl，5～50μl，20～200μl，100～1000μl），移液器吸头（10μl，200μl，1000μl），1.5ml

无菌离心管，无菌注射器等。

7操作步骤

7.1样品采集

7.1.1血清样品采集：用无菌注射器抽取受检猪静脉血5ml，置于无菌离心管内，室温或者37℃倾斜

放置自然凝集20～30min，2000～3000r/min离心10min，分离血清装入新的离心管中，密封后冷藏或冷

冻保存。

7.1.2组织样品采集：采集受检猪的组织样品，首选脾脏，其次为淋巴结等。脾脏采集约3cm×3cm大

小，淋巴结选取出血严重的整体采集，将所采集样品放入50%甘油-PBS保存液中，密封后冷藏或冷冻

保存。

7.1.3口腔拭子样品采集：用医用棉签在口腔转动至少3次，采集口腔分泌物；蘸取分泌物后，立即

将拭子浸入1ml50%甘油-PBS保存液中，剪去露出部分，盖紧离心管盖，密封后冷藏或冷冻保存。

7.1.4肛门拭子样品采集：用棉拭子深入直肠，转圈，蘸取到粘液，立即将拭子浸入1ml50%甘油-PBS

保存液中，剪去露出部分，盖紧离心管盖，密封后冷藏或冷冻保存。

7.2样品保存与运输采集的样品可立即用于检测。不能立即检测的样品，2～8℃保存应不超过24h。

-20±5℃下应不超过3个月，-70℃以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行运输，并在规定温度下

的保存期内送达。

7.3样本处理及核酸提取

7.3.1血清样品：无需进行前处理，直接用于核酸提取。

7.3.2组织样品：取待检组织样品约1g剪碎置于灭菌的组织研磨器中充分研磨，加入PBS混匀制备

10%组织匀浆液，3000r/min离心15min，取上清用于核酸提取。

7.3.3口腔拭子样品、肛门拭子样品：充分涡旋震荡含有口腔拭子的管子30s，尽力挤压拭子后，

3000r/min离心1min，取上清用于核酸提取。

7.3.4处理后的样本使用市售商品化病毒DNA与RNA共提取试剂盒提取病毒核酸，提取步骤严格参

照说明书。

8荧光PCR检测

8.1反应液配制（试剂准备区）根据检测样品数量n（n=待测样品数+阴性对照数+阳性对照数），按

下表每1反应配比，配制n+1个反应用量，最后充分混匀，瞬时离心，定量（20µl/管）分装至PCR反

应管中盖上PCR反应管盖，转移至样本处理区备用。A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反应液的制备见附录A.4，

A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液的制备见附录A.5，A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-内标的制备见附录A.6。

3

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表2反应液配制

组分体积(µl)/反应

A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反应液18.50

A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液1.00

A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-内标0.50

8.2加样（样本处理区）待测样品提取核酸、阴性对照和阳性对照各5µl，分别加入对应PCR反应

管，盖好管盖，转移至扩增区。

8.3荧光PCR扩增（PCR扩增区）（1）开机预热并检验仪器性能。（2）将PCR反应管放入扩增仪检

测孔内，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待检样本名称；按下表设置相关参数，进行荧光PCR

