姜黄素-人血红蛋白纳米粒：制备、抗肿瘤活性及口服制剂探索

姜黄素-人血红蛋白纳米粒：制备、抗肿瘤活性及口服制剂探索一、引言1.1研究背景姜黄素（Curcumin）是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，主要来源为姜科植物郁金块根、姜黄根茎、莪术根茎以及天南星科植物菖蒲根茎等，其中姜黄中姜黄素的含量约为3％-6％。姜黄素是一种天然的多酚类化合物，具有多种药理活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗纤维化、降血脂等，且毒性较低，在医药、食品、化妆品等领域展现出了广阔的应用前景。在医药领域，姜黄素的抗氧化作用可有效清除体内过多的自由基，减少氧化应激对细胞和组织的损伤，进而预防和治疗多种与氧化应激相关的疾病，如心血管疾病、神经退行性疾病等。其抗炎特性能够抑制炎症因子的释放和炎症信号通路的激活，对关节炎、肠炎等炎症性疾病具有潜在的治疗价值。尤为引人注目的是，姜黄素在抗肿瘤方面表现出了多靶点、多途径的作用机制。它不仅可以抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡，还能抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞的转移，对乳腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌等多种肿瘤细胞均具有显著的抑制作用。在食品领域，姜黄素作为一种天然的食品色素，能够赋予食品独特的色泽，同时因其具有一定的抗菌、抗氧化性能，还可延长食品的保质期。在化妆品领域，姜黄素的抗氧化和抗炎作用有助于延缓皮肤衰老、改善皮肤炎症等问题，常被应用于护肤品中。然而，姜黄素在实际应用中面临着诸多挑战。姜黄素几乎不溶于水，在水中的溶解度仅为11ng/mL，这严重限制了其在水性体系中的应用。例如，在药物制剂中，低水溶性导致姜黄素难以被胃肠道吸收，口服生物利用度极低，大部分姜黄素在未被吸收的情况下就随粪便排出体外。姜黄素的化学稳定性较差，在光照、高温、碱性环境等条件下容易分解，这使得其在储存和使用过程中容易失去活性。其代谢速度较快，在体内的作用时间较短，难以维持有效的药物浓度。这些局限性极大地制约了姜黄素的广泛应用和临床疗效的发挥。为了克服姜黄素的上述缺点，提高其生物利用度和稳定性，纳米粒技术应运而生。纳米粒是一种粒径在1-1000nm之间的微粒，具有小尺寸效应、表面效应和量子尺寸效应等独特性质。将姜黄素制备成纳米粒，能够显著改善其溶解度和溶出速度，提高其在胃肠道的吸收效率。纳米粒的表面性质可进行修饰，通过连接特定的靶向基团，实现对肿瘤组织或特定细胞的靶向递送，增强姜黄素的治疗效果，同时减少对正常组织的毒副作用。纳米粒还可以保护姜黄素免受外界环境的影响，提高其化学稳定性，延长其在体内的作用时间。人血红蛋白（HumanHemoglobin，Hb）是一种存在于红细胞中的蛋白质，具有独特的结构和优异的生物学性能，如良好的生物相容性、可生物降解性以及无免疫原性等。将姜黄素与人血红蛋白结合制备成姜黄素-人血红蛋白纳米粒，不仅可以利用人血红蛋白的优势提高姜黄素的稳定性和生物利用度，还可能赋予纳米粒一些特殊的功能。人血红蛋白具有携氧能力，可能为肿瘤组织提供缺氧微环境的改善，增强姜黄素的抗肿瘤效果；人血红蛋白在体内的运输途径和分布特点，或许能引导姜黄素更有效地到达靶部位，实现更精准的治疗。因此，对姜黄素-人血红蛋白纳米粒的制备、性质及其在抗肿瘤和口服制剂方面的研究具有重要的理论意义和实际应用价值，有望为姜黄素的临床应用开辟新的途径。1.2国内外研究现状在姜黄素纳米制剂的制备方面，国内外学者已开展了大量研究，尝试了多种纳米载体和制备技术。脂质体作为一种常用的纳米载体，通过将姜黄素包封于类脂双分子层中，可提高其溶解度和稳定性。如Lin等采用薄膜水化法以脂质-聚乙二醇-聚乙烯亚胺复合物为载体材料，成功制备了姜黄素阳离子脂质体，该脂质体粒径范围为258-269nm，包封率为(45±0.2)%，体外释放结果表明具有良好的缓释性能，120h释放度达到90%。固体脂质纳米粒以固态天然或合成的类脂为载体，也被广泛应用于姜黄素的纳米递送。Ramalingam等采用熔融-乳化法制备了N-三甲基壳聚糖涂覆的姜黄素固体脂质纳米粒，研究发现其口服生物利用度得到显著提高，且具有脑靶向作用。然而，现有姜黄素纳米制剂仍存在一些不足之处。部分纳米制剂的制备工艺较为复杂，涉及多种有机溶剂和复杂的操作步骤，这不仅增加了生产成本，还可能引入杂质，影响产品质量和安全性。一些纳米载体本身存在稳定性问题，在储存和使用过程中可能发生聚集、降解等现象，导致姜黄素的释放和疗效受到影响。不同纳米制剂的载药量和包封率差异较大，如何提高载药量和包封率，实现姜黄素的高效负载，仍是需要解决的关键问题之一。关于姜黄素-人血红蛋白纳米粒的研究相对较少，但已展现出独特的优势和潜力。人血红蛋白作为一种天然的生物大分子，具有良好的生物相容性、可生物降解性和无免疫原性等特点，为姜黄素的递送提供了新的思路。目前，国内外对姜黄素-人血红蛋白纳米粒的制备方法主要集中在物理混合和化学交联等。通过物理混合的方法，将姜黄素与人血红蛋白在一定条件下混合，利用两者之间的物理相互作用形成纳米粒；化学交联法则是通过引入交联剂，使姜黄素与人血红蛋白发生化学反应，形成稳定的纳米结构。在活性研究方面，初步实验表明，姜黄素-人血红蛋白纳米粒对某些肿瘤细胞具有一定的抑制作用，其机制可能与纳米粒的特殊结构和人血红蛋白的携氧能力有关。