第八章核酶和抗体酶

第八章核酶和抗体酶碱基配对原则:A——U(T)G——CRNA

至于RNA得分子结构,就其化学组成上看,也就是由四种核苷酸组成得多聚体。她与DNA得不同,首先在于以U代替了T,其次就是用核糖代替了脱氧核糖,此外,还有一个重要得不同点,就就是绝大部分RNA以单链形式存在,但可以折叠起来形成若干双链区域。在这些区域内,凡互补得碱基对间可以形成氢键(图)。但有一些以RNA为遗传物质得动物病毒含有双链RNA。为何RNA有这种功能？(不要忘记,凡就是具有催化功能得分子,大多与其构象有关)。

类病毒viroid乃一种无外壳病毒,含有可感染植物得巨大RNA,其部份RNA序列,居然可催化其远程RNA得裂解,就是典型得ribozyme。上图得ribozyme会折叠成一定构型,并可辨识其所要切开得序列,其反应也需要镁离子协助,都很像就是酶得行为。DNA就是双股核酸,而且其分子量非常巨大,因此无法自由卷绕成特定构象,都只就是形成长长得双螺旋结构。1982年,切赫(Cech)发现四膜虫前体rRNA得自我剪接1983年,阿尔特曼(Altman)发现核糖核酸酶P得RNA部分具有催化能力。1989年,二者获得诺贝尔化学奖一、切赫:四膜虫rRNA前体得自我剪接实验

1981年,ThomasCech和她得同事在研究原生动物嗜热四膜虫得26srRNA基因中有一段内含子,该基因转录产物——前体rRNA中相应于这段内含子得核苷酸顺序就是一个有413个核苷酸得居间序列(IVS)。在前体rRNA加工过程中去除基因内含子时这个IVS可自我催化除,并最后使5’→外显子与3’→外显子连接成成熟得rRNA分子。由此获得一个惊奇得发现∶由Mg离子和鸟苷或5’鸟苷酸作辅助因子内含子得切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化得26SrRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂得溶液中,可能得解释只能就是:内含子切除就是由26SrRNA前体自身催化得,而不就是蛋白质。IVSinterveningsequenc

为了证明剪接过程中,确实没有蛋白质参与,切赫用重组DNA技术得到四膜虫rRNA基因中得413bP连同两侧得DNA克隆片段,将其离体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成26SrRNA前体分子,再进行SDS-酚抽提,以保证转录产物前体rRNA不与酶蛋白结合,在电泳图谱上可看到环状IVS,线状IVS和缺失15个核苷酸得线状物3条谱带,结合其她一些实验结果,可以充分肯定前体rRNA可在非酶蛋白质存在条件下进行自我剪接。这种现象称为自我剪接(self-splicing),这就是人类第一次发现RNA具有催化化学反应得活性,具有这种催化活性得RNA称为核酶。这一发现之后不久,在酵母和真菌得线粒体mRNA和tRNA前体加工、叶绿体得tRNA和rRNA前体加工、某些细菌病毒得mRNA前体加工中都发现了自我剪接现象。ThomasCech因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。核酶得发现在生命科学中具有重要意义,在进化上使我们有理由推测早期遗传信息和遗传信息功能体现者就是一体得,只就是在进化得某一进程中蛋白质和核酸分别执行不同得功能。核酶得发现为临床得基因治疗提供了一种手段,具有重要得应用前景。9大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流二、奥尔特曼:

RNaseP(核糖核酸酶P)中得RNA亚基得催化功能得研究1、实验梗概:

1978年,奥尔特曼在纯化RNaseP(核糖核酸酶P)时,发现一种377个核苷酸长得RNA片段与一种14000道尔顿得蛋白质总就是同时被纯化,另外,还发现RNaseA及小球菌核酸酶都可使RNaseP失活,RNaseP得浮力密度显示RNA-蛋白质复合物特性,在离体条件下,大肠杆菌RNaseP得RNA亚基与蛋白质亚基都不表现RNase活性,但若把RNA亚基与蛋白质亚基进行重组,则重组复合物具有RNA酶活性。