扩增。

体系反应体系设为25µl

信号采集FAM、HEX/VIC、ROX、CY5通道采集荧光信号

阶段条件循环数

预变性95℃：2min1

反应条件

变性95℃：15s

40

退火，延伸，荧光采集60℃：30s（此阶段结束时采集荧光信号）

9判定

9.1合理调整阈值线，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。

9.2试验成立的条件

对照名称FAM通道HEX/VIC通道CY5通道ROX通道

Ct值＞38.00或无Ct值＞38.00或无Ct值＞38.00或无

Ct值≤35.00,呈

阴性对照Ct值，无典型扩增Ct值，无典型扩增Ct值，无典型扩增

典型扩增曲线

曲线曲线曲线

Ct值≤38.00，呈Ct值≤38.00，呈典Ct值≤38.00,呈典Ct值≤35.00,呈

阳性对照

典型扩增曲线型扩增曲线型扩增曲线典型扩增曲线

9.3结果判定

FAM通道HEX/VIC通道CY5通道ROX通道结果判定

Ct值≤38.00，呈典Ct值≤38.00，呈典型Ct值≤38.00，呈典Ct值≤35.00,呈典

Ⅰ/Ⅱ型重组毒株

型扩增曲线扩增曲线型扩增曲线型扩增曲线

Ct值≤38.00，呈典Ct值≤38.00，呈典型Ct值＞38.00或无Ct值≤35.00,呈典

Ⅰ型弱毒株

型扩增曲线扩增曲线Ct值，无典型扩增型扩增曲线

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曲线

Ct值＞38.00或无

Ct值≤38.00，呈典Ct值≤35.00,呈典

Ct值，无典型扩增任意值Ⅱ型毒株

型扩增曲线型扩增曲线

曲线

Ct值＞38.00或无Ct值＞38.00或无Ct值＞38.00或无

Ct值≤35.00,呈典非洲猪瘟病毒

Ct值，无典型扩增Ct值，无典型扩增Ct值，无典型扩增

型扩增曲线阴性

曲线曲线曲线

Ct值＞35.00或无

任意值任意值任意值Ct值，无典型扩增结果无效*a

曲线

注：*a无效结果，应查找并排除原因,并对此样本进行重复实验。

10实验室生物安全要求

10.1本方法涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操作应在(动物)生物安全三级试验室中进行，实验室生物

安全管理要求见GB19489。国家农业行政主管部门另有规定的，按其规定执行。

10.2使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后废弃。剩余样品

等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废弃。

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附录A

（规范性）

阳性对照、阴性对照及荧光PCR主要反应组分

A.1阳性对照

扩增非洲猪瘟病毒HLJ/18株B646L基因全长(1941bp)，序列参见附录B.1，将非洲猪瘟病毒B646L基

因全长(1941bp)连接于pCAGGS载体，构建重组质粒pCAGGS-3P；扩增非洲猪瘟病毒SD/DY-I/21株X64R

基因全长及其两端序列(963bp)，序列参见附录B.2，将非洲猪瘟病毒X64R基因全长及其两端序列(963bp)

