姜黄素调控NGAL基因表达对乳腺癌MDA-MB-23细胞侵袭能力的影响探究

姜黄素调控NGAL基因表达对乳腺癌MDA-MB-23细胞侵袭能力的影响探究一、引言1.1研究背景与意义乳腺癌作为全球女性中发病率最高的恶性肿瘤之一，严重威胁着女性的生命健康与生活质量。根据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球癌症负担数据，乳腺癌新发病例高达226万例，超越肺癌成为全球第一大癌。在中国，乳腺癌的发病率也呈逐年上升趋势，且发病年龄逐渐年轻化。乳腺癌不仅会导致乳房形态的改变、生理功能的受损，其转移和复发还会对全身多个器官造成损害，引发一系列严重的并发症，极大地降低患者的生存预期。一旦乳腺癌发生转移，5年生存率将显著下降，给患者家庭和社会带来沉重的经济和心理负担。MDA-MB-231细胞是一种具有高度侵袭性和转移性的乳腺癌细胞系，常被用于乳腺癌侵袭和转移机制的研究。其高侵袭性使得肿瘤细胞能够突破基底膜，侵入周围组织和血管，进而发生远处转移，这是乳腺癌患者预后不良的主要原因。研究MDA-MB-231细胞的侵袭机制，寻找有效的干预靶点，对于改善乳腺癌患者的治疗效果和预后具有至关重要的意义。姜黄素（Curcumin）是从姜科姜黄属植物姜黄等的根茎中提取出来的一种多酚类化合物，作为传统中药的活性成分，其在亚洲地区的药用历史悠久。现代研究表明，姜黄素具有多种药理活性，如抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等，尤其是在抗肿瘤领域展现出巨大的潜力。众多研究发现，姜黄素可以通过诱导癌细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞转移等多种途径发挥抗癌作用。在乳腺癌研究中，姜黄素已被证实能够抑制多种乳腺癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，但其对乳腺癌细胞侵袭能力的影响及具体机制尚未完全明确。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NeutrophilGelatinase-AssociatedLipocalin，NGAL）是lipocalin家族的重要成员，在多种生理和病理过程中发挥作用。近年来，越来越多的研究表明，NGAL在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移过程中扮演着关键角色。在乳腺癌中，NGAL的高表达与肿瘤的恶性程度、侵袭能力和不良预后密切相关。NGAL可以通过调节基质金属蛋白酶（MatrixMetalloproteinases，MMPs）的活性，降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的侵袭和转移；还能参与肿瘤细胞的增殖、凋亡和血管生成等过程，影响肿瘤的生长和发展。然而，姜黄素是否通过调节NGAL基因表达来影响乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭能力，目前尚未见相关报道。探究姜黄素通过调节NGAL基因表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响，具有重要的理论和实践意义。从理论方面来看，有助于深入揭示姜黄素的抗癌机制，进一步丰富乳腺癌的发病机制理论，为乳腺癌的分子靶向治疗提供新的理论依据；从实践角度出发，有望为乳腺癌的临床治疗提供新的治疗策略和药物靶点，为开发高效、低毒的抗癌药物奠定基础，从而提高乳腺癌患者的生存率和生活质量。1.2国内外研究现状在姜黄素的抗癌作用研究方面，国内外学者已取得了较为丰硕的成果。姜黄素作为一种从姜科植物根茎中提取的天然多酚类化合物，其抗癌特性备受关注。国外研究中，美国学者通过细胞实验发现姜黄素能够诱导多种癌细胞如结肠癌细胞、前列腺癌细胞凋亡，其机制与激活细胞内的凋亡信号通路相关，如上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。在乳腺癌研究中，有研究表明姜黄素可抑制乳腺癌细胞的增殖，通过阻滞细胞周期于G2/M期，抑制细胞的有丝分裂过程。国内研究也证实了姜黄素的抗癌功效，如在肝癌细胞研究中，姜黄素能够抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，通过抑制上皮-间质转化（EMT）过程，减少癌细胞的转移能力。在肺癌研究中，姜黄素可调节肿瘤微环境，抑制肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤的生长和转移。然而，姜黄素在乳腺癌细胞侵袭能力方面的研究，尤其是其对特定基因表达的调控机制研究仍有待深入。对于乳腺癌细胞侵袭机制的研究，国内外都进行了大量工作。乳腺癌细胞的侵袭是一个复杂的过程，涉及多个分子和信号通路的改变。国外研究发现，基质金属蛋白酶（MMPs）家族在乳腺癌细胞侵袭中发挥关键作用，MMP-2和MMP-9能够降解细胞外基质，为癌细胞的侵袭提供通路。整合素家族通过与细胞外基质成分结合，激活细胞内的信号传导，促进癌细胞的迁移和侵袭。国内研究揭示了一些新的调控因子，如微小RNA（miRNA）在乳腺癌细胞侵袭中的作用，miR-21通过靶向抑制肿瘤抑制基因，促进乳腺癌细胞的侵袭和转移。长链非编码RNA（lncRNA）也参与了乳腺癌细胞侵袭的调控，通过与mRNA或蛋白质相互作用，影响相关信号通路。尽管对乳腺癌细胞侵袭机制有了一定认识，但仍有许多未知的调控机制和潜在靶点有待探索。NGAL基因在癌症中的作用研究也是当前的热点。国外研究表明，NGAL在多种癌症中高表达，与肿瘤的不良预后相关。在肾癌中，NGAL的高表达与肿瘤的分期、分级密切相关，可作为评估肾癌患者预后的指标。在结直肠癌中，NGAL通过调节肿瘤细胞的代谢和增殖，促进肿瘤的发展。国内研究发现，在胃癌中，NGAL能够促进肿瘤细胞的侵袭和转移，其机制与激活PI3K/Akt信号通路有关。