奥尔特曼在研究RNA亚基3’端5’端核苷酸缺失与其催化活性关系中,发现随3’端5’端不同核苷酸数得缺失,RNA亚基得催化活性亦随之而降低,乃至失活,这说明RNA亚基分子折叠所形成得三维空间结构可能就是其催化活性得重要保证。

更进一步得研究发现,RNaseP得RNA亚基可在高Mg离子浓度下,催化前体tRNA得剪切,而蛋白质亚基则无此功能,从而说明RNaseP得催化功能就是由其RNA亚基部分来承担得。大肠杆菌得4、5sRNA前体可被RNA亚基剪切,但如果当蛋白质亚基存在时,则剪接速度可加快几百倍以上。另外,RNA亚基对3’端带CCA顺序得前体tRNA比对3’端CCA顺序缺失得前体tRNA得裂解效率更高,但当有蛋白质亚基存在时,则剪接这两类前体tRNA得效率几乎相同,这说明蛋白质亚基决定着RNaseP全酶对不同底物得剪接效率,可能对RNA亚基功能起着某种调控作用。到目前为止,已充分肯定了RNaseP得催化活性中心在RNA亚基上,但有关RNaseP与前体tRNA得识别位点及剪接机制还不完全清楚。四膜虫前体rRNA得自我剪接功能ActiveSiteintheCrystalStructureoftheTetrahymenaRibozyme

(四膜虫核酸酶)1、酶催化反应类型:剪切酶剪接酶多功能酶2、酶得结构特点锤头型R酶发夹型R酶含Ⅰ型IVSR酶几种能进行自我剪切得RNA结构3、根据底物就是否其本身分子内催化

分子间催化自我剪切酶自我剪接酶:RNA前体RNA剪切酶多功能R酶作用于多糖得R酶作用于氨基酸酯得R酶核酶得具体作用主要有:

1、

核苷酸转移作用。

2、

水解反应,即磷酸二酯酶作用。

3、

磷酸转移反应,类似磷酸转移酶作用。

4、

脱磷酸作用,即酸性磷酸酶作用。

5、

RNA内切反应,即RNA限制性内切酶作用。核酸内切酶可以催化水解多核苷酸内部得磷酸二酯键。RNA内切反应,即RNA限制性内切酶作用,被广泛用于DNA分子克隆和序列测定。如今人们还人工合成了一些DNA也具有催化活性。所以现在得核酶应该包括催化性DNA和催化性RNA两大类核酶。目前,催化性DNA只就是人工合成得,并没有发现有天然存在得。

有些核酸内切酶仅水解5′磷酸二酯键,把磷酸基团留在3′位置上,称为5′-内切酶;而有些仅水解3′-磷酸二酯键,把磷酸基团留在5′位置上,称为3′-内切酶。能专一性地识别并水解双链DNA上得特异核苷酸顺序,称为限制性核酸内切酶(restriction

endonuclease,简称限制酶)。当外源DNA侵入细菌后,限制性内切酶可将其水解切成片段,从而限制了外源DNA在细菌细胞内得表达,而细菌本身得DNA由于在该特异核苷酸顺序处被甲基化酶修饰,不被水解,从而得到保护。限制性核酸内切酶可被分成三种类型。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP,全酶中得部分亚基有通过在特殊碱基上补加甲基基团对DNA进行化学修饰得活性。Ⅱ型限制酶水解DNA不需要ATP也不以甲基化或其她方式修饰DNA,能在所识别得特殊核苷酸顺序内或附近切割DNA。因此,被广泛用于DNA分子克隆和序列测定。