连接于pCAGGS载体，构建重组质粒pCAGGS-3X；扩增非洲猪瘟病毒JS/LG/21株MGF_360-14L基因全

长及其两端序列(1321bp)，序列参见附录B.3，将非洲猪瘟病毒MGF_360-14L基因全长及其两端序列

(1321bp)连接于pCAGGS载体，构建重组质粒pCAGGS-3M；用1×TE缓冲液将重组质粒pCAGGS-3P、

pCAGGS-3X、pCAGGS-3M稀释至分别约104copies/µl，保存于-20℃备用。pCAGGS载体质粒图谱及序

列参见附录B.4。

A.2阴性对照

阴性对照为DEPC处理水。

A.3PBS（0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4）

PBS（0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4）配方见表A.3

试剂用量

氯化钠（NaCl）8.00g

氯化钾（KCl）0.20g

磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.44g

磷酸二氢钾（KH2PO4）0.24g

蒸馏水加至1000mL

将上述成分依次溶解，用盐酸（HCl）调pH至7.4，高压灭菌，4℃保存备用。

A.4A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反应液

A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反应液配方见表A.4

表A.4A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反应液配方

组分体积(µl)/反应

DEPC处理水4.625

10×HABuffer2.50

5×ProbeqPCRBuffer5.00

dNTPMixture（2.5mMeach）2.00

B646L-F1（10µM）0.50

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组分体积(µl)/反应

B646L-R1（10µM）0.50

B646L-Probe1（10µM）0.25

X64R-F1（10µM）0.50

X64R-R1（10µM）0.50

X64R-Probe1（10µM）0.25

MGF-F1（10µM）0.50

MGF-R1（10µM）0.50

MGF-Probe1（10µM）0.25

IC-F1（10µM）0.25

IC-R1（10µM）0.25

IC-P-ROX（10µM）0.125

Total18.50

A.5A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液

A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液配方见表A.5

表A.5A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液配方

组分体积(µl)/反应

HighAffinityHotStartTaq(5U/µl)0.25

Lyo-TaqStorageBuffer0.75

A.6A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-内标

人工合成一段随机DNA片段（67bp）作为内标序列片段，序列参见附录B.5，将合成的内标序列片

段（67bp）连接于pUC57载体，构建重组质粒pUC57-IC-G；用1×TE缓冲液将重组质粒pUC57-IC-G稀释至

约104copies/µl，保存于-20℃备用。pUC57载体质粒图谱及序列参见附录B.6。

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附录B

（资料性）

非洲猪瘟病毒B646L基因、X64R基因、MGF_360-14L基因、内标及相关载体质粒序列

B.1非洲猪瘟病毒HLJ/18株B646L基因全长(1941bp)

非洲猪瘟病毒HLJ/18株(GenBank：MK333180.1)基因组103,618-105,558bp

genecomplement(103618..105558)

/gene="B646L"

CDScomplement(103618..105558)

/gene="B646L"

/codon_start=1

/product="B646L"

/protein_id="QBH90570.1"

/translation="MASGGAFCLIANDGKADKIILAQDLLNSRISNIKNVNKSYGKPDPEPTLSQIEETHLVHFNAHFKPYVPVGFEYN

KVRPHTGTPTLGNKLTFGIPQYGDFFHDMVGHHILGACHSSWQDAPIQGTSQMGAHGQLQTFPRNGYDWDNQTPLEGAVYTLVDPFGRP

IVPGTKNAYRNLVYYCEYPGERLYENVRFDVNGNSLDEYSSDVTTLVRKFCIPGDKMTGYKHLVGQEVSVEGTSGPLLCNIHDLHKPHQ

SKPILTDENDTQRTCSHTNPKFLSQHFPENSHNIQTAGKQDITPITDATYLDIRRNVHYSCNGPQTPKYYQPPLALWIKLRFWFNENVN

LAIPSVSIPFGERFITIKLASQKDLVNEFPGLFVRQSRFIAGRPSRRNIRFKPWFIPGVINEISLTNNELYINNLFVTPEIHNLFVKRV

RFSLIRVHKTQVTHTNNNHHDEKLMSALKWPIEYMFIGLKPTWNISDQNPHQHRDWHKFGHVVNAIMQPTHHAEISFQDRDTALPDACS

SISDISPVTYPITLPIIKNISVTAHGINLIDKFPSKFCSSYIPFHYGGNAIKTPDDPGAMMITFALKPREEYQPSGHINVSRAREFYIS

WDTDYVGSITTADLVVSASAINFLLLQNGSAVLRYST"