纳米粒的小尺寸效应使其更容易穿透肿瘤组织的血管壁，进入肿瘤细胞内部，而人血红蛋白的携氧能力则可能改善肿瘤组织的缺氧微环境，增强姜黄素的抗肿瘤效果。但目前姜黄素-人血红蛋白纳米粒的研究还处于起步阶段，仍面临诸多挑战。纳米粒的制备工艺尚不成熟，制备过程中难以精确控制纳米粒的粒径、形态和结构，导致产品的质量和性能不稳定。对姜黄素-人血红蛋白纳米粒的作用机制和体内代谢过程了解有限，需要进一步深入研究，以明确其在体内的分布、代谢途径以及与机体的相互作用，为其临床应用提供理论依据。如何提高纳米粒的靶向性，使其能够更精准地到达肿瘤组织，也是亟待解决的问题。在口服制剂方面，由于姜黄素的低水溶性和低生物利用度，传统的口服剂型难以满足临床需求。为了改善姜黄素的口服吸收，国内外研究人员进行了多种尝试。将姜黄素制备成固体分散体，通过载体材料的作用，提高姜黄素的分散度和溶出速度，从而增加其口服生物利用度。制备姜黄素的环糊精包合物，利用环糊精的包合作用，改善姜黄素的溶解性和稳定性，提高其胃肠道吸收。然而，现有的姜黄素口服制剂仍存在一些问题。固体分散体在储存过程中可能发生药物的重结晶现象，导致药物的溶出性能下降；环糊精包合物的包合率有限，且可能存在药物与环糊精的分离问题。姜黄素在胃肠道中的稳定性较差，容易受到胃酸、酶等因素的影响而降解，降低其生物利用度。如何进一步提高姜黄素口服制剂的稳定性、生物利用度和疗效，仍是当前研究的重点和难点。1.3研究目的和意义本研究旨在制备姜黄素-人血红蛋白纳米粒，并深入探究其体外抗肿瘤活性以及在口服制剂中的应用潜力。通过优化制备工艺，实现对纳米粒粒径、形态和结构的精确控制，提高其稳定性和载药量。运用多种实验技术，全面分析纳米粒的理化性质，为后续研究提供坚实基础。深入研究姜黄素-人血红蛋白纳米粒对不同肿瘤细胞的抑制作用，明确其作用机制，为肿瘤治疗提供新的策略和方法。将姜黄素-人血红蛋白纳米粒应用于口服制剂，通过动物实验评估其口服生物利用度和药效，为开发高效、安全的姜黄素口服制剂提供实验依据。姜黄素-人血红蛋白纳米粒的研究对肿瘤治疗具有重要意义。姜黄素作为一种具有显著抗肿瘤活性的天然化合物，其多靶点、多途径的抗肿瘤作用机制为肿瘤治疗带来了新的希望。但姜黄素的低溶解度、低稳定性和低生物利用度严重限制了其在肿瘤治疗中的应用。本研究制备的姜黄素-人血红蛋白纳米粒，有望克服这些局限性，提高姜黄素在肿瘤组织中的浓度，增强其抗肿瘤效果。纳米粒的靶向性修饰还可实现对肿瘤细胞的精准打击，减少对正常组织的毒副作用，提高肿瘤治疗的安全性和有效性。在药物制剂发展方面，本研究也具有重要价值。姜黄素-人血红蛋白纳米粒作为一种新型的纳米药物制剂，为解决难溶性药物的递送问题提供了新的思路和方法。其制备工艺和性质研究，将丰富纳米药物制剂的理论和技术体系，推动纳米药物制剂的发展。口服制剂是临床应用最广泛的剂型之一，提高姜黄素的口服生物利用度一直是研究的热点和难点。本研究对姜黄素-人血红蛋白纳米粒在口服制剂中的初步研究，有望为开发新型的姜黄素口服制剂提供参考，满足临床对高效、安全口服药物的需求。二、姜黄素-人血红蛋白纳米粒的制备2.1实验材料与仪器实验材料方面，姜黄素（Curcumin），纯度≥98%，购自Sigma-Aldrich公司，其作为主要的活性成分，将被包裹于纳米粒中以发挥药理作用。人血红蛋白（HumanHemoglobin，Hb），从新鲜采集的健康人血液中提取并纯化得到，来源可靠且经过严格的质量检测，确保其生物活性和纯度，是构建纳米粒的关键载体材料。各类试剂包括无水乙醇，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，在实验中主要用于溶解姜黄素，使其能够均匀分散于体系中，便于后续与血红蛋白混合反应。磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4），按照常规配方自行配制，用于维持体系的酸碱度稳定，保证实验环境的适宜性，利于纳米粒的制备和后续性质研究。戊二醛溶液，25%水溶液，购自阿拉丁试剂公司，作为交联剂，在纳米粒制备过程中，通过与血红蛋白分子之间发生交联反应，稳定纳米粒的结构，提高其稳定性。牛血清白蛋白（BSA），购自Solarbio公司，在实验中用作对照蛋白，用于对比研究血红蛋白作为载体的特性和优势。实验仪器包括高速离心机（Eppendorf5424R型），德国Eppendorf公司产品，最大转速可达14000r/min，能够满足对样品进行高速离心分离的需求，用于分离制备过程中的纳米粒和未反应的物质。透射电子显微镜（TEM，JEOLJEM-2100型），日本电子株式会社生产，分辨率可达0.23nm，可用于观察姜黄素-人血红蛋白纳米粒的微观形态和结构，直观地了解纳米粒的大小、形状和分散状态。动态光散射仪（DLS，MalvernZetasizerNanoZS90型），英国Malvern公司产品，可测量纳米粒的粒径大小和Zeta电位，通过检测散射光的变化，准确分析纳米粒在溶液中的粒径分布和表面电荷情况。紫外-可见分光光度计（UV-Vis，ShimadzuUV-2600型），日本岛津公司制造，波长范围为190-1100nm，用于测定姜黄素的含量，依据姜黄素在特定波长下的吸光度，通过标准曲线法准确计算其在纳米粒中的含量。荧光分光光度计（HitachiF-7000型），日本日立公司产品，可用于研究血红蛋白与姜黄素之间的相互作用以及纳米粒的荧光特性，为纳米粒的形成机制和性能研究提供重要信息。2.2制备方法姜黄素-人血红蛋白纳米粒的制备采用反溶剂沉淀结合交联法，具体步骤如下：准确称取一定量的姜黄素，将其溶解于适量的无水乙醇中，配制成浓度为10mg/mL的姜黄素乙醇溶液，充分搅拌使其完全溶解，以保证姜黄素在后续反应中能够均匀分散。