第十单元　第61课时　基因工程的基本工具和基本操作程序

第61课时基因工程的基本工具和基本操作程序1.概述基因工程是在微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展起来的。2.阐明重组DNA技术的三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序。课标要求考情分析1.基因工程的基本工具2023·新课标·T6

2021·全国乙·T38

2021·湖北·T72.基因工程的基本操作程序2023·全国乙·T38

2023·全国甲·T38

2023·湖北·T4

2023·广东·T202021·广东·T22内容索引考点一基因工程的基本工具考点二

基因工程的基本操作程序课时精练考点一基因工程的基本工具1.基因工程的概念DNA分子转基因遗传特性生物类型基因重组2.基因工程的诞生和发展(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明了DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间

。(2)DNA双螺旋结构的提出和

的证明。(3)中心法则的确立。(4)

的破译。转移半保留复制遗传密码(5)基因转移载体的发现。

的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。(6)

体外重组的实现。(7)重组DNA表达实验的成功。(8)DNA测序和合成技术的发明。(9)

技术的发明。(10)

技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。限制酶、DNA连接酶和逆转录酶DNAPCR基因组编辑3.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)原核生物数千特定核苷酸序列磷酸二酯键磷酸二酯键提醒

①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。③在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。(2)DNA连接酶磷酸二酯键大肠杆菌黏性末端黏性末端(3)载体环状双链DNA分子噬菌体有一个至多个自我复制受体DNA标记(1)基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的(

)提示基因工程是人工操作导致的基因重组，变异是定向的。×(2)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA(

)提示DNA连接酶可以将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。×(3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(

)提示限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具，前两者属于工具酶，质粒属于载体。×(4)质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因(

)提示质粒上的抗生素抗性基因常作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。×将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoRⅠ和Nhe

Ⅰ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题：(1)请用图示法写出限制酶EcoRⅠ和Nhe

Ⅰ切割后形成黏性末端的过程。提示限制酶EcoRⅠ：限制酶Nhe

Ⅰ：(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。提示用限制酶Mun

Ⅰ和Spe

Ⅰ切割目的基因。限制酶Mun

Ⅰ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶Nhe

Ⅰ和Spe

Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoRⅠ和Nhe

Ⅰ切割质粒，应选用Mun

Ⅰ和Spe

Ⅰ切割目的基因。限制酶的选择(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的某著名企业方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择Pst

Ⅰ和EcoR

Ⅰ两种限制酶。(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。考向一辨析基因工程的基本工具1.限制性内切核酸酶HindⅢ和XhoⅠ的识别序列及切割位点分别为A↓AGCTT和C↓TCGAG，下列相关叙述正确的是A.两种限制酶是在同一种生物中分离出来的B.两种限制酶切割DNA形成的黏性末端相同C.用HindⅢ酶切割含目的基因的DNA片段和用XhoⅠ酶切割质粒后，目

的基因和质粒能连接成重组质粒D.实验中可通过控制反应时间、酶的浓度等控制酶切效果12√限制酶命名是用生物属名的头一个字母与种名的头两个字母组成的，由此可知HindⅢ和XhoⅠ是从不同的生物中分离得到的，A错误；两种限制酶识别和切割的序列分别为A↓AGCTT和C↓TCGAG，则两者切割后形成的黏性末端分别是AGCT－、TCGA－，B错误；两种限制酶切割形成的黏性末端不同，无法连接成重组质粒，C错误。122.(2024·高三调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是项目细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况细菌在含四环素的培养基上生长情况①能生长不能生长②能生长能生长③不能生长能生长12A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是bC.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶√12项目细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况细菌在含四环素的培养基上生长情况①能生长不能生长②能生长能生长③不能生长能生长质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。12与DNA有关的几种酶的比较返回考点二基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞

或获得预期

等的基因。(2)筛选合适的目的基因①从相关的已知

的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用

和序列比对工具进行筛选。性状表达产物结构和功能清晰序列数据库(3)目的基因的获取①人工合成目的基因。②PCR

和扩增目的基因a.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据

的原理，在体外提供参与DNA复制的各种

与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行

的技术。b.PCR反应的条件：一定的

、DNA模板、2种

、4种_____

、

DNA聚合酶，以及能自动调控

的仪器。获取DNA半保留复制组分大量复制缓冲溶液引物脱氧核苷酸耐高c.PCR扩增的过程90单链50引物72耐高DNA聚合酶d.PCR产物的鉴定：常采用

来鉴定。③通过构建

来获取目的基因。2.基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因

，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。琼脂糖凝胶电泳在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代(2)基因表达载体的组成及作用启动子标记基因(3)构建过程提醒