B646L基因全长序列

ATGGCATCAGGAGGAGCTTTTTGTCTTATTGCTAACGATGGGAAGGCCGACAAGATTATATTGGCCCAAGACTTGCTGAATAGCAGGAT

CTCTAACATTAAAAATGTGAACAAAAGTTATGGGAAACCCGATCCCGAACCCACTTTGAGTCAAATCGAAGAAACACATTTGGTGCATT

TTAATGCGCATTTTAAGCCTTATGTTCCAGTAGGGTTTGAATACAATAAAGTACGCCCGCATACGGGTACCCCCACCTTGGGAAACAAG

CTTACCTTTGGTATTCCCCAGTACGGAGACTTTTTCCATGATATGGTGGGCCATCATATATTGGGTGCATGTCATTCATCCTGGCAGGA

TGCTCCGATTCAGGGCACGTCCCAGATGGGGGCCCATGGGCAGCTTCAAACGTTTCCTCGCAACGGATATGACTGGGACAACCAAACAC

CCTTAGAGGGCGCCGTTTACACGCTTGTAGATCCTTTTGGAAGACCCATTGTACCCGGCACAAAGAATGCGTACCGAAACTTGGTTTAC

TACTGCGAATACCCCGGAGAACGACTTTATGAAAACGTAAGATTCGATGTAAATGGAAATTCCCTAGACGAATATAGTTCGGATGTCAC

AACGCTTGTGCGCAAATTTTGCATCCCAGGGGATAAAATGACTGGATATAAGCACTTGGTTGGCCAGGAGGTATCGGTGGAGGGAACCA

GTGGCCCTCTCCTATGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAAACCTATTCTTACCGATGAAAATGATACGCAGCGAACG

TGTAGCCATACCAACCCGAAATTTCTTTCACAGCATTTTCCCGAGAACTCTCACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCC

TATCACGGACGCAACGTATCTGGACATAAGACGTAATGTTCATTACAGCTGTAATGGACCTCAAACCCCTAAATACTATCAGCCCCCTC

TTGCGCTCTGGATTAAGTTGCGCTTTTGGTTTAATGAGAACGTGAACCTTGCTATTCCCTCAGTATCCATTCCCTTCGGCGAGCGCTTT

ATCACCATAAAGCTTGCATCGCAAAAGGATTTGGTGAATGAATTTCCTGGACTTTTTGTACGCCAGTCACGTTTTATAGCTGGACGCCC

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CAGTAGACGCAATATACGCTTTAAACCATGGTTTATCCCAGGAGTCATTAATGAAATCTCGCTCACGAATAATGAACTTTACATCAATA

ACCTGTTTGTAACCCCTGAAATACACAACCTTTTTGTAAAACGCGTTCGCTTTTCGCTGATACGTGTCCATAAAACGCAGGTGACCCAC

ACCAACAATAACCACCACGATGAAAAACTAATGTCTGCTCTTAAATGGCCCATTGAATATATGTTTATAGGATTAAAACCTACCTGGAA

CATCTCCGATCAAAATCCTCATCAACACCGAGATTGGCACAAGTTCGGACATGTTGTTAACGCCATTATGCAGCCCACTCACCACGCAG

AGATAAGCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCTTCCAGACGCATGTTCATCTATATCTGATATTAGCCCCGTTACGTATCCGATCACATTA

CCTATTATTAAAAACATTTCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACCCT

TCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATACCA

ACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACTACGGCTGATC

TTGTGGTATCGGCATCTGCTATTAACTTTCTTCTTCTTCAGAACGGTTCAGCTGTGCTGCGTTACAGTACCTAA

注：划线部分为质粒pCAGGS-3P构建用引物覆盖部分，加粗部分为非洲猪瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重组毒株、Ⅰ型弱毒株

和Ⅱ型毒株鉴别三重荧光PCR检测方法中FAM通道检测靶标（B646L基因）所使用引物、探针序列覆盖部分。

B.2非洲猪瘟病毒SD/DY-I/21株X64R基因全长及其两端序列(963bp)

非洲猪瘟病毒SD/DY-I/21(GenBank：MZ945537.1)基因组15,777-16,739bp

gene16113..16307

/gene="X64R"

CDS16113..16307

/gene="X64R"

/codon_start=1

/product="X64R"

/protein_id="UEN73189.1"

/translation="MLLYIVIIVAYVSYKLVPKQYWPILMFMAYMVYTHEKLDINERSGFWKYIIAKLFRCHGCEICK"