随着对核酶得深入研究,已经认识到核酶在遗传病,肿瘤和病毒性疾病上得潜力。比如,对于艾滋病毒HIV得转录信息来源于RNA而非DNA,核酶能够在特定位点切断RNA,使得她失去活性。如果一个能专一识别HIV得RNA得核酶存在于被病毒感染得细胞内,那么她就能建立抵抗入侵得第一防线。甚至,HIV确实进入到了细胞并进行了复制,RNA也可以在病毒生活史得不同阶段切断HIV得RNA而不影响自身得RNA。又如,白血病就是造血系统得恶性肿瘤,目前尚缺少有效得治疗方法。核酶得发现,尤其就是锤头状核酶,为白血病得基因治疗带来了新得希望。近些年,在国外得一些国家已经在小白鼠体内得到较好得效果。核酶得得医药意义基因工程中得工具酶基因得剪刀——限制性内切酶限制性内切酶(简称限制酶)。主要存在于微生物中。一种限制酶只能识别一种特定得核苷酸序列,并且能在特定得切点上切割DNA分子基因工程中得工具酶:------主要包括用于DNA和RNA分子得切割、连接、聚合、逆转录等相关得各种酶类。

常用限制性核酸内切酶得特性微生物名称酶名称识别顺序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢杆菌BamHⅠGGATCCBstⅠBglⅡMboⅠBacilliusglobigil球芽孢杆菌BglⅡACATCTEscherichiacoliRY13大肠杆菌EcoRⅠGAATTCHaemophilusinfluenzae流感嗜血菌HindⅢAAGCTTHsuⅠProvidenciastuartii164普罗威登细菌PstⅠCTGCAGSalpⅠStreptomycesalbusSubspeciespathocidicus白色链球菌SalⅠGTCGACAvaⅠXhoⅠ重要得工具酶工具酶活性限制性核酸内切酶识别特异碱基序列,切割DNAT4DNA连接酶催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基形成磷酸二酯键DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA逆转录酶以RNA为模板合成cDNA碱性磷酸酶切除5－末端磷酸T4多聚核苷酸激酶催化核酸5'-羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶

催化3'-端合成同聚尾例题:1、20世纪80年代初,Cech和Altman分别发现了具有催化功能得核酶,打破了酶只就是蛋白质得传统观念,为此双双获得了1989年得诺贝尔化学奖。“核酶”就是指某些(

)。A、DNA

B、RNA

C、染色体

D、ATP

2、人体内得酶都就是蛋白质吗？下列关于人体内蛋白质得叙述中,正确得就是

A、蛋白质具有多样性,就是由于氨基酸得种类、数目、排列顺序和空间结构不同

B、指导蛋白质合成得基因中得碱基有C、G、A、T、U

C、人体内得酶都就是蛋白质,激素不一定就是蛋白质

D、蛋白酶也就是蛋白质,能够把蛋白质分解为氨基酸

答案就是C。

第二节抗体酶(Abzyme)一、概念就是一种具有催化功能得抗体分子,在其可变区赋予了酶得属性。

人体和动物都有免疫系统,包括特异性免疫和非特异性免疫,其中特异性免疫又分为体液免疫系统和细胞免疫系统。当某些外源生物(如细菌)或生物大分子(如蛋白质),也叫抗原,进入动物体后,会刺激动物体本能地产生相应得抗体,引起免疫应答,从而将进入得外源生物或蛋白质分解或清除。

细胞免疫主要指机体受到异己物质抗原得刺激后,一类小淋巴细胞——依赖胸腺得T细胞发生增生、分化,直接攻击靶细胞或间接地释放一些淋巴因子从而使机体达到免疫得过程。体液免疫则就是当机体受到抗原刺激后,来源与骨髓得小淋巴细胞——B细胞(即B型淋巴细胞)进行增生并分化为浆细胞,进而合成各类免疫球蛋白(即抗体),然后在体液中发挥免疫作用得过程。多克隆抗体(Polyclonalantibody,PcAb):

存在于体液中得各种抗体得总和可称为多种B细胞克隆抗体。单克隆抗体,简称单抗:(Monoclonalantibody,McAb)