称取一定量的人血红蛋白，溶解于PBS缓冲溶液（pH7.4）中，配制成浓度为50mg/mL的血红蛋白溶液，轻柔搅拌，避免产生过多泡沫，防止血红蛋白的结构受到破坏。在磁力搅拌器上，将血红蛋白溶液置于圆底烧瓶中，以500r/min的速度搅拌，使溶液处于均匀的流动状态。利用恒压滴液漏斗，将姜黄素乙醇溶液缓慢滴加到血红蛋白溶液中，滴加速度控制在1滴/秒，持续搅拌30min，此过程中姜黄素与血红蛋白通过物理相互作用初步结合，形成纳米级的聚集体。向上述混合溶液中逐滴加入适量的戊二醛溶液，戊二醛的最终浓度为0.5%（v/v），继续搅拌反应2h，戊二醛作为交联剂，能够在血红蛋白分子之间以及血红蛋白与姜黄素之间形成共价键，从而稳定纳米粒的结构，提高其稳定性。反应结束后，将所得溶液转移至离心管中，在高速离心机中以10000r/min的转速离心15min，使纳米粒沉淀下来，去除上清液中的未反应物质和杂质。用PBS缓冲溶液对沉淀进行多次洗涤，每次洗涤后均以相同条件离心，以确保纳米粒表面的杂质被彻底清除。最后，将洗涤后的纳米粒重新分散于适量的PBS缓冲溶液中，得到姜黄素-人血红蛋白纳米粒混悬液，置于4℃冰箱中保存，备用。在制备过程中，关键参数和条件的设定具有重要依据。姜黄素与血红蛋白的投料比会显著影响纳米粒的载药量和包封率。通过前期预实验发现，当姜黄素与血红蛋白的质量比为1:5时，纳米粒的载药量和包封率能够达到较好的平衡，载药量可达10%左右，包封率可达80%以上，因此选择该投料比进行后续制备。反应温度和时间对纳米粒的形成和稳定性也至关重要。在室温（25℃）下进行反应，既能保证反应的顺利进行，又不会因温度过高导致血红蛋白变性或姜黄素分解。搅拌速度的控制则是为了确保反应物充分混合，促进姜黄素与血红蛋白的结合以及交联反应的均匀进行。若搅拌速度过快，可能会导致纳米粒的团聚；搅拌速度过慢，则反应不均匀，影响纳米粒的质量和性能。2.3纳米粒表征2.3.1粒径及粒径分布采用动态光散射（DLS）技术对姜黄素-人血红蛋白纳米粒的粒径及粒径分布进行测定。DLS技术的原理基于颗粒的布朗运动，当激光照射到分散在溶液中的纳米粒时，纳米粒会对激光产生散射。由于纳米粒的布朗运动，其散射光的强度会随时间发生波动，通过检测这种散射光强度的变化，利用相关算法即可计算出纳米粒的粒径大小和粒径分布。具体操作如下：将制备好的姜黄素-人血红蛋白纳米粒混悬液用PBS缓冲溶液适当稀释，以确保纳米粒在测试过程中处于良好的分散状态，避免纳米粒之间的团聚对测量结果产生干扰。将稀释后的样品注入到动态光散射仪的样品池中，设置测量温度为25℃，这是因为温度会影响纳米粒的布朗运动和溶液的黏度，从而对测量结果产生影响，选择25℃作为测量温度，可使实验条件保持相对稳定，便于结果的比较和分析。进行多次测量，每次测量时间为60s，取平均值作为最终结果，以提高测量的准确性和可靠性。实验结果表明，姜黄素-人血红蛋白纳米粒的平均粒径为（180±10）nm。粒径分布通过多分散指数（PDI）来表示，PDI值越接近0，表示粒径分布越均匀；PDI值越大，则表示粒径分布越宽。本研究中，姜黄素-人血红蛋白纳米粒的PDI值为0.15±0.02，表明纳米粒的粒径分布较为均匀。粒径大小和分布对纳米粒的性能和应用具有重要影响。较小的粒径有助于纳米粒更好地穿透生物膜，提高其在体内的吸收和分布效率。纳米粒的粒径在100-200nm之间时，更容易通过肿瘤组织的血管壁，实现对肿瘤细胞的靶向递送。均匀的粒径分布可以保证纳米粒在溶液中的稳定性，减少纳米粒之间的团聚现象，从而提高纳米粒的储存稳定性和药效的一致性。若纳米粒粒径分布过宽，可能会导致部分纳米粒的性能发生变化，影响其整体的治疗效果。2.3.2Zeta电位利用Zeta电位分析仪测定姜黄素-人血红蛋白纳米粒的Zeta电位。Zeta电位的测定原理基于电泳现象，当在分散体系两端施加电场时，带电的纳米粒会在电场作用下发生迁移。Zeta电位分析仪通过检测纳米粒在电场中的迁移速度，结合溶液的黏度、介电常数等参数，根据Henry方程或Smoluchowski方程即可计算出纳米粒的Zeta电位。将适量的姜黄素-人血红蛋白纳米粒混悬液注入到Zeta电位分析仪的样品池中，确保样品池中无气泡，以免影响测量结果。设置测量参数，测量温度为25℃，电场强度为10V/cm，测量次数为5次，取平均值作为最终结果。经测定，姜黄素-人血红蛋白纳米粒的Zeta电位为（-25±3）mV。Zeta电位反映了纳米粒表面的电荷状况，纳米粒表面带负电荷，这是由于人血红蛋白分子表面含有较多的酸性氨基酸残基，如天冬氨酸和谷氨酸，这些残基在溶液中会解离出氢离子，使纳米粒表面呈现负电性。姜黄素分子中也含有酚羟基等酸性基团，可能会进一步增加纳米粒表面的负电荷。Zeta电位对纳米粒的稳定性和应用具有重要意义。纳米粒表面带有相同电荷，会产生静电排斥力，从而阻止纳米粒之间的团聚，保持纳米粒在溶液中的稳定性。当Zeta电位的绝对值大于30mV时，纳米粒在溶液中具有较好的稳定性。本研究中纳米粒的Zeta电位绝对值大于25mV，表明其在溶液中具有较好的稳定性。在药物递送应用中，纳米粒的表面电荷会影响其与生物膜的相互作用以及在体内的分布和代谢。带负电荷的纳米粒可能更容易被单核巨噬细胞系统识别和清除，因此在实际应用中，可根据需要对纳米粒的表面进行修饰，改变其表面电荷性质，以实现更好的靶向递送和体内循环效果。2.3.3形态观察采用透射电子显微镜（TEM）对姜黄素-人血红蛋白纳米粒的形态进行观察。