在肝癌中，NGAL参与了肿瘤细胞的免疫逃逸过程，降低机体对肿瘤细胞的免疫监视。然而，NGAL在乳腺癌中，特别是在姜黄素调节乳腺癌细胞侵袭能力方面的作用尚未见报道。综上所述，当前关于姜黄素抗癌作用、乳腺癌细胞侵袭机制以及NGAL基因在癌症中的作用已有一定研究基础，但姜黄素是否通过调节NGAL基因表达来影响乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭能力，尚未有相关研究。这一领域的研究空白为深入探究姜黄素的抗癌机制和寻找乳腺癌治疗新靶点提供了研究方向，具有重要的研究价值和意义。1.3研究目的与内容本研究旨在深入探究姜黄素对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响，并揭示其是否通过调节NGAL基因表达来实现这一作用，具体研究内容如下：研究姜黄素对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响：采用Transwell小室实验，将MDA-MB-231细胞接种于小室上室，下室加入含不同浓度姜黄素的培养基，培养一定时间后，固定、染色并计数穿过小室膜的细胞数量，以此直观评估姜黄素对细胞侵袭能力的影响。同时，运用细胞划痕实验，在培养的细胞单层上制造划痕，分别在划痕后0小时、24小时、48小时等不同时间点，通过显微镜观察并测量划痕愈合情况，计算细胞迁移率，从动态角度分析姜黄素对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的影响。检测姜黄素处理后MDA-MB-231细胞中NGAL基因和蛋白的表达水平：运用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-TimeQuantitativePolymeraseChainReaction，RT-qPCR）技术，提取姜黄素处理后的MDA-MB-231细胞总RNA，反转录为cDNA，以其为模板进行PCR扩增，通过检测目的基因NGAL与内参基因的Ct值，计算相对表达量，准确测定姜黄素处理后细胞中NGAL基因的mRNA表达水平。利用蛋白质免疫印迹（WesternBlot）技术，提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜后用特异性抗NGAL抗体进行孵育，再用二抗孵育，通过化学发光法检测NGAL蛋白的表达情况，从蛋白质水平明确姜黄素对NGAL表达的影响。探讨姜黄素调节NGAL基因表达影响MDA-MB-231细胞侵袭能力的机制：利用RNA干扰（RNAinterference，RNAi）技术，设计并合成针对NGAL基因的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA），转染MDA-MB-231细胞，降低细胞中NGAL基因的表达水平。将转染后的细胞分为对照组、姜黄素处理组、siRNA干扰组以及姜黄素联合siRNA干扰组，通过Transwell小室实验和细胞划痕实验，检测各组细胞的侵袭和迁移能力，分析在NGAL基因表达被抑制的情况下，姜黄素对细胞侵袭能力的影响是否发生改变，从而初步揭示姜黄素调节NGAL基因表达影响细胞侵袭能力的机制。通过生物信息学分析、文献调研等方法，预测与NGAL基因相关的信号通路，如PI3K/Akt、MAPK等信号通路。采用蛋白质免疫印迹技术检测姜黄素处理后细胞中相关信号通路关键蛋白的磷酸化水平，运用信号通路抑制剂或激活剂处理细胞，观察细胞侵袭能力和NGAL基因表达的变化，进一步深入探究姜黄素调节NGAL基因表达影响MDA-MB-231细胞侵袭能力的具体信号传导机制。二、相关理论基础2.1姜黄素概述姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄（CurcumalongaL.）、郁金（CurcumaaromaticaSalisb.）、莪术（Curcumazedoaria(Berg.)Rosc.）等的根茎中提取得到的一种天然多酚类化合物。姜黄属植物在亚洲地区分布广泛，如印度、中国等，在这些地区的传统医学中，姜黄属植物常被用于治疗多种疾病，姜黄素作为其主要活性成分，也逐渐受到现代医学的关注。从化学结构上看，姜黄素的分子式为C_{21}H_{20}O_{6}，分子量为368.38。其化学结构包含两个甲氧基和两个酚羟基，中心是一个β-二酮结构，这种独特的结构赋予了姜黄素多种药理活性。由于分子两端的羟基，在碱性条件下，姜黄素会发生电子云偏离的共轭效应，致使其颜色随pH值变化而改变，当pH大于8时，姜黄素由黄变红，基于此特性，它常被用作酸碱指示剂。姜黄素为橙黄色结晶粉末，味稍苦。在溶解性方面，姜黄素不溶于水和乙醚，可溶于乙醇、丙二醇，易溶于冰醋酸和碱溶液。其对光、热、铁离子敏感，在光照、高温或有铁离子存在的环境下，稳定性较差，容易分解或变色；而对还原剂的稳定性相对较强，且具有较强的着色性，一旦着色就不易褪色。在医药领域，姜黄素展现出了广泛的药理活性。首先，姜黄素具有显著的抗氧化作用。它能够通过自身的酚羟基结构，与体内的自由基发生反应，从而有效地清除超氧阴离子自由基（O_{2}^{-}）、羟自由基（·OH）等，减少氧化应激对细胞造成的损伤。例如，在对肝脏细胞的研究中发现，姜黄素可以提高细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，降低丙二醛（MDA）的含量，减轻氧化损伤。其次，姜黄素具有强大的抗炎作用。它能够抑制核因子-κB（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等炎症信号通路的激活，减少肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症介质的产生和释放，进而减轻炎症反应。在类风湿性关节炎动物模型中，姜黄素能够缓解关节肿胀、疼痛等症状，减少炎症细胞浸润，降低关节组织中的炎症因子水平。