液相色谱仪操作标准流程

液相色谱仪操作标准流程液相色谱仪（HPLC）作为分离分析复杂混合物的核心设备，其操作规范性直接影响分析结果的准确性与仪器使用寿命。本文结合实验室实践经验，梳理从准备到维护的全流程操作要点，助力从业者高效、安全地开展分析工作。操作前的准备工作流动相与溶剂系统流动相应根据分析方法要求配置，优先选用色谱纯试剂，水相需用超纯水（电导率≤1.0μS/cm）。混合流动相需充分搅拌后超声脱气20-30分钟（或使用在线脱气机），避免气泡进入泵体；含缓冲盐的流动相应现配现用，防止微生物滋生堵塞管路。色谱柱与进样系统色谱柱检查：安装前确认柱身无破损，柱压在正常范围（新柱≤10MPa，使用中柱压升高≤30%为正常）。安装时注意流动相流向与柱上箭头一致，接头拧紧至不漏液（避免过度用力损坏螺纹）。进样针维护：手动进样针用甲醇反复抽吸-排出（≥5次），检查针尖是否堵塞；自动进样针需确认针座清洁，进样体积校准无误。仪器开机与系统平衡模块启动顺序依次开启电源总开关→泵（Pump）→进样器（Autosampler）→柱温箱（ColumnOven）→检测器（Detector），待各模块自检完成（屏幕显示“Ready”）后，进入工作站软件。系统排气与平衡泵排气：打开泵排液阀（PurgeValve），设置流速5ml/min，按“Purge”键使流动相流经泵头、管路，直至流出液无气泡（约3-5分钟）。关闭排液阀，调节流速至分析方法要求（如1ml/min）。色谱柱平衡：待泵压稳定后（波动≤0.1MPa），保持流动相流经色谱柱，平衡时间≥10倍柱体积（例：柱体积1ml、流速1ml/min时，平衡10分钟）。若采用梯度洗脱，需先以初始流动相平衡色谱柱，确保基线平稳。分析方法的建立与参数设置在工作站软件中新建方法，根据样品特性设置关键参数：泵参数：流速（0.5-2ml/min，反相色谱常用1ml/min）、流动相比例（等度/梯度洗脱，梯度洗脱需设置时间-比例曲线）。柱温箱：温度（25-40℃，稳定样品可设30℃），确保柱温波动≤0.5℃。检测器：波长（根据样品最大吸收峰确定，如254nm、210nm）、采样频率（10-20Hz，兼顾峰形与数据量）。进样参数：进样量（1-20μl，避免过载）、进样针清洗次数（≥3次，防止交叉污染）。设置完成后，保存方法并进行“空白运行”（注入流动相），确认基线噪声≤0.5mAU、漂移≤1mAU/h，方可进行样品分析。样品分析与数据采集样品预处理液体样品经0.22μm有机/水系滤膜过滤（根据流动相选择），去除颗粒物；粘稠样品需稀释至合适浓度，避免柱过载。样品瓶需洁净、无残留，液面高度≥进样针长度的1/2。进样与运行手动进样：将进样阀旋至“Load”，用进样针吸入样品（过量10-20%，排除气泡），注入进样环后旋至“Inject”，同时点击软件“开始采集”。自动进样：将样品瓶放入进样盘，设置进样序列（样品位置、进样量、运行时间），启动序列后仪器自动完成进样、分析、清洗。分析过程中实时监控色谱图：保留时间RSD≤2%、峰面积RSD≤5%为合格；若峰形异常（拖尾、分叉）或基线漂移，需暂停分析排查原因。关机流程与日常维护系统冲洗分析结束后，用过渡流动相（如10%甲醇水）以0.5ml/min流速冲洗色谱柱30分钟（去除盐分），再用纯甲醇（或乙腈）冲洗30分钟（封存色谱柱，防止固定相水解）。若使用含缓冲盐的流动相，需先将泵比例切换为100%水相冲洗10分钟，再换甲醇冲洗，避免盐结晶堵塞管路。模块关机顺序依次关闭检测器→柱温箱→进样器→泵→电源总开关。关闭泵前需将流速降至0，避免压力突变损坏泵头。日常维护要点色谱柱：长期不用时，柱两端密封，存放于4℃环境；每季度用纯甲醇反向冲洗（若柱允许），恢复柱效。进样系统：每周清洗进样针（超声+甲醇冲洗），每月更换进样垫，检查进样阀转子密封。流动相瓶：每月用硝酸浸泡（水相瓶）或甲醇冲洗（有机相瓶），防止微生物滋生。异常情况的排查与处理压力异常压力过高：检查管路是否堵塞（断开柱后管路，压力仍高则为泵或管路问题）、色谱柱是否污染（冲洗后柱压无下降则需更换）。压力过低：排查接头是否漏液（用滤纸检测）、泵密封圈是否老化（更换密封圈）。峰形异常峰拖尾：样品过载（减少进样量）、柱污染（用5%甲酸水+乙腈梯度冲洗）、流动相pH不适（调整pH至2-8）。峰分叉：进样体积过大（减小进样量）、色谱柱柱头塌陷（截去柱头1-2mm或更换柱芯）。基线噪声大流动相问题：重新脱气或更换流动相；检测器问题：清洗流通池（