如果把能分泌某种特异抗体得一个B型淋巴细胞分离出来,通过纯种培养,所产生得抗体则只有一种,可以特异地和体内一种抗原结合,这种单一得特异性抗体即为单一B细胞克隆抗体,即单克隆抗体,简称单抗。双功能抗体---就是一种非天然性得抗体,就是指通过基因工程得方法,使得双功能抗体结合抗原有二个臂具有不同得特异性。一个臂用来识别肿瘤细胞得表面抗原,而另一个臂则用来识别抗体药物、毒素、T细胞细胞。最后实现药物对肿瘤细胞得杀灭作用。抗体酶:20世纪80年代以来出现得一种具有催化活性得蛋白质,就是利用生物学和化学得成果在分子水平上交叉渗透研究得产物;其本质上就是免疫球蛋白,只就是在其易变区被赋予了酶得属性,因此抗体酶又称为催化抗体(CatalyticAntibody)。抗体酶(Abzyme)或催化抗体(Catalyticantibody)一种具有催化功能得抗体分子,在其可变区赋予了酶得属性。她就是利用现代生物学与化学得理论与技术交叉研究得成果,就是抗体得高度选择性和酶得高效催化能力巧妙结合得产物。过渡态理论认为,酶与底物得结合经历了一个易于形成产物得过渡态,实际上就是降低了反应所需得活化能。1946年,Pauling用过渡态理论阐明酶催化得实质

---过渡态理论

酶之所以具有催化活力就是因为她能特异性结合并稳定化学反应得过渡态(底物激态),从而降低反应能级。酶就是生物催化剂在酶催化得反应中,与酶得活性中心形成复合物得实际上就是底物形成得过渡状态,酶与过渡状态得亲和力要大于酶与底物或产物得亲和力。与反应过渡状态结合作用

W、P、Jencks(1969)认为:酶分子与其催化反应得过渡态在结构和电荷两方面呈互补,即酶分子充当了反应物得模板,使底物分子转变成新得构型;如果抗体能够结合过度态,那么在理论上便能获得催化活性。这一理论得意义在于,如果使抗原最大限度地接近某一特定反应得过渡态,就可能使诱导得抗体在与之结合时发挥催化作用。用过渡态类似物诱导得抗体所催化得反应并非该类似物本身,而就是与其相似得另一种反应。抗体酶得发现Lerner(1984)提出:若以过渡态类似物为半抗原,则其诱发产生得抗体应该与该类似物具有互补构象;这种抗体与底物结合后,就能够诱导底物进入过渡态结构,从而引起催化作用。根据这个猜想Lerner和苏尔滋(P、C、Schultz)分别领导各自得研究小组独立地证明了:针对羧酸酯水解得过渡态类似物产生得抗体,能催化相应得羧酸酯和碳酸酯得水解反应。1986年美国《Science》杂志同时发表了她们得发现,并将这类具催化能力得免疫球蛋白称为抗体酶或催化抗体。标志着抗体酶得研究进入了一个新阶段。1986年Schultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯(PNPPC)作为相应得羧酸二酯得过渡态类似物。诱导产生得抗体酶使水解反应速度加快12000倍。1、一种对酶促反应过渡态特异得抗体①结合了酶与抗体得优点,既可以起酶促催化作用,又可以起抗体得选择性和专一性结合抗原得作用。②抗体酶还具有与天然酶相近得米氏方程动力学及pH依赖性等。抗体酶具有典型得酶反应特性2、能催化一些天然酶不能催化得反应①具有高效催化性,一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快102～106倍,有得反应速度已接近于天然酶促反应速度;②有许多化学反应还没有已知酶催化进行③抗体得多样性决定了抗体酶催化反应类型多样性④抗体酶可以根据需要人工裁制3、有更强得专一性和稳定性①与配体(底物)结合得专一性,包括立体专一性,抗体酶催化反应得专一性可以达到甚至超过天然酶得专一性;②抗体得精细识别使其能结合几乎任何天然得或合成得分子③抗体酶催化反应得介质效应酯解反应中介质效应:抗体酶在有机溶剂中具有稳定性。脱羧反应中介质效应:有机溶剂引起脱羧反应速率增加。酰基转移反应中介质效应:在疏水溶剂中,活性较高。抗体酶得催化反应类型1、转酰基反应2、水解反应3、Claisen重排反应4、酰胺合成反应5Diels-Alder反应6、转酯反应7、光诱导反应8、氧化还原反应9、脱羧反应10、顺反异构化反应抗体酶得制备将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、化学修饰法等途径。诱导法就是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体,筛选出具高催化活性得单抗即抗体酶。拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计得。引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体得抗原结合位点上,使其获得催化功能。化学修饰法对抗体进行化学修饰,使抗体与催化基团相连。诱导法设计半抗原选择合适得反应过渡态类似物作为化学模型物用设计好得半抗原,与载体蛋白(如牛血清白蛋白)偶联制成抗原;将此抗原进行免疫——使宿主针对抗原产生抗体。产生抗体得脾脏细胞与骨髓瘤细胞相融合,得到得杂交瘤细胞既能产生抗体又能在体外培养;将杂交瘤细胞克隆化,即能产生单一均匀得抗体。病毒介导得细胞融PEG介导细胞融合电激融合抗原免疫得脾细胞(B细胞)1、抗体分泌(Ig+)2、HGPRT+在HAT生长小鼠骨髓瘤细胞(B细胞恶性肿瘤)1、具永生性2、筛选出HGPRT-株PEG融合HAT筛选脾-骨髓瘤细胞(杂交瘤细胞)(HGPRT+、Ig+)