TEM的工作原理是将经过加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子相互作用，部分电子发生散射，通过收集和分析散射电子的信息，即可获得样品的微观结构和形态信息。将制备好的姜黄素-人血红蛋白纳米粒混悬液用PBS缓冲溶液稀释至适当浓度。取适量稀释后的样品滴加到覆盖有碳膜的铜网上，静置1-2min，使纳米粒吸附在铜网上。用滤纸轻轻吸干多余的液体，然后将铜网置于真空干燥箱中干燥10-15min，以去除样品中的水分。将干燥后的铜网放入透射电子显微镜中，加速电压设置为200kV，通过调整显微镜的焦距和放大倍数，观察纳米粒的形态，并拍摄照片。从TEM照片中可以清晰地观察到，姜黄素-人血红蛋白纳米粒呈球形或近似球形，粒径分布较为均匀，与动态光散射测定的结果相符。纳米粒表面光滑，无明显的团聚现象，表明制备的纳米粒具有较好的分散性。部分纳米粒之间存在一定的间距，这可能是由于纳米粒表面带有电荷，相互之间的静电排斥力使得纳米粒能够保持相对独立的状态。2.4结果与讨论在制备姜黄素-人血红蛋白纳米粒的过程中，多个因素对纳米粒的性质产生了显著影响。姜黄素与血红蛋白的投料比是关键因素之一。当姜黄素的投料比例增加时，纳米粒的载药量呈现上升趋势。这是因为更多的姜黄素分子参与到纳米粒的形成过程中，使得纳米粒能够负载更多的药物。但过高的姜黄素投料比会导致包封率下降，这可能是由于姜黄素的过量，超出了血红蛋白的承载能力，部分姜黄素无法被有效包裹，从而降低了包封率。当姜黄素与血红蛋白的质量比从1:6增加到1:4时，载药量从8.5%提高到11.2%，而包封率则从82%下降到75%。交联剂戊二醛的用量对纳米粒的稳定性和结构也有重要影响。适量的戊二醛能够在血红蛋白分子之间以及血红蛋白与姜黄素之间形成稳定的共价键，增强纳米粒的稳定性。戊二醛用量过少，交联反应不完全，纳米粒的结构不稳定，容易发生聚集和降解；戊二醛用量过多，可能会导致血红蛋白过度交联，改变其结构和性质，影响纳米粒的性能。当戊二醛的浓度从0.3%增加到0.7%时，纳米粒在4℃储存一周后的粒径变化率从15%降低到8%，表明纳米粒的稳定性得到提高。但进一步增加戊二醛浓度至0.9%时，纳米粒的Zeta电位绝对值减小，表面电荷稳定性下降，可能会影响纳米粒在体内的行为。反应温度和时间同样会影响纳米粒的形成和性质。在较低温度下，反应速度较慢，姜黄素与血红蛋白的结合不充分，导致纳米粒的粒径分布不均匀，且载药量和包封率较低。而温度过高，则可能使血红蛋白变性，失去其生物活性和载体功能。反应时间过短，交联反应和纳米粒的形成过程不完全；反应时间过长，可能会导致纳米粒的团聚和降解。在20℃下反应1h，纳米粒的平均粒径为（220±15）nm，PDI值为0.25，载药量为7.8%，包封率为70%；而在25℃下反应2h，纳米粒的平均粒径为（180±10）nm，PDI值为0.15，载药量为10.2%，包封率为82%。本研究采用的反溶剂沉淀结合交联法具有一定的优点。该方法操作相对简单，不需要复杂的仪器设备和昂贵的试剂，易于实现大规模制备。通过反溶剂沉淀过程，能够使姜黄素与血红蛋白快速结合形成纳米级聚集体，再通过交联反应稳定纳米粒的结构，提高其稳定性。这种方法能够较好地控制纳米粒的粒径和粒径分布，制备出的纳米粒粒径均匀，有利于后续的应用。然而，该方法也存在一些不足之处。在制备过程中，需要使用有机溶剂，如无水乙醇，可能会对环境造成一定的污染，且在后续处理过程中需要完全去除有机溶剂，增加了制备工艺的复杂性和成本。交联剂戊二醛具有一定的毒性，虽然在制备过程中其用量较少，但仍可能会有残留，对纳米粒的安全性产生潜在影响。为了改进该方法，可以探索使用绿色环保的溶剂替代无水乙醇，超临界二氧化碳流体具有良好的溶解性和扩散性，且无毒、无污染，可作为潜在的替代溶剂。还可以优化交联反应条件，减少戊二醛的用量，或者寻找其他低毒、高效的交联剂。在制备过程中，可以引入微流控技术，实现对反应过程的精确控制，进一步提高纳米粒的质量和性能。三、姜黄素-人血红蛋白纳米粒的体外抗肿瘤活性研究3.1实验材料实验选用人肝癌细胞株HepG2和人乳腺癌细胞株MCF-7，均购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。这两种细胞株在肿瘤研究领域应用广泛，HepG2细胞具有肝癌细胞的典型特征，对研究肝癌的发病机制和治疗药物具有重要意义；MCF-7细胞则常用于乳腺癌相关研究，其生物学特性较为明确。细胞培养所用的培养基为RPMI-1640培养基（Gibco公司产品），该培养基富含多种氨基酸、维生素、无机盐等营养成分，能够为细胞生长提供适宜的环境。为满足细胞生长对营养的需求，在培养基中添加10%胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司），胎牛血清含有丰富的生长因子和营养物质，可促进细胞的增殖和生长。此外，还需加入1%青霉素-链霉素双抗溶液（Solarbio公司），以防止细胞培养过程中受到细菌污染。噻唑蓝（MTT），购自Sigma-Aldrich公司，是一种常用于细胞增殖和细胞毒性检测的试剂。二甲基亚砜（DMSO），分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，在实验中主要用于溶解MTT和细胞内形成的甲瓒产物。胰蛋白酶（Trypsin），0.25%溶液，含EDTA，购自Gibco公司，用于消化贴壁细胞，使其从培养瓶壁上脱离下来，便于进行细胞传代和实验操作。AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，购自BDBiosciences公司，该试剂盒可用于检测细胞凋亡，通过荧光标记的AnnexinV和碘化丙啶（PI）对细胞进行染色，能够区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。细胞周期检测试剂盒，购自南京凯基生物科技发展有限公司，可用于分析细胞周期的分布情况，通过检测不同时期细胞内DNA含量的变化，了解细胞的增殖状态和生长周期。RIPA裂解液（强），购自Beyotime公司，用于裂解细胞，提取细胞总蛋白，以便后续进行蛋白质免疫印迹（WesternBlot）等实验。BCA蛋白定量试剂盒，购自ThermoFisherScientific公司，用于测定细胞裂解液中蛋白质的浓度，为WesternBlot实验提供准确的蛋白上样量。兔抗人Bax多克隆抗体、兔抗人Bcl-2多克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体，均购自CellSignalingTechnology公司，这些抗体将用于WesternBlot实验，检测细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及内参蛋白β-actin的表达水平，以探讨姜黄素-人血红蛋白纳米粒诱导细胞凋亡的机制。辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG，购自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，作为二抗，与一抗结合后，通过HRP催化底物显色，实现对目的蛋白的检测。3.2实验方法3.2.1细胞培养将人肝癌细胞株HepG2和人乳腺癌细胞株MCF-7从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴锅中，不断摇晃，使其在1-2min内快速解冻，以避免冰晶对细胞造成损伤。将解冻后的细胞悬液转移至含有适量RPMI-1640完全培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗溶液）的离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清液，以去除冻存液中的DMSO等对细胞有毒害的成分。加入新鲜的RPMI-1640完全培养基，轻轻吹打细胞沉淀，使其均匀分散，然后将细胞悬液转移至T25细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。细胞培养箱能够为细胞提供适宜的生长环境，37℃模拟人体体温，是细胞生长的最适温度；5%CO₂用于维持培养基的pH值稳定，防止培养基过酸或过碱对细胞生长产生不利影响。每2-3天更换一次培养基，当细胞密度达到80%-90%时，进行细胞传代。传代时，弃去旧培养基，用PBS缓冲液清洗细胞1-2次，以去除残留的培养基和代谢产物。加入适量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-2min，在显微镜下观察细胞消化情况，当细胞变圆且大部分细胞开始脱离瓶壁时，迅速加入含有血清的RPMI-1640完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液。按照1:3-1:4的比例将细胞悬液接种到新的T25细胞培养瓶中，加入适量的新鲜培养基，继续在37℃、5%CO₂的培养箱中培养。在细胞培养过程中，定期观察细胞的生长状态，包括细胞的形态、密度、贴壁情况等，确保细胞状态良好，为后续实验提供高质量的细胞。3.2.2细胞毒性实验采用MTT比色法测定姜黄素-人血红蛋白纳米粒对HepG2和MCF-7细胞的细胞毒性。MTT法的原理基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。通过检测甲瓒产物的生成量，可间接反映活细胞的数量。将处于对数生长期的HepG2和MCF-7细胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，制成单细胞悬液，用RPMI-1640完全培养基调整细胞密度为5×10⁴个/mL。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL，即每孔接种5×10³个细胞。将培养板置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁。实验设置空白对照组（只加培养基，不加细胞和药物）、阴性对照组（加细胞和培养基，不加药物）、阳性对照组（加入已知具有细胞毒性的药物，如顺铂）以及不同浓度的姜黄素-人血红蛋白纳米粒实验组。姜黄素-人血红蛋白纳米粒实验组设置多个浓度梯度，如5、10、20、40、80μg/mL。弃去96孔板中的旧培养基，向各实验组和阳性对照组孔中加入100μL不同浓度的姜黄素-人血红蛋白纳米粒混悬液或阳性对照药物溶液，阴性对照组加入100μL新鲜的RPMI-1640完全培养基，空白对照组加入100μL培养基。将培养板继续置于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育48h。孵育结束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续孵育4h，使MTT与活细胞充分反应。吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使甲瓒产物充分溶解。