姜黄素还具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫等作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等多种病原菌都有一定的抑制作用。尤为重要的是，姜黄素在抗肿瘤方面表现出巨大的潜力。研究表明，姜黄素可以通过多种途径抑制肿瘤细胞的生长和转移。它能够诱导肿瘤细胞凋亡，通过激活Caspase家族蛋白酶，促使细胞凋亡相关蛋白的表达改变，如上调Bax蛋白，下调Bcl-2蛋白，从而诱导肿瘤细胞走向凋亡。姜黄素还能阻滞肿瘤细胞周期，使细胞停滞在G0/G1期或G2/M期，抑制细胞的增殖。在肿瘤血管生成方面，姜黄素可以抑制血管内皮生长因子（VEGF）及其受体的表达，减少新生血管的形成，切断肿瘤的营养供应，进而抑制肿瘤的生长和转移。此外，姜黄素还能调节肿瘤细胞的代谢，增强机体的免疫功能，发挥抗肿瘤作用。在乳腺癌研究中，已有研究证实姜黄素能够抑制乳腺癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，但其对乳腺癌细胞侵袭能力的影响及具体机制尚未完全明确，这也为本研究提供了切入点。2.2乳腺癌及MDA-MB-23细胞特性乳腺癌是一种起源于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，其发病机制较为复杂，涉及遗传、激素、环境等多种因素。从遗传因素来看，约5%-10%的乳腺癌与遗传相关，如BRCA1、BRCA2等基因突变，会显著增加乳腺癌的发病风险。激素水平的变化在乳腺癌的发生发展中起着关键作用，乳腺细胞受雌激素、孕激素等激素的调控，当激素信号通路异常时，乳腺细胞可能发生病变，引发乳腺癌。例如，月经初潮早（小于12岁）、绝经晚（大于55岁）、未生育或生育晚的女性，由于长期暴露于雌激素环境中，患乳腺癌的风险相对较高。环境因素，如长期接触化学致癌物、电离辐射等，也会增加乳腺癌的发病几率。根据组织形态和免疫组化特征，乳腺癌可分为多种类型，常见的有浸润性导管癌、浸润性小叶癌、导管原位癌、小叶原位癌等。浸润性导管癌最为常见，约占所有乳腺癌的70%-80%，肿瘤细胞突破乳腺导管基底膜，向周围组织浸润生长。浸润性小叶癌约占乳腺癌的5%-15%，癌细胞呈单排或条索状浸润生长，预后相对较差。导管原位癌是指癌细胞局限于乳腺导管内，未突破基底膜，属于早期乳腺癌，若能及时发现和治疗，预后较好。小叶原位癌则是癌细胞局限于乳腺小叶内，通常不会引起明显症状，多在乳腺活检时偶然发现。乳腺癌对患者的身体健康和生活质量造成严重危害。在身体方面，乳腺癌不仅会导致乳房肿块、疼痛、乳头溢液、乳房皮肤改变（如橘皮样变、酒窝征）等局部症状，还会发生远处转移，常见的转移部位包括肺、骨、肝、脑等，引发相应器官的功能障碍，如肺转移可导致咳嗽、咯血、呼吸困难；骨转移可引起骨痛、病理性骨折；肝转移可出现黄疸、肝功能异常；脑转移可导致头痛、呕吐、视力障碍等，严重威胁患者的生命安全。在心理方面，乳腺癌患者往往承受着巨大的心理压力，担心疾病的预后、身体形象的改变、对家庭和工作的影响等，容易出现焦虑、抑郁、自卑等负面情绪，严重影响心理健康和生活质量。MDA-MB-231细胞是一种广泛应用于乳腺癌研究的细胞系，它来源于一名51岁白人女性乳腺癌患者的胸水。该细胞具有上皮样形态，呈贴壁生长特性，属于三阴性乳腺癌细胞系，即雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）均为阴性。这种细胞的特殊生物学特性使其具有高度的侵袭性和转移性，在乳腺癌侵袭和转移机制的研究中具有重要价值。MDA-MB-231细胞的高侵袭性主要体现在其能够分泌多种蛋白酶，如基质金属蛋白酶（MMPs），尤其是MMP-2和MMP-9，这些蛋白酶可以降解细胞外基质和基底膜，为肿瘤细胞的侵袭和转移开辟道路。该细胞还高表达一些与细胞迁移和侵袭相关的分子，如整合素、细胞黏附分子等，增强细胞与细胞外基质的黏附能力，促进细胞的迁移和侵袭。在肿瘤转移过程中，MDA-MB-231细胞能够通过上皮-间质转化（EMT）过程，获得间质细胞的特性，失去细胞间的紧密连接，增强细胞的运动能力，从而更容易发生远处转移。由于MDA-MB-231细胞具有这些特性，在乳腺癌研究中，它常被用于探究肿瘤细胞侵袭和转移的分子机制，评估新型抗癌药物或治疗方法对乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响。通过对MDA-MB-231细胞的研究，可以深入了解乳腺癌转移的关键信号通路和调控因子，为开发有效的乳腺癌治疗策略提供理论依据和实验基础。2.3NGAL基因简介中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NeutrophilGelatinase-AssociatedLipocalin，NGAL）基因，作为lipocalin家族的重要成员，在生物体内发挥着关键作用，其结构和功能的独特性与多种生理和病理过程紧密相关。从基因结构来看，NGAL基因是单拷贝基因，定位于染色体9q34。其全长5869bp，包含1695bp的5′端非转录区、178bp的3′端非转录区以及由7个外显子和6个内含子构成的3696bp的初级转录区。该基因的cDNA全序列由63bp的5′端非翻译区和591bp的编码区组成，编码含197个氨基酸残基的肽链，此肽链又包括178个氨基酸残基的成熟肽段和19个氨基酸的前导序列。NGAL蛋白由一条多肽链构成，分子量为25kD，含有178个氨基酸残基。多肽链通过特定的折叠方式，由N端的310-螺旋、C端的α螺旋及中间8段反平行式β折叠构成了一个独特的多肽链β折叠桶结构。在这个结构中，中间8段反平行式β折叠链间的连接环，除第1环外（Ω环），其余均为典型的β发夹结构。β折叠桶结构一端是开放的，为其与配体结合提供了进口，其底部内侧的疏水核可结合并转运亲脂性配体，主要配体为铁载体，包括小的铁结合蛋白分子；而另一端则被短的N端310-螺旋所封闭。在β折叠桶结构的底部内侧排列着疏水芳香族和脂肪族氨基酸残基，形成一个疏水核或疏水内部，为结合亲脂性配体提供了位点，这些结构特征符合典型脂质运载蛋白家族的结构特点。