启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(正常情况下，不编码氨基酸)生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法、_____________显微注射法

处理法受体细胞_____________________原核细胞3.将目的基因导入受体细胞花粉管通道法Ca2＋体细胞或受精卵受精卵生物种类植物动物微生物转化过程将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入辨析

(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。4.目的基因的检测与鉴定(1)目的基因一定是编码蛋白质的基因(

)提示目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。×(2)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋(

)√(3)基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束(

)提示启动子和终止子决定着转录的开始与结束。×(4)Ti质粒上的T－DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起(

)√(5)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(

)提示为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时能以受精卵为受体，也能以体细胞为受体。×(6)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术(

)提示检测目的基因是否导入受体细胞的方法是PCR等技术。×1.Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。回答下列问题：(1)什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？提示引物是指一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此复制DNA时应加入两种引物。(2)PCR扩增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列吗？提示不需要，只要知道Bt基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。(3)为检测Bt基因在转基因抗虫棉细胞中是否转录，科研人员提取棉花细胞中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Bt基因的cDNA，原因是什么？提示引物是依据Bt毒蛋白基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Bt基因的cDNA特异性结合)。(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律如图所示，若一个Bt毒蛋白基因在PCR中经过n轮循环，理论上得到多少个DNA分子？含引物的DNA分子多少个？含其中一种引物的DNA分子多少个？同时含两种引物的DNA分子多少个？共需要消耗多少个引物？含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？含等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？提示经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2n个，含其中一种引物的DNA分子数(2n－1)个，同时含两种引物的DNA分子(2n－2)个，共需要消耗(2n＋1－2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子(2n－2n)个。(5)PCR扩增Bt基因的过程中需要解旋酶吗？并说明理由。所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？提示不需要解旋酶，因为PCR过程中，DNA双链在高可完成解旋。由于PCR过程高，故所需要的DNA聚合酶应具有耐高点。2.据图分析抗虫棉的培育过程。(1)该过程中的目的基因是

，载体是

。(2)基因工程中，往往使用两种限制酶切割目的基因，这样做的原因是什么？Bt基因Ti质粒提示为了避免目的基因和载体的自身环化和反向连接。(3)为了保证目的基因在受体细胞中能正确表达，对目的基因在质粒中的插入位点有什么要求？提示目的基因应插入启动子与终止子之间。(4)该实例中，导入目的基因的方法是

。为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？提示由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入T－DNA，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。农杆菌转化法(5)将目的基因导入受体细胞时，能否仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上？为什么？提示一般不能。如果仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，由于细胞分裂可能导致目的基因丢失，无法稳定遗传。(6)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪些？

提示抗原—抗体杂交、用棉叶饲喂棉铃虫。考向二辨析基因工程的基本操作程序3.(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，

不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重

组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落34√若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；34DNA凝胶电泳技术可以分离出不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与原质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；Sph

Ⅰ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。344.(不定项)(2024·滨州高三模拟)土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T－DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述不正确的是A.目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNAB.用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞C.Ti质粒是一种环状DNA分子，没有双螺旋结构D.可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上34√√√在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入到T－DNA片段上，有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上，A错误；农杆菌侵染植物细胞不需要用Ca2＋处理，B错误；Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌细胞质中的DNA，具有双螺旋结构，C错误。341.(选择性必修3P67)基因工程：按照人们的愿望，通过

等技术，赋予生物新的

，创造出更符合人们需要的新的________________

。2.(选择性必修3P71)限制酶能够识别

，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。3.(选择性必修3P72)载体上有特殊的标记基因，便于__________________。转基因遗传特性生物类型和生物产品双链DNA分子的特定核苷酸序列重组DNA分子的筛选4.(选择性必修3P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供

、

、4种

和耐高

。5.(选择性必修3P77)真核细胞和细菌的

都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段______________

，引物的作用是________________

。DNA模板2种引物脱氧核苷酸DNA聚合酶DNA聚合酶能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸6.(选择性必修3P80)基因表达载体的构建的目的：使目的基因__________