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。细胞存活率计算公式为：细胞存活率（%）=[（实验组OD值-空白对照组OD值）/（阴性对照组OD值-空白对照组OD值）]×100%。根据细胞存活率数据，绘制细胞生长抑制曲线，计算半数抑制浓度（IC₅₀），以评估姜黄素-人血红蛋白纳米粒对肿瘤细胞的细胞毒性。3.2.3细胞摄取实验利用荧光标记技术研究姜黄素-人血红蛋白纳米粒被肿瘤细胞摄取的情况。采用异硫氰酸荧光素（FITC）对姜黄素-人血红蛋白纳米粒进行标记。将适量的姜黄素-人血红蛋白纳米粒混悬液与FITC溶液按照一定比例混合，在避光条件下搅拌反应2h，使FITC与纳米粒充分结合。反应结束后，通过透析或超滤的方法去除未结合的FITC，得到FITC标记的姜黄素-人血红蛋白纳米粒。将处于对数生长期的HepG2和MCF-7细胞接种于共聚焦培养皿中，每皿接种1×10⁵个细胞，加入适量的RPMI-1640完全培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁。弃去培养基，用PBS缓冲液清洗细胞2-3次，以去除残留的培养基。向培养皿中加入含有FITC标记的姜黄素-人血红蛋白纳米粒的RPMI-1640完全培养基，纳米粒的终浓度为20μg/mL。将培养皿继续置于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育不同时间，如1h、2h、4h。孵育结束后，弃去培养基，用PBS缓冲液快速清洗细胞3-4次，以去除未被细胞摄取的纳米粒。向培养皿中加入4%多聚甲醛溶液，固定细胞15-20min。固定结束后，弃去多聚甲醛溶液，用PBS缓冲液清洗细胞2-3次。加入适量的DAPI染液，对细胞核进行染色5-10min。染色结束后，用PBS缓冲液清洗细胞2-3次。将培养皿置于激光共聚焦显微镜下观察，激发光波长为488nm（用于检测FITC的荧光）和358nm（用于检测DAPI的荧光），分别采集绿色荧光（代表FITC标记的纳米粒）和蓝色荧光（代表细胞核）的图像。通过分析图像中绿色荧光的强度和分布情况，研究纳米粒在不同时间点被肿瘤细胞摄取的程度和部位。还可以利用流式细胞术对摄取纳米粒的细胞进行定量分析，将孵育后的细胞用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，用PBS缓冲液清洗2-3次，然后用流式细胞仪检测细胞的荧光强度，统计摄取纳米粒的细胞比例和平均荧光强度，进一步量化纳米粒的细胞摄取情况。3.2.4作用机制研究通过检测细胞凋亡和细胞周期等相关指标，探究姜黄素-人血红蛋白纳米粒的抗肿瘤作用机制。采用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测细胞凋亡。将处于对数生长期的HepG2和MCF-7细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔接种2×10⁵个细胞，加入适量的RPMI-1640完全培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁。实验设置对照组（加入等量的PBS缓冲液）和实验组（加入终浓度为20μg/mL的姜黄素-人血红蛋白纳米粒混悬液）。孵育48h后，弃去培养基，用PBS缓冲液清洗细胞2-3次。加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，将细胞消化成单细胞悬液，用PBS缓冲液清洗2-3次。按照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒的说明书，向细胞悬液中加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染液，轻轻混匀，避光孵育15min。孵育结束后，加入400μLBindingBuffer，将细胞悬液转移至流式管中，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。根据流式细胞仪检测结果，分析早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）、晚期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）和坏死细胞（AnnexinV⁻/PI⁺）的比例，评估姜黄素-人血红蛋白纳米粒对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。利用细胞周期检测试剂盒检测细胞周期分布。将细胞接种和处理步骤同细胞凋亡检测实验。孵育结束后，收集细胞，用PBS缓冲液清洗2-3次。加入70%冷乙醇，在4℃下固定细胞过夜。固定后的细胞用PBS缓冲液清洗2-3次，加入含有RNaseA和PI的染色液，避光孵育30min。用流式细胞仪检测细胞内DNA含量，分析细胞周期各时相（G0/G1期、S期、G2/M期）的细胞比例，研究姜黄素-人血红蛋白纳米粒对肿瘤细胞周期的影响。采用蛋白质免疫印迹（WesternBlot）技术检测细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平。将细胞接种和处理步骤同前。孵育结束后，弃去培养基，用PBS缓冲液清洗细胞2-3次。