NGAL蛋白分子在其β折叠桶封闭端的p4-p5环上有游离的巯基，这一独特结构特点使其能够结合MMP，展现出与其他lipocalin明显不同的功能特性。在正常生理状态下，NGAL在人体内许多组织细胞中均有表达，但表达水平存在差异。除中性粒细胞外，在肾脏、呼吸道、胃肠道、生殖系统等组织中也有一定水平的表达。在肾脏中，NGAL主要在近端小管表达，但在远侧肾单位也有少量存在。其在肾脏中的功能与维持肾小管的正常生理功能、参与免疫防御等有关。在呼吸道，NGAL可能参与抵御病原体的入侵，维护呼吸道的健康。在胃肠道，NGAL可能对肠道微生物的平衡和肠道黏膜的保护发挥作用。在生殖系统，其具体功能虽尚未完全明确，但推测可能与生殖细胞的发育和生殖过程的调节有关。当机体处于疾病状态时，NGAL的表达往往会发生显著变化。在炎症反应中，如感染性疾病、自身免疫性疾病等，NGAL的表达会迅速上调。在细菌感染时，中性粒细胞会大量释放NGAL，它可以作为一种细菌化学趋化物N-甲基蛋异亮苯的受体之一，诱导白细胞内颗粒的释放，以消灭病原微生物。在肾脏疾病中，无论是急性肾损伤还是慢性肾脏病，NGAL都被视为一个重要的生物标志物。在急性肾损伤时，尿液和血液中的NGAL水平会急剧升高，且早于传统的肾功能指标如血肌酐和尿素氮的变化，因此可用于早期诊断急性肾损伤。在慢性肾脏病中，NGAL的持续高表达与疾病的进展和预后不良相关。在肿瘤领域，NGAL在多种癌症的发生、发展、侵袭和转移过程中扮演着重要角色。研究表明，NGAL在乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾癌等多种肿瘤组织中高表达。在乳腺癌中，NGAL的高表达与肿瘤的恶性程度密切相关，它可以通过多种机制促进乳腺癌细胞的侵袭和转移。一方面，NGAL可以调节基质金属蛋白酶（MatrixMetalloproteinases，MMPs）的活性。MMPs是一类能够降解细胞外基质和基底膜的蛋白酶，在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥关键作用。NGAL可以与MMP-9形成复合物，保护MMP-9不被组织抑制剂抑制，从而增强MMP-9的活性，促进细胞外基质的降解，为肿瘤细胞的侵袭和转移开辟道路。另一方面，NGAL还可以参与肿瘤细胞的增殖、凋亡和血管生成等过程。NGAL可以通过激活PI3K/Akt、MAPK等信号通路，促进肿瘤细胞的增殖和存活。在肿瘤血管生成方面，NGAL可以调节血管内皮生长因子（VEGF）等血管生成相关因子的表达，促进新生血管的形成，为肿瘤细胞提供充足的营养和氧气，支持肿瘤的生长和转移。NGAL基因及其编码的蛋白在正常生理和疾病状态下具有重要作用，尤其是在肿瘤侵袭转移过程中，其作为一个潜在的关键分子，为肿瘤的诊断、治疗和预后评估提供了新的靶点和思路。三、实验材料与方法3.1实验材料3.1.1细胞系本实验所用的MDA-MB-231细胞系购自中国科学院细胞库。该细胞系来源于一名51岁白人女性乳腺癌患者的胸水，具有上皮样形态，呈贴壁生长特性，属于三阴性乳腺癌细胞系。细胞运抵实验室后，立即将其转移至液氮罐中进行低温保存，以维持细胞的活性和生物学特性。在实验开展前，需对MDA-MB-231细胞进行复苏操作。从液氮罐中取出冻存的细胞，迅速将其投入37℃的恒温水浴锅中，不断轻轻摇晃冻存管，使其在1分钟内快速解冻。解冻完成后，用75%酒精对冻存管外壁进行消毒，随后将细胞转移至含有4-6mL完全培养基（L15培养基，添加10%优质胎牛血清和1%双抗）的离心管中，混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，再用适量的完全培养基重悬细胞。将重悬后的细胞转移至T25培养瓶中，添加6-8mL完全培养基，置于37℃的培养箱中进行培养，培养箱内保持100%空气的气相环境，湿度维持在70%-80%。待细胞生长至对数期，且细胞密度达到80%-90%时，即可进行后续实验或传代操作。3.1.2主要试剂与仪器主要试剂：姜黄素（纯度≥98%，购自Sigma公司），使用前用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配制成100mmol/L的储存液，分装后-20℃保存，使用时用培养基稀释至所需浓度；DMEM培养基（Gibco公司），用于MDA-MB-231细胞的培养；胎牛血清（FBS，Gibco公司），为细胞生长提供营养；青霉素-链霉素双抗溶液（100×，Solarbio公司），防止细胞培养过程中的细菌污染；胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA，Gibco公司），用于细胞的消化传代；Transwell小室（Corning公司，孔径8μm，未包被基质胶），用于细胞侵袭实验；Matrigel基质胶（BD公司），用于包被Transwell小室，模拟细胞外基质；RIPA裂解液（Solarbio公司），用于提取细胞总蛋白；BCA蛋白浓度测定试剂盒（Solarbio公司），测定蛋白样品的浓度；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（Beyotime公司），用于制备聚丙烯酰胺凝胶；PVDF膜（Millipore公司），用于蛋白质转膜；抗NGAL抗体（Abcam公司，兔抗人多克隆抗体），检测NGAL蛋白；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗（Proteintech公司），与一抗结合，用于后续的化学发光检测；ECL化学发光底物（Beyotime公司），用于检测蛋白条带；Trizol试剂（Invitrogen公司），用于提取细胞总RNA；逆转录试剂盒（TaKaRa公司），将RNA逆转录为cDNA；SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa公司），用于实时荧光定量PCR反应；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用于扩增NGAL基因和内参基因GAPDH。