X64R基因全长及其两端序列

TGGTTTGCTGACTATTTGGAATTTATAGAAGCAAAAATAGATACTTTTACTAATAGCAGTGCATTATAAGTGATCAAAATTTAATATCT

CATAAAAAAGGTACACATCAACATCATTCATTTGTTTCATGATGTTTGATTCATTACTTTCTACAATCACTGGGGGGGGGGTCTCTCAT

AGCTTTAGTATTGCTATGGTTTACTAATTATTATGTAGAATTTATAGGAGCAGATATATATGGTGGTAATTGTACTCTATAAGTTTATA

AAAATTTCAGTATATTTTTTTTGTTAATATAACAGAAATGATTTAAATTACAAAAAAAAGAGAATCATCATGCTATTATACATTGTTAT

TATAGTAGCATATGTAAGTTATAAATTGGTTCCAAAACAATATTGGCCAATACTCATGTTTATGGCTTACATGGTATATACCCATGAA

AAATTAGATATAAATGAAAGATCCGGATTTTGGAAATATATTATAGCAAAACTATTCAGATGCCACGGATGTGAAATATGTAAGTGAT

ATTAAAAACATAATACGAAGTGTAATAATTGACTATTTTTTGTTGAATGGAAACTGTTTTTGAGTAATATGTTGAACATAATGGTTTTT

ATAGATGTTAAATCATTTGATTGTAGTAATTGTACTAAATGATGTGAGATATAAACCTAGTTCAATCAAAATTTAATTTTTTTATAAAA

AGCTACAGAGTGTTTTATTAAACGTAGCTTATTTAAAAAGTTACACAATGTTAAAATCTCTACTTACTTTAATTCTTTGTGGGGTTTTA

tTAACTTTATCCATATTATGGCTTATTACTTACCATGTAGAACTTATAGAAGCAATAGATGATTTCTACGACTGAAATATAGAATAGTT

CATTTTCTATTTGTAAAATAATGATTTATATTCTCTCCTAAAAATACGATCGATCCTTTATATGCTTTGAAAACG

注：划线部分为质粒pCAGGS-3X构建用引物覆盖部分，加粗部分为非洲猪瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重组毒株、Ⅰ型弱毒株和

Ⅱ型毒株鉴别三重荧光PCR检测方法中HEX/VIC通道检测靶标（X64R基因）所使用引物、探针序列覆盖部分。

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B.3非洲猪瘟病毒JS/LG/21株MGF_360-14L基因全长及其两端序列(1321bp)

非洲猪瘟病毒JS/LG/21株(GenBank：OQ504956.1)基因组27,272-28,592bp

genecomplement(27568..28431)

/gene="MGF_360-14L"

CDScomplement(27568..28431)

/gene="MGF_360-14L"

/codon_start=1

/product="MGF_360-14L"

/protein_id="WFS78480.1"

/translation="MLSLQTLAKKVVACNYLSSDYDYTLQRFGLWWDLGPIHLCNNCKQVFSYKHLQCFSEDDLCLEAALVKAVKSDNL

ELIRLFVDWGANPEYGLIRVPAVYLKRLCAELGGLTPVSEPRLLEILKEVARLKSCAGVLLGYDMFCHNPLLETVTRTTLDTVTYTCSN

IPLTGDTAHHLLTKFWFALALRHNFTKAIHYFYKRHKNHLYWRVACSLYFNNIFDIHELCREKEICISPNLMMKFACLREKNYAAIYYC

HRLGASLDYGMNLSIYNNNTLNMFFCIDLGGCRF"