，同时，使目的基因能够___________

。基因表达载体是载体的一种，除目的基因、

外，还必须含有启动子、终止子等。启动子是

识别和结合的部位，有了它才能驱动基因

，最终表达出人类需要的

。7.(选择性必修3P81)转化：________________________________________

。在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代表达和发挥作用标记基因RNA聚合酶转录出mRNA蛋白质目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程8.(选择性必修3P81～82)将目的基因导入植物细胞的方法是

、

；导入动物细胞的方法是

；导入微生物细胞的方法是

处理法。农杆菌转化法花粉管通道法显微注射法Ca2＋9.(选择性必修3P82)目的基因的检测与鉴定：首先是分子水平的检测，包括通过

等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA；从转基因棉花中提取

，用相应的____进行

，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过_______________________

来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。PCR蛋白质抗体抗原—抗体杂交采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫10.如图为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点为：HindⅢ(A↓AGCTT)、PvitⅡ(CAG↓CTG)、KpnⅠ(G↓GTACC)、EcoRⅠ(G↓AATTC)、PstⅠ(CTGCA↓G)、BamHⅠ(G↓GATCC)。为使phb2基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入

和

两种不同限制酶的识别序列。将经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用________

(填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)。返回Pvit

ⅡEcoRⅠT4DNA连接酶课时精练一、选择题：每小题给出的四个选项中只有一个符合题目要求。1.(2024·长沙高三调研)基因工程中需使用多种工具酶，几种限制酶的切割位点如图所示。下列说法正确的是A.限制酶Sma

Ⅰ和EcoRV切

割形成的末端，可以通过

E.coli

DNA连接酶相互连接B.DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成C.限制酶EcoRⅠ进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的5′末端D.若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互

连接√12345678910111213限制酶Sma

Ⅰ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，可以通过T4DNA连接酶相互连接，E.coliDNA连接酶只能连接互补的黏性末端，A错误；一个限制酶切割一次，使DNA双链断开，会有2个磷酸二酯键断裂，形成2个游离的5′末端，C错误；若两种限制酶的识别序列相同，但由于切割位点不同，切割形成的末端不同，不一定能通过DNA连接酶相互连接，D错误。123456789101112132.(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。12345678910111213下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接√12345678910111213酶3切割后得到的是平末端，应该用T4DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；12345678910111213质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；12345678910111213若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。123456789101112133.(2024·泰州高三质检)RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示。下列说法不正确的是A.设计扩增目的基因的引物时需

考虑目的基因两端的碱基序列B.G/C含量高的引物在与模板链

结合时，复性的高C.该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度D.过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、TaqDNA聚合酶和引物A等√12345678910111213过程Ⅰ是逆转录过程，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和引物A等，D错误。123456789101112134.(2024·青岛高三二模)转基因植物中标记基因的剔除可有效防止基因污染，剔除常用分离剔除法和重组剔除法。分离剔除法是在转基因时将目的基因和标记基因分别构建在两个Ti质粒上，通过共转化得到转基因植物后让其自交得到不含标记基因的转基因个体；重组剔除法利用Cre/LoxP重组酶系统，Cre酶能有效剔除重组载体中含有标记基因的序列，只留下一个LoxP位点，具体原理如图。下列说法不正确的是12345678910111213A.利用分离剔除法时，目的基因和标记基因都应插到Ti质粒的T－DNA

序列B.分离剔除时目的基因和标

记基因插到植物细胞的同

源染色体或非同源染色体

上均可成功C.上述重组载体中启动子1在农杆菌中可发挥作用，而在植物细胞中不能

发挥作用D.经重组剔除后的标记基因，因没有启动子而无法启动基因的转录12345678910111213√Ti质粒的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上，所以利用分离剔除法时，目的基因和标记基因都应插到Ti质粒的T－DNA序列，进而成功整合到受体细胞染色体DNA上，A正确；12345678910111213分离剔除时目的基因和标记基因插到植物细胞的同源染色体或非同源染色体上最终均可获得不含标记基因的转基因个体，即均可成功，B正确；12345678910111213重组剔除时，Cre酶基因应该在植物细胞中表达，故上述重组载体中启动子1在农杆菌中不能发挥作用，而在植物细胞中能发挥作用，C错误；由图可知，经重组剔除后的标记基因没有启动子，无法启动基因的转录，D正确。123456789101112135.(2024·聊城高三联考)如图是培育抗除草剂玉米的技术路线图，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列相关叙述正确的是12345678910111213A.过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA中，导致T－DNA片段失活B.过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化C.过程②用Ca2＋处理，使农杆菌细胞壁通透性改变，使其处于能吸收周