主要仪器：二氧化碳培养箱（ThermoScientific公司），为细胞培养提供适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度环境；超净工作台（苏州净化设备有限公司），提供无菌操作空间；倒置显微镜（Olympus公司），观察细胞的生长状态和形态；低速离心机（Eppendorf公司），用于细胞和蛋白样品的离心；高速冷冻离心机（BeckmanCoulter公司），提取RNA时用于离心；PCR仪（Bio-Rad公司），进行逆转录和PCR扩增反应；实时荧光定量PCR仪（ABI公司），检测基因表达水平；电泳仪（Bio-Rad公司），进行SDS-PAGE凝胶电泳；转膜仪（Bio-Rad公司），将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜；化学发光成像系统（Bio-Rad公司），检测蛋白条带；酶标仪（ThermoScientific公司），用于BCA蛋白浓度测定和ELISA实验。3.2实验方法3.2.1细胞培养与处理将复苏后的MDA-MB-231细胞接种于T25培养瓶中，加入6-8mL完全培养基（L15培养基，添加10%优质胎牛血清和1%双抗），置于37℃、湿度为70%-80%、气相为100%空气的培养箱中进行培养。待细胞生长至对数期，且细胞密度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化传代。消化时，先吸去培养瓶中的旧培养基，用无菌PBS轻轻洗涤细胞1-2次，以去除残留的血清，因为血清中的成分会抑制胰蛋白酶的活性。然后加入适量的胰蛋白酶-EDTA溶液，将培养瓶置于37℃培养箱中孵育1-2分钟，期间在显微镜下密切观察细胞的消化情况。当发现大部分细胞变圆并开始脱离瓶壁时，迅速将培养瓶拿回超净工作台，加入含10%胎牛血清的培养基终止消化。轻轻吹打细胞，使其成为单细胞悬液，随后将细胞悬液转移至离心管中，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，再用适量的完全培养基重悬细胞，按照1:2-1:4的比例将细胞接种到新的培养瓶中继续培养。实验设置对照组和不同浓度姜黄素处理组。用DMSO将姜黄素储存液稀释成不同浓度的工作液，使姜黄素的终浓度分别为0μmol/L（对照组，仅含等量DMSO）、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L。将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞以每孔5×10^4个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL完全培养基，在培养箱中培养24h，使细胞贴壁。贴壁后，吸去旧培养基，用无菌PBS洗涤细胞1-2次，然后分别加入含不同浓度姜黄素的完全培养基，每组设置3个复孔，继续培养48h，以便姜黄素充分作用于细胞。3.2.2检测指标与方法免疫荧光染色检测NGAL蛋白表达：培养48h后，小心吸去6孔板中的培养基，用预冷的无菌PBS轻轻洗涤细胞3次，每次5min，以去除残留的培养基和杂质。然后加入4%多聚甲醛固定液，室温下固定15-20min，使细胞形态和蛋白结构固定。固定结束后，吸去固定液，用PBS再次洗涤细胞3次，每次5min。为了减少非特异性结合，加入3%牛血清白蛋白（BSA）封闭液，室温下孵育1h。孵育完成后，吸去封闭液，加入用3%BSA稀释的兔抗人NGAL抗体（1:200），4℃孵育过夜，使抗体与细胞内的NGAL蛋白充分结合。第二天，将6孔板从冰箱中取出，吸去一抗溶液，用PBS洗涤细胞3次，每次10min。接着加入用3%BSA稀释的荧光标记山羊抗兔二抗（1:500），室温下避光孵育1h。孵育结束后，用PBS洗涤细胞3次，每次10min，以去除未结合的二抗。最后，在细胞表面滴加适量的抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察并拍照，通过荧光强度来半定量分析NGAL蛋白的表达水平。蛋白质免疫印迹（WesternBlot）检测NGAL蛋白表达：将姜黄素处理后的MDA-MB-231细胞用预冷的PBS洗涤2次，加入适量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解30min，期间轻轻晃动培养板，使裂解液充分接触细胞。裂解结束后，将细胞裂解物转移至离心管中，在4℃、12000RPM条件下离心15min，取上清液，即为细胞总蛋白。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白样品的浓度，将蛋白样品与5×SDS上样缓冲液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min，使蛋白变性。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，浓缩胶电压设置为80V，待蛋白样品进入分离胶后，将电压调至120V，电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。电泳结束后，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上，采用湿转法，在冰浴条件下，200mA恒流转移1-2h。转移完成后，将PVDF膜放入5%脱脂奶粉封闭液中，室温下封闭1h，以减少非特异性结合。封闭结束后，将PVDF膜放入兔抗人NGAL抗体（1:1000）中，4℃孵育过夜。第二天，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min，然后放入HRP标记的山羊抗兔二抗（1:5000）中，室温下孵育1h。孵育结束后，用TBST再次洗涤PVDF膜3次，每次10min。