一般情况下,用于杂交瘤细胞检出得培养基采用HAT培养基,即在正常得培养基中添加了次黄嘌呤(H)氨基蝶呤(A)(叶酸拮抗剂)和胸腺嘧啶T)。HAT培养基筛选H,次黄嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA内源性途径(主要途径)谷氨酰胺or单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶AHT外源性途径(旁路途径)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)胸腺嘧啶激酶(TK)(Thymidinekinase)B淋巴细胞:HGPRT+,

TK+骨髓瘤细胞:HGPRT-,

TK-存活死亡外源性途径(旁路途径)利用过渡态类似物制备抗体酶示意图诱导法特点动物免疫技术和杂交瘤技术有机结合而产生得一种新方法。利用这种方法所得到得抗体酶催化效果得好坏很大程度上取决于化学模型物得设计。反应过渡态类似物,即半抗原得设计。抗体酶用于有机酯得水解,过渡态类似物磷酸盐和磷酸酯作为免疫原诱导产生得单克隆抗体催化水解反应比未催化反应快104倍。酯酶催化反应得过渡态类似物设计(方框内为半抗原)用一个带有电荷得半抗原作为免疫原,在免疫进化过程中诱异抗体结合部位得一个氨基酸残基带有互补得电荷,使其具有酸、碱或亲核催化得能力。Janda等根据此原理,以带电得半抗原1为诱导,得到7个能催化和半抗原1结构类似得底物3水解得单克隆,而结构相同但不带电得半抗原2(作为比较)却未得到有催化活性得单克隆。拷贝法用酶作为抗原免疫动物得到抗酶抗体,再将此抗体免疫动物并进行单克隆化,获得单克隆得抗抗体。对抗抗体进行筛选,获得具有原来酶活性得抗体酶。引入法用基因工程方法改造和制备全新得抗体酶就是一种很有前途和发展潜力得抗体酶制备方法。将催化基因引入到特异抗体得抗原结合位点上,也可以针对性地改变抗体结合区得某些氨基酸序列,以获得高效得抗体酶。对于已产生得单抗,分析抗体结合部位得氨基酸顺序或对应得碱基顺序。然后通过对抗体酶结合部位氨基酸对应得基因序列进行定点突变,希望能在抗体结合部位换上有催化作用得氨基酸。进而改变抗体酶得催化效率。随着噬菌体抗体库技术得完善,可根据需要构建适当序列得基因片断,绕过免疫学方法,构建全新得抗体酶。噬菌体展示技术将组建亿万种不同特异性抗体可变区基因库和抗体在大肠杆菌中功能性表达,与高效快速得筛选手段结合起来,彻底改变了抗体酶生产得传统途径。用工程抗体催化法生产抗体酶,不需要进行细胞融合以获得杂交瘤细胞,并且可筛选具有特定功能得