围环境中DNA分子的生理状态D.过程③应在培养基中加入除草剂和物质K√12345678910111213过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA中，不会导致T－DNA片段失活，A错误；过程①使用两种限制酶，且这两种限制酶切割产生的黏性末端不同，才可以防止酶切产物自身环化，B错误；12345678910111213过程③应在培养基中加入除草剂和物质K，除草剂是用来检测目的基因是否正确表达，物质K是用来检测目的基因有没有导入植物细胞中，加入除草剂可保留转化的愈伤组织和附着农杆菌但未转化的愈伤组织，其中变蓝的为转化的愈伤组织，D正确。123456789101112136.(2024·扬州高三一模)我国科学家利用Xba

Ⅰ和Sac

Ⅰ两种限制酶，并运用农杆菌转化法，将富含赖氨酸的蛋白质编码基因(含678bp)导入某植物细胞，再经植物组织培养获得转基因植株，使赖氨酸的含量比对照组明显提高，如图表示相关培育过程(质粒的其他部位和目的基因均无Xba

Ⅰ、Sac

Ⅰ、HindⅢ的识别位点)，下列说法不正确的是12345678910111213A.一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增4次，共产生8个等长DNA分子B.农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法C.植物组织培养过程中，培养基需添加卡那霉素以便筛选转基因植株D.使用Sac

Ⅰ和HindⅢ切割重组质粒后能得到1500bp左右的片段√12345678910111213一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增4次共产生等长的DNA分子数24－2×4＝8(个)，A正确；因为插入植物细胞染色体上的是质粒的T－DNA，而卡那霉素抗性基因不在此片段上，导入成功的植物细胞对卡那霉素无抗性，C错误；12345678910111213根据切割目的基因的限制酶在质粒上的切割位点，可知由于重组质粒上移除1900bp而补充了含678bp的目的基因，加上未移除的822bp，所以用SacⅠ和HindⅢ切割重组质粒后，可得到822＋678＝1500(bp)左右的新片段，D正确。123456789101112137.(2024·永州高三三模)自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。12345678910111213下列相关叙述错误的是A.题述获得蓝色玫瑰的方案中不

需要转入能调控液泡pH的基因B.将sfp基因插入Ti质粒时使用的

限制酶是Pme

Ⅰ和BamHⅠC.同时使用Spe

Ⅰ和Sac

Ⅰ能提高idgS基因和Ti质粒的重组效率D.sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的√12345678910111213靛蓝能够稳定显色，不受pH的影响，故本题方案中不需要转入能调控液泡pH的基因，A正确；将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是Pme

Ⅰ和BamHⅠ，则会将终止子一同切除，故只能用BamHⅠ，B错误。12345678910111213二、选择题：每小题给出的四个选项中有一个或多个符合题目要求。8.(2024·湘潭高三质检)限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，下列说法正确的是A.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割某著名企业花叶病毒的核酸C.只有用相同限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，才能形成重组

质粒D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，不能剪切自身的DNA12345678910111213√√DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；用不同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，也可能形成相同的黏性末端，进而形成重组质粒，C错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D正确。123456789101112139.(2024·益阳高三联考)某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，使青蒿素合成过程中的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，其过程如图所示。下列有关叙述正确的是A.也可用PCR技术直接扩增RNA来获取目的基因B.酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键C.本过程中，可以采用一种、两种甚至四种酶2D.通过PCR技术可检测fps基因是否表达出蛋白质√12345678910111213√PCR技术不能直接扩增RNA来获取目的基因，A错误；据图可知，酶1表示逆转录酶，酶2表示限制酶，酶3表示DNA连接酶，酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键，B正确；12345678910111213不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，因此为了成功构建表达载体，可以采用一种、两种甚至四种酶2切割含fps基因的DNA片段和质粒a，C正确；进行抗原—抗体杂交可检测fps基因是否表达出蛋白质，D错误。1234567891011121310.(2024·潍坊高三质检)图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是A.若通过PCR技术提取该目的基

因，应该选用引物a和引物cB.构建表达载体时应选用BamHⅠ

和HindⅢ这两种限制酶C.若将基因表达载体导入大肠杆菌中，需用Ca2＋处理大肠杆菌D.只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受体细胞123456789101112√13√根据图甲可知，BamHⅠ会导致两种抗性基因都被破坏，所以不宜选用BamHⅠ，为防止目的基因自身环化，可选用Bcl