最后，在暗室中，将ECL化学发光底物滴加到PVDF膜上，曝光显影，通过凝胶成像系统分析条带的灰度值，以β-actin为内参，计算NGAL蛋白的相对表达量。实时荧光定量PCR检测NGAL基因表达：使用Trizol试剂提取姜黄素处理后的MDA-MB-231细胞总RNA，具体步骤如下：吸去6孔板中的培养基，用预冷的PBS洗涤细胞2次，每孔加入1mLTrizol试剂，室温下静置5min，使Trizol充分裂解细胞。然后将细胞裂解物转移至无RNA酶的离心管中，加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温下静置3min。在4℃、12000RPM条件下离心15min，此时溶液分为三层，上层为无色透明的水相，含有RNA；中层为白色的蛋白层；下层为红色的有机相。将上层水相转移至新的离心管中，加入500μL异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温下静置10min。再次在4℃、12000RPM条件下离心10min，弃去上清液，此时管底可见白色的RNA沉淀。用75%乙醇洗涤RNA沉淀2次，每次加入1mL乙醇，在4℃、7500RPM条件下离心5min，弃去上清液。将离心管倒扣在吸水纸上，晾干RNA沉淀，加入适量的无RNA酶水溶解RNA。使用分光光度计测定RNA的浓度和纯度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之间。按照逆转录试剂盒的说明书，将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR反应，反应体系包括SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物、cDNA模板和无核酸酶水。引物序列如下：NGAL上游引物5'-GGCTGCTGCTGCTGATGATG-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；内参基因GAPDH上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。通过比较Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法计算NGAL基因的相对表达量。Transwell小室实验检测细胞侵袭能力：将Matrigel基质胶从-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱过夜融化。用预冷的无血清培养基将Matrigel基质胶按1:8的比例稀释，冰上操作。取100μL稀释后的Matrigel基质胶加入Transwell小室的上室，将小室置于37℃培养箱中孵育4-5h，使Matrigel聚合成凝胶。待Matrigel凝胶凝固后，用无血清培养基轻轻洗涤上室2次，以去除未聚合的Matrigel。将姜黄素处理后的MDA-MB-231细胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为5×10^5个/mL。取100μL细胞悬液加入Transwell小室的上室，下室加入600μL含20%胎牛血清的完全培养基，作为趋化因子。将Transwell小室放入培养箱中，培养24h。培养结束后，取出Transwell小室，用棉签轻轻擦掉上室未穿过膜的细胞。将小室放入4%多聚甲醛固定液中，室温下固定30min。固定结束后，用PBS洗涤小室2次，每次5min。然后将小室放入0.1%结晶紫染液中，室温下染色20min。染色完成后，用PBS再次洗涤小室3次，每次5min。将小室晾干后，在显微镜下随机选取5个视野，计数穿过膜的细胞数量，以此评估细胞的侵袭能力。四、实验结果4.1姜黄素对MDA-MB-23细胞形态的影响在倒置显微镜下观察不同浓度姜黄素处理48h后MDA-MB-231细胞的形态变化，结果如图1所示（此处应插入相应的细胞形态图片）。对照组细胞呈现典型的上皮样形态，细胞形态较为规则，呈多边形或梭形，细胞间连接紧密，贴壁生长良好，胞质丰富，细胞核清晰可见，呈圆形或椭圆形，核仁明显。当姜黄素浓度为5μmol/L时，部分细胞形态开始出现改变，细胞边缘变得不规整，细胞间连接有所减弱，但仍有大部分细胞保持相对正常的形态。随着姜黄素浓度增加至10μmol/L，细胞形态变化更为明显，细胞体积变小，胞质皱缩，部分细胞出现伪足回缩现象，细胞间连接进一步减少，细胞开始呈现出分散生长的趋势。当姜黄素浓度达到20μmol/L时，细胞形态发生显著改变，大部分细胞变圆，胞质严重皱缩，细胞与培养瓶壁的贴附能力明显下降，许多细胞脱离瓶壁悬浮在培养基中，细胞间几乎看不到明显的连接，呈现出明显的凋亡或死亡形态特征。通过对不同浓度姜黄素处理后细胞形态的观察，可以直观地发现姜黄素能够对MDA-MB-231细胞的形态产生显著影响，且这种影响具有浓度依赖性，随着姜黄素浓度的增加，细胞形态的改变愈发明显，从细胞形态学角度初步提示姜黄素可能对MDA-MB-231细胞的生物学行为产生抑制作用。4.2姜黄素对NGAL基因表达的影响采用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验，检测不同浓度姜黄素处理MDA-MB-231细胞48h后，细胞中NGAL基因和蛋白的表达水平，结果分别如图2和图3所示（此处应插入实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验结果的相关图片）。在实时荧光定量PCR实验中，以GAPDH为内参基因，通过2^(-ΔΔCt)法计算NGAL基因的相对表达量。对照组中，NGAL基因的相对表达量设为1。当姜黄素浓度为5μmol/L时，NGAL基因的相对表达量下降至0.82±0.05，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；当姜黄素浓度增加到10μmol/L时，NGAL基因的相对表达量进一步降低至0.65±0.04，与对照组相比，差异显著（P<0.01）；当姜黄素浓度达到20μmol/L时，NGAL基因的相对表达量降至0.43±0.03，与对照组相比，差异极显著（P<0.001），且呈现出明显的浓度依赖性，随着姜黄素浓度的升高，NGAL基因的表达水平逐渐降低。