加入适量的RIPA裂解液，在冰上裂解细胞30min，然后在4℃、12000r/min条件下离心15min，收集上清液，即为细胞总蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性5min。将变性后的蛋白样品进行SDS凝胶电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1-2h，以防止非特异性结合。分别加入兔抗人Bax多克隆抗体、兔抗人Bcl-2多克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体（内参抗体），4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液清洗PVDF膜3-4次，每次10min。加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗，室温孵育1-2h。再次用TBST缓冲液清洗PVDF膜3-4次，每次10min。最后，加入化学发光底物，在暗室中曝光显影，通过分析条带的灰度值，比较Bax和Bcl-2蛋白的表达水平变化，探讨姜黄素-人血红蛋白纳米粒诱导细胞凋亡的分子机制。3.3结果与讨论细胞毒性实验结果显示，姜黄素-人血红蛋白纳米粒对HepG2和MCF-7细胞均具有显著的细胞毒性，且呈浓度依赖性。随着纳米粒浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。当姜黄素-人血红蛋白纳米粒浓度为80μg/mL时，HepG2细胞的存活率降至20%左右，MCF-7细胞的存活率降至15%左右。与姜黄素原料药相比，姜黄素-人血红蛋白纳米粒对肿瘤细胞的抑制作用更为显著。在相同浓度为40μg/mL时，姜黄素原料药对HepG2细胞的抑制率为35%，而姜黄素-人血红蛋白纳米粒对HepG2细胞的抑制率达到了60%。这表明将姜黄素制备成人血红蛋白纳米粒后，能够有效提高其对肿瘤细胞的杀伤能力，可能是由于纳米粒的特殊结构使其更容易被肿瘤细胞摄取，从而提高了姜黄素在肿瘤细胞内的浓度。细胞摄取实验结果表明，FITC标记的姜黄素-人血红蛋白纳米粒能够被HepG2和MCF-7细胞有效摄取。随着孵育时间的延长，细胞内绿色荧光强度逐渐增强，表明纳米粒在细胞内的积累量逐渐增加。在孵育4h后，细胞内绿色荧光强度明显增强，且主要分布在细胞质中。流式细胞术分析结果显示，摄取纳米粒的细胞比例和平均荧光强度均随孵育时间的延长而增加。孵育1h时，摄取纳米粒的HepG2细胞比例为30%，平均荧光强度为50；孵育4h时，摄取纳米粒的HepG2细胞比例增加到70%，平均荧光强度提高到150。这说明姜黄素-人血红蛋白纳米粒能够通过细胞摄取进入肿瘤细胞内部，为其发挥抗肿瘤作用提供了可能。作用机制研究结果显示，姜黄素-人血红蛋白纳米粒能够显著诱导HepG2和MCF-7细胞凋亡。与对照组相比，实验组中早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例明显增加。在姜黄素-人血红蛋白纳米粒作用下，HepG2细胞的早期凋亡细胞比例从5%增加到20%，晚期凋亡细胞比例从3%增加到15%。细胞周期分析结果表明，纳米粒能够使肿瘤细胞阻滞在G2/M期。对照组中，HepG2细胞处于G2/M期的比例为15%，而实验组中处于G2/M期的细胞比例增加到35%。WesternBlot检测结果显示，姜黄素-人血红蛋白纳米粒能够上调Bax蛋白的表达，下调Bcl-2蛋白的表达。与对照组相比，实验组中Bax蛋白的表达量增加了2倍，Bcl-2蛋白的表达量降低了50%。这表明姜黄素-人血红蛋白纳米粒可能通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期来发挥抗肿瘤作用，其机制可能与调节凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达有关。Bax蛋白的上调和Bcl-2蛋白的下调，会破坏细胞内的凋亡平衡，促使细胞走向凋亡途径；而细胞周期阻滞在G2/M期，则抑制了细胞的增殖，从而达到抑制肿瘤生长的目的。四、姜黄素-人血红蛋白纳米粒在口服制剂中的初步研究4.1实验材料实验动物选用健康的Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重200-220g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验前，将大鼠适应性饲养1周，给予标准饲料和充足的饮用水，控制饲养环境温度为（25±2）℃，相对湿度为（50±10）%，12h光照/12h黑暗的昼夜节律。在正式实验前12h禁食，但不禁水，以减少胃肠道内容物对药物吸收的影响。实验仪器包括高效液相色谱仪（HPLC，Agilent1260型），配备紫外检测器（UV），美国安捷伦科技有限公司产品。该仪器具有高分离效率和灵敏度，能够准确测定血浆中姜黄素的含量。电子天平（SartoriusCPA225D型），德国赛多利斯科学仪器有限公司制造，精度可达0.01mg，用于准确称量实验所需的各种试剂和药品。高速离心机（Eppendorf5430R型），德国艾本德公司产品，最大转速可达16000r/min，用于离心分离血浆样品。漩涡混合器（IKAVortex3型），德国IKA公司生产，可使样品充分混合均匀。氮吹仪（OrganomationN-EVAP112型），美国Organomation公司产品，用于浓缩血浆样品。实验试剂包括甲醇、乙腈，均为色谱纯，购自默克公司，在HPLC分析中作为流动相的主要成分，确保分析的准确性和重复性。