Ⅰ和HindⅢ两种限制酶切割，B错误；由于选择Bcl

Ⅰ和HindⅢ这两种限制酶，破坏了氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此应该先用含四环素的培养基筛选出含有基因表达载体和普通质粒的大肠杆菌，再用含氨苄青霉素的培养基筛选含重组质粒的大肠杆菌，D错误。12345678910111213三、非选择题11.(2021·全国乙，38)用重组DNA技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。12345678910111213回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，上图中_______________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA连接酶连接，上图中________________________________切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。12345678910111213EcoRⅠ、Pst

ⅠEcoRⅠ、Pst

Ⅰ、Sma

Ⅰ和EcoRⅤ限制酶EcoRⅠ和Pst

Ⅰ切割形成的是黏性末端，限制酶Sma

Ⅰ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRⅠ和Pst

Ⅰ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coliDNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶Sma

Ⅰ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4DNA连接酶连接。12345678910111213DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。12345678910111213磷酸二酯键(3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中__________；质粒DNA分子上有_______________________，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是__________________________________________________________________________。自我复制一至多个限制酶切割位点

用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞12345678910111213质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的切割位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因便于重组DNA分子的筛选，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。12345678910111213(4)表达载体含有启动子，启动子是指___________________________________________________________________________________________。

位于基因上游的一段有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程12345678910111213启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。12.(2024·常德高三调研)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质，决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示，其中A链为编码链、B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞，获得对重金属镉(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。回答下列问题：12345678910111213注：Xho

Ⅰ、Kpn

Ⅰ、Pst

Ⅰ为不同限制酶的识别位点；LacZ基因编码产生的β－半乳糖苷酶可以催化无色物质X－gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色；AmpR基因为氨苄青霉素抗性基因。12345678910111213(1)获取目的基因：提取枣树细胞的_______，经逆转录获得cDNA。为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接，克隆MT基因时应选择的引物组合是_______________，并在其____(填“5′”或“3′”)端分别添加限制酶______________的识别序列。mRNA引物Ⅱ和引物Ⅲ5′Kpn

Ⅰ和Xho

ⅠPCR过程中，引物与模板链的3′端结合，因此应当选择引物Ⅱ和引物Ⅲ，这样才能使耐高DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。由题干可知，B链为模板链，转录是沿着模板链的3′→5′方向进行的，应将MT基因的左端与启动子一侧连接，由于目的基因12345678910111213中含有Pst

Ⅰ的识别序列，不宜选用Pst

Ⅰ，同时为了保证MT基因正向连接到质粒上，应当在MT基因两侧添加不同的限制酶识别序列，故在引物Ⅱ和引物Ⅲ末端添加的限制酶序列分别是Kpn

Ⅰ和Xho

Ⅰ限制酶识别序列。引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰，故限制酶的识别序列应加在引物的5′端。12345678910111213(2)构建重组DNA分子：启动子是____________识别并结合的部位。基因工程中构建用于原核生物的表达载体时，常用的启动子不包括以下哪一项？_____。A.噬菌体基因启动子

B.乳酸菌基因启动子C.大肠杆菌基因启动子 D.枣树MT基因启动子RNA聚合酶D12345678910111213启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。乳酸菌和大肠杆菌都是原核生物，它们的启动子可以用于构建原核生物的表达载体；噬菌体是寄生于细菌中的病毒，噬菌体基因启动子可用于构建原核生物表达载体；枣树MT基因启动子不适合用于构建原核生物表达载体。12345678910111213(3)导入、筛选和鉴定MT工程菌。①将得到的混合物导入到用______处理的大肠杆菌完成______实验。Ca2＋转化12345678910111213大肠杆菌是原核生物，需要Ca2＋处理，使其处于一种收境中DNA分子的生理状态，完成将基因表达载体导入受体细胞并在受体细胞内维持稳定和表达的过程，即转化。12345678910111213②将菌液稀释并涂布在含X－gal和氨苄青霉素的培养基上进行培养后，随机挑取______的单菌落可获得MT工程菌。白色12345678910111213在含有氨苄青霉素的培养基上，导入了空白质粒和重组质粒的大肠杆菌都可以形成菌落，但导入重组质粒的大肠杆菌Lac