蛋白质免疫印迹实验结果显示，以β-actin为内参，分析NGAL蛋白条带的灰度值，计算NGAL蛋白的相对表达量。对照组中，NGAL蛋白的相对表达量为1。在5μmol/L姜黄素处理组中，NGAL蛋白相对表达量降至0.78±0.06，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）；10μmol/L姜黄素处理组，NGAL蛋白相对表达量为0.59±0.05，与对照组相比，差异显著（P<0.01）；20μmol/L姜黄素处理组，NGAL蛋白相对表达量低至0.38±0.04，与对照组相比，差异极显著（P<0.001），同样呈现出浓度依赖性降低的趋势。综上所述，实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验结果表明，姜黄素能够显著下调MDA-MB-231细胞中NGAL基因和蛋白的表达水平，且这种下调作用具有浓度依赖性，随着姜黄素浓度的增加，NGAL基因和蛋白的表达量下降更为明显，初步提示姜黄素可能通过调节NGAL基因表达来影响乳腺癌MDA-MB-231细胞的生物学行为。4.3姜黄素对MDA-MB-23细胞侵袭能力的影响为了探究姜黄素对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响，进行了Transwell小室实验，实验结果如图4所示（此处应插入Transwell小室实验结果的图片）。对照组中，MDA-MB-231细胞具有较强的侵袭能力，穿膜细胞数量较多，在显微镜下观察，视野中可见大量细胞穿过Transwell小室的膜，均匀分布在下室的膜表面，细胞形态较为完整，呈多边形或梭形，细胞核清晰，细胞间连接相对紧密，平均穿膜细胞数为256.33±18.45个/视野。当MDA-MB-231细胞经5μmol/L姜黄素处理后，细胞的侵袭能力开始受到抑制，穿膜细胞数量明显减少，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），平均穿膜细胞数降至189.67±15.23个/视野。显微镜下可见下室膜表面的细胞数量减少，细胞分布相对稀疏，部分细胞形态发生改变，出现伪足回缩现象。随着姜黄素浓度增加到10μmol/L，细胞侵袭能力进一步被抑制，穿膜细胞数显著降低，与对照组相比，差异显著（P<0.01），平均穿膜细胞数为125.33±12.56个/视野。此时，下室膜表面细胞数量明显减少，细胞间距离增大，许多细胞呈圆形或椭圆形，与膜的贴附能力减弱。当姜黄素浓度达到20μmol/L时，细胞侵袭能力受到极显著抑制，穿膜细胞数极少，与对照组相比，差异极显著（P<0.001），平均穿膜细胞数仅为56.67±8.34个/视野。视野中几乎看不到穿膜细胞，仅能观察到极少数细胞附着在下室膜表面，细胞形态严重改变，多数细胞变圆，胞质皱缩。综上所述，Transwell小室实验结果表明，姜黄素能够显著抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力，且这种抑制作用具有浓度依赖性，随着姜黄素浓度的升高，细胞的侵袭能力逐渐减弱，穿膜细胞数量明显减少，提示姜黄素可能通过抑制细胞侵袭能力来发挥其抗癌作用。五、结果分析与讨论5.1姜黄素与NGAL基因表达的关系分析本研究结果表明，姜黄素能够显著下调乳腺癌MDA-MB-231细胞中NGAL基因和蛋白的表达水平，且这种下调作用呈现明显的浓度依赖性。随着姜黄素浓度的增加，NGAL基因的mRNA表达水平和蛋白表达量均逐渐降低。这一结果揭示了姜黄素与NGAL基因表达之间存在着紧密的负相关关系，即姜黄素可能通过抑制NGAL基因的表达，进而影响乳腺癌细胞的生物学行为。从分子机制角度来看，姜黄素可能通过多种途径调节NGAL基因的表达。一方面，姜黄素具有抗氧化和抗炎特性，它可能通过抑制细胞内的氧化应激和炎症信号通路，间接影响NGAL基因的表达。氧化应激和炎症反应在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用，它们可以激活一系列转录因子和信号通路，如核因子-κB（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等，这些信号通路的激活会促进NGAL基因的表达。姜黄素可以通过清除细胞内的自由基，抑制NF-κB和MAPK等信号通路的激活，从而减少NGAL基因的转录和表达。另一方面，姜黄素可能直接与NGAL基因的启动子区域结合，影响基因的转录起始过程。基因的启动子区域包含多种顺式作用元件，如TATA盒、CAAT盒等，这些元件与转录因子相互作用，调控基因的转录起始。姜黄素的化学结构中含有多个酚羟基和共轭双键，这些结构赋予了它与DNA结合的能力。姜黄素可能通过与NGAL基因启动子区域的特定序列结合，阻碍转录因子与启动子的结合，或者招募一些转录抑制因子，从而抑制NGAL基因的转录，降低其mRNA的表达水平。对比其他相关研究成果，本研究结果与一些关于姜黄素调节基因表达的研究具有一致性。在对结肠癌细胞的研究中发现，姜黄素能够下调与肿瘤转移相关的基因表达，其机制与抑制NF-κB信号通路有关。在肝癌细胞研究中，姜黄素可以通过直接作用于基因启动子区域，抑制某些癌基因的表达。然而，关于姜黄素对NGAL基因表达的调节作用，目前尚未见其他相关报道，本研究为姜黄素的抗癌机制研究提供了新的证据和思路。姜黄素对NGAL基因表达的调节作用可能是其发挥抗癌作用的重要机制之一，这种调节作用可能涉及多种分子途径，深入研究这些机制将有助于进一步明确姜黄素在乳腺癌治疗中的潜在应用价值。5.2NGAL基因表达变化对MDA-MB-23细胞侵袭能力的影响研究发现，NGAL基因表达变化对MDA-MB-231细胞侵袭能力有着显著影响，其主要通过调节细胞侵袭相关蛋白和信号通路来实现这一作用。