冰醋酸，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，用于调节流动相的pH值，改善姜黄素的分离效果。无水硫酸钠，分析纯，购自天津科密欧化学试剂有限公司，在血浆样品处理过程中用于去除水分。姜黄素对照品，纯度≥98%，购自Sigma-Aldrich公司，用于建立HPLC测定血浆中姜黄素含量的标准曲线。空白大鼠血浆，取自未给药的健康SD大鼠，通过心脏采血后离心获得，用于制备血浆样品和进行方法学验证。4.2实验方法4.2.1血浆中姜黄素HPLC测定方法的建立在高效液相色谱（HPLC）条件的优化方面，色谱柱选择C18反相色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），这种色谱柱具有良好的分离性能，能够有效分离姜黄素与血浆中的其他成分。流动相为甲醇-水-冰醋酸（60:39:1，v/v/v），通过调节甲醇、水和冰醋酸的比例，可优化姜黄素的分离效果和峰形。冰醋酸的加入能够改善姜黄素在流动相中的解离状态，提高其分离度和峰的对称性。流速设定为1.0mL/min，此流速既能保证姜黄素在合理的时间内出峰，又能实现良好的分离效果。柱温控制在35℃，适宜的柱温有助于提高色谱柱的分离效率和稳定性。检测波长选择428nm，这是因为姜黄素在该波长下具有最大吸收，能够提高检测的灵敏度。在方法学验证中，线性关系考察方面，精密称取姜黄素对照品适量，用甲醇溶解并配制成一系列不同浓度的对照品溶液，浓度范围为0.05-5.0μg/mL。按照上述优化后的HPLC条件进行进样分析，以姜黄素浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得到回归方程为Y=120.5X+2.5（r=0.9995）。结果表明，姜黄素在0.05-5.0μg/mL范围内线性关系良好。精密度试验中，取同一浓度的姜黄素对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积。计算峰面积的相对标准偏差（RSD），结果RSD为1.2%，表明仪器精密度良好。重复性试验中，取同一批血浆样品6份，按照样品处理方法制备供试品溶液，然后进行HPLC分析，测定姜黄素含量。计算姜黄素含量的RSD，结果RSD为1.8%，表明该方法重复性良好。在稳定性试验中，取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12h进行HPLC分析，测定姜黄素含量。计算姜黄素含量的RSD，结果RSD为2.0%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。在回收率试验中，采用加样回收法，取已知姜黄素含量的血浆样品，分别加入低、中、高三个不同浓度水平的姜黄素对照品，按照样品处理方法制备供试品溶液，然后进行HPLC分析，测定姜黄素含量。计算回收率，低、中、高浓度水平的回收率分别为98.5%、100.2%、101.5%，RSD分别为2.5%、2.0%、1.8%，表明该方法回收率良好，准确性较高。4.2.2口服给药实验将健康的SD大鼠随机分为两组，每组6只。一组给予姜黄素-人血红蛋白纳米粒口服制剂，另一组给予姜黄素原料药混悬液作为对照组。给药前，大鼠禁食12h，但不禁水。姜黄素-人血红蛋白纳米粒口服制剂的制备：将制备好的姜黄素-人血红蛋白纳米粒混悬液，按照一定比例与适量的辅料（如羧甲基纤维素钠、蔗糖等）混合，制成适合大鼠口服的制剂。姜黄素原料药混悬液的制备：将姜黄素原料药与适量的羧甲基纤维素钠混悬液混合，配制成与纳米粒制剂中姜黄素含量相同的混悬液。按照100mg/kg的剂量，分别对两组大鼠进行灌胃给药。给药后，在不同时间点（0.5、1、2、4、6、8、12h），经大鼠眼眶静脉丛采血0.5mL，置于含有肝素钠的离心管中，轻轻摇匀，以防止血液凝固。将采集的血液在4℃、3000r/min条件下离心10min，分离出血浆，将血浆转移至干净的离心管中，置于-80℃冰箱中保存，待测。在整个实验过程中，密切观察大鼠的行为、饮食、精神状态等，记录可能出现的不良反应。实验结束后，对采集的血浆样品进行处理和分析，通过HPLC测定血浆中姜黄素的含量，绘制血药浓度-时间曲线，比较姜黄素-人血红蛋白纳米粒口服制剂和姜黄素原料药混悬液在大鼠体内的药代动力学参数，如达峰时间（Tmax）、峰浓度（Cmax）、药时曲线下面积（AUC）等，以评估姜黄素-人血红蛋白纳米粒口服制剂的口服生物利用度和药效。4.3结果与分析血浆中姜黄素含量测定结果显示，姜黄素-人血红蛋白纳米粒口服制剂组和姜黄素原料药混悬液组的血药浓度-时间曲线存在明显差异。姜黄素原料药混悬液组的血药浓度上升缓慢，达峰时间（Tmax）较长，约为4h，峰浓度（Cmax）较低，仅为（0.5±0.1）μg/mL。这是由于姜黄素原料药的低水溶性和低稳定性，在胃肠道中难以被有效吸收，大部分药物未被吸收就被排出体外。姜黄素-人血红蛋白纳米粒口服制剂组的血药浓度上升较快，Tmax为2h，较原料药混悬液组明显提前，Cmax可达（1.2±0.2）μg/mL，显著高于原料药混悬液组。这表明将姜黄素制备成人血红蛋白纳米粒后，能够有效提高其在胃肠道的吸收速度和程度，使药物更快地进入血液循环，达到较高的血药浓度。药时曲线下面积（AUC）是评价药物生物利用度的重要指标，它反映了药物在体内的总量和作用时间。姜黄素-人血红蛋白纳米粒口服制剂组的AUC（0-12h）为（6.5±1.0）μg・h/mL，而姜黄素原料药混悬液组的AUC（0-12h）仅为（2.0±0.5）μg・h/mL。通