MGF_360-14L基因全长及其两端序列

TAATAACGCTAGAAGGCTTGTTTATAAGACAGTCATAAGCAGTCTATAAGACAGTCTATAAGCAGTCTATAAGACAGTCTATGACTTAG

TCTATAACTATAATTTCTGGATGGGCTGTAAGATACTCTTCGGCTCGTTTCAGATTTTTTGAAGTATATGTCTTTAGCATATCATATAT

TTCCTGGGGTTCGGTTACATCTAATACCAAGGTCACATCACGGCTGAAAAGCTGCTTTACTAAGAAAATGTTGCTCAAGTTATACATAT

AAGCTTTGTGCGCAATGAGTTGTGCCCTATCAAAATCGGCAGCCCCCCAAATCAATACAGAAAAACATGTTTAAAGTATTATTGTTATA

GATAGAAAGATTCATGCCATAATCGAGACTAGCCCCCAACCTATGACAGTAATAAATGGCCGCGTAATTTTTTTCCCGCAAGCAAGCAA

ATTTCATCATCAGATTAGGGCTGATGCAAATCTCTTTTTCACGACACAACTCGTGTATGTCAAAAATGTTATTAAAATAAAGGCTACAA

GCTACCCGCCAATAGAGGTGATTTTTATGCCTTTTATAGAAATAGTGAATAGCCTTTGTAAAATTATGTCGTAATGCCAGGGCAAACCA

AAACTTTGTTAATAGGTGGTGCGCCGTATCCCCCGTCAACGGAATGTTTGAACAGGTGTACGTAACTGTGTCTAAAGTGGTTCTAGTTA

CGGTTTCCAAGAGTGGATTATGACAAAACATGTCATAACCCAGCAGAACTCCTGCACAGGATTTTAGCCTGGCCACTTCTTTTAAAAT

TTCCAGAAGACGGGGTTCGGATACAGGCGTTAAGCCTCCCAGTTCCGCACACAGCCGCTTTAGATACACGGCAGGAACACGTATAAGC

CCATATTCAGGATTTGCGCCCCAATCCACAAATAAACGTATAAGTTCAAGATTATCGCTCTTCACGGCCTTTACTAGCGCCGCTTCGAG

ACAAAGATCATCCTCAGAAAAACACTGTAAATGTTTATACGAAAAAACTTGCTTACAATTGTTACATAGGTGAATAGGACCTAAATCCC

ACCACAAACCAAAACGCTGCAACGTATAATCATAGTCACTTGAAAGATAATTGCATGCCACAACTTTTTTGGCCAACGTTTGTAAAGAC

AACATACTAAGTTTAAAACATCTTAAATCTAAGCTAGCTAACTTTCAAGAAAACCCTCTATCCCTAAGAATATATCTTATAACTAGACT

TATAGCAGTAAAAATCAACTTTGGTTATTCTTTTTAATATAAAACGTCTAATTACTTGCAAAGGACTATAAAGCCCA

注：划线部分为质粒pCAGGS-3M构建用引物覆盖部分，加粗部分为非洲猪瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重组毒株、Ⅰ型弱毒株和

Ⅱ型毒株鉴别三重荧光PCR检测方法中CY5通道检测靶标（MGF_360-14L基因）所使用引物、探针序列覆盖部分。

B.4pCAGGS载体质粒图谱及序列

质粒图谱

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T/CVMAXXXXX—XXXX

PropagationinE.coli

（1）克隆菌株：DH5α、TOP10、XL1-Blue等均可。

（2）原核抗性：Amp+，工作浓度建议为100ug/ml。

（3）培养温度：37℃。

DNA序列

GTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAA

CTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAAT

AGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGC

CCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATC

TACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAA

TTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGCCGCGCGCCAGCCGGGGCGGGGCGGGGCGA

GGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGC

GGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGC

CGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGT

TTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGG

GGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTT

TGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGC

GGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGA

GCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGC

11

T/CVMAXXXXX—XXXX

CGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGA

GCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGC

GCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGC

GCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCT

TCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTT

GTTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCGAGCTCATCGATGCATGGTACCCGGGCATGCTCGAGCTAGCAGATCTTTTTCCCTC

TGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTT

GGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCA

ACATATGCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTAT

TCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTA

CATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGAAGATCCCTCGACCTGCA

GCCCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGC

ATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCT

GTCGTGCCAGCGGATCCGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTC

CGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGT

GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCA

CAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCCGC

TGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCG

GTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACAT

GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATC

ACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGC

TCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAG

GTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTA

ACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTA

GGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGT

TACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTA

CGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATT

TTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTA

AACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCC

CCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCA

GATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTG

TTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGT

CGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCC

TTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCAT

GCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCC

CGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCA

AGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTC

TGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTC

AATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCG

CGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTG

12

T/CVMAXXXXX—XXXX

B.5内标序列片段（67bp）

TGGTACATGGCGGCGAATAACAGCATCCAGGGCCATTCAGATGTCGGAGACATCAGCTTCTCGCCGA

注：加粗部分为猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒、猪delta冠状病毒三重荧光RT-PCR检测方法中检测检测内标

（HEX/VIC通道）所使用引物、探针序列覆盖部分。

B.6pUC57载体质粒图谱及序列

质粒图谱

DNA序列

GAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGCGTAAT

CATGGTCATAGCTGTTTCCT