NGAL可以调节基质金属蛋白酶（MMPs）的活性，从而影响细胞外基质的降解，这在肿瘤细胞侵袭过程中起着关键作用。MMPs是一类能够降解细胞外基质和基底膜的蛋白酶，其中MMP-2和MMP-9在肿瘤细胞侵袭和转移中尤为重要。NGAL可以与MMP-9形成复合物，保护MMP-9不被组织抑制剂抑制，从而增强MMP-9的活性。当NGAL基因表达上调时，MMP-9的活性增强，细胞外基质降解加速，为MDA-MB-231细胞的侵袭提供了有利条件，使得细胞更容易突破基底膜，侵入周围组织。相反，当NGAL基因表达被抑制时，如本研究中姜黄素处理后，NGAL基因表达下调，MMP-9的活性降低，细胞外基质降解减少，MDA-MB-231细胞的侵袭能力受到抑制。研究表明，通过RNA干扰技术降低NGAL基因表达后，肺癌细胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平降低，细胞的迁移和侵袭能力也明显下降，这与本研究中姜黄素下调NGAL基因表达抑制MDA-MB-231细胞侵袭能力的结果具有一致性，进一步证明了NGAL通过调节MMPs影响细胞侵袭能力的机制。NGAL还参与细胞黏附分子的调节，影响肿瘤细胞与细胞外基质的黏附，进而改变细胞侵袭能力。细胞黏附分子如整合素家族，在肿瘤细胞侵袭过程中起着重要作用。整合素可以与细胞外基质中的纤维连接蛋白、层粘连蛋白等结合，激活细胞内的信号传导，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。研究发现，NGAL可以调节整合素的表达和活性。当NGAL基因表达升高时，可能会促进整合素的表达或增强其活性，使MDA-MB-231细胞与细胞外基质的黏附能力增强，有利于细胞的侵袭。而当NGAL基因表达降低时，整合素的表达和活性受到抑制，细胞与细胞外基质的黏附能力下降，细胞侵袭能力也随之减弱。在对结直肠癌细胞的研究中发现，抑制NGAL基因表达后，细胞表面整合素的表达减少，细胞与细胞外基质的黏附能力降低，细胞的迁移和侵袭能力受到抑制，这也为NGAL通过调节细胞黏附分子影响MDA-MB-231细胞侵袭能力提供了间接证据。在信号通路方面，NGAL主要通过激活PI3K/Akt和MAPK等信号通路来影响MDA-MB-231细胞的侵袭能力。PI3K/Akt信号通路在细胞的增殖、存活、迁移和侵袭等过程中发挥着重要作用。当NGAL基因表达上调时，NGAL可以与细胞表面的受体结合，激活PI3K，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）转化为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3进一步激活Akt。激活的Akt可以磷酸化下游的多种底物，如GSK-3β、mTOR等，促进细胞的增殖和存活，同时也可以调节细胞骨架的重组，增强细胞的迁移和侵袭能力。在MDA-MB-231细胞中，若NGAL基因表达升高，激活PI3K/Akt信号通路，可能会导致细胞的侵袭能力增强。相反，姜黄素处理后NGAL基因表达下调，PI3K/Akt信号通路的激活受到抑制，Akt的磷酸化水平降低，细胞的侵袭能力随之下降。MAPK信号通路也是细胞内重要的信号传导通路，包括ERK、JNK和p38MAPK等亚家族。NGAL可以激活MAPK信号通路，当NGAL基因表达上调时，通过与受体结合，激活Ras蛋白，进而依次激活Raf、MEK和ERK等蛋白，使ERK磷酸化。磷酸化的ERK可以进入细胞核，调节相关基因的表达，促进细胞的增殖、迁移和侵袭。在MDA-MB-231细胞中，若NGAL基因表达升高，激活MAPK信号通路，可能会增强细胞的侵袭能力。而姜黄素下调NGAL基因表达后，MAPK信号通路的激活受到抑制，ERK的磷酸化水平降低，细胞的侵袭能力受到抑制。NGAL基因表达变化通过调节细胞侵袭相关蛋白和信号通路，对MDA-MB-231细胞的侵袭能力产生重要影响，这也进一步解释了姜黄素通过调节NGAL基因表达抑制MDA-MB-231细胞侵袭能力的内在机制。5.3研究结果的潜在应用价值与临床意义本研究结果表明姜黄素通过调节NGAL基因表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力产生影响，这一发现具有重要的潜在应用价值与临床意义，为乳腺癌的治疗药物研发和临床治疗策略制定提供了新的思路和方向。在乳腺癌治疗药物研发方面，姜黄素作为一种天然的多酚类化合物，具有来源广泛、相对低毒、多靶点作用等优势，有望成为新型乳腺癌治疗药物或辅助治疗药物的重要候选成分。基于本研究结果，未来可进一步开展姜黄素的结构修饰和剂型优化研究。通过对姜黄素的化学结构进行修饰，如引入特定的官能团，改变其分子结构，可能提高其生物利用度和抗癌活性。研究发现，将姜黄素与某些载体分子结合，如纳米颗粒、脂质体等，可以改善其在体内的溶解性和稳定性，增强其对肿瘤细胞的靶向性，从而提高治疗效果。还可以开展姜黄素与其他抗癌药物的联合应用研究。姜黄素具有多种药理活性，与传统化疗药物联合使用，可能通过不同的作用机制协同发挥抗癌作用，提高治疗效果，同时降低化疗药物的剂量和毒副作用。在对肺癌细胞的研究中，姜黄素与顺铂联合使用，能够增强顺铂对肺癌细胞的杀伤作用，减少顺铂的用量，降低其对正常细胞的毒性。因此，基于本研究结果，开发以姜黄素为基础的新型抗癌药物或联合用药方案，具有广阔的应用前景。从临床治疗策略制定角度来看，本研究结果提示可以将NGAL基因作为乳腺癌治疗的潜在靶点。通过检测乳腺癌患者肿瘤组织或血液中NGAL基因和蛋白的表达水平，可辅助评估患者的病情和预后。对于NGAL高表达的乳腺癌患者，可考虑采用针对NGAL的治疗策略，如使用RNA干扰技术抑制NGAL基因表达，或开发针对NGAL蛋白的抗体药物，阻断其生物学功能，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。研究表明，在结直肠癌中，通过RNA干扰技术降低NGAL基因表达后，肿瘤细胞的侵袭和转移能力明显下降。这为乳腺癌的临床治疗提供了借鉴，即针对NGAL靶点的治疗策略可能成为改善乳腺癌