表面展示技术

枯草芽胞杆菌(Bacillussublilis)是一种典型的好氧型的革兰氏阳性细菌，也是讨论

的最早且最深化的一种芽胞杆菌。其中枯草芽胞杆菌168是最早发觉的可作为转化的芽胞

杆菌菌株，随后对其遗传转化和表达系统做了深化的讨论。1997年，日本和欧洲的几个试

验室联合完成了枯草芽胞杆菌168基因组的测序［11枯草芽胞杆菌有两个生长时期：抱

子休眠期和生殖生长期。在养分缺乏等胁迫的环境下，枯草芽胞杆菌进入休眠期形成具有

抗逆作用的芽胞，在养分充分的环境下，芽胞又会进入生殖时期，即芽胞萌发重新生长成

为枯草芽胞杆菌。芽胞抗逆性特别强，在高温柔酸碱等极端环境下亦能生存，由于其独特

的生理特性，使之成为新型的蛋白质或酶类药物表达载体而倍受关注。由于枯草芽胞杆菌

是一种非致病性的益生菌，因此其可以作为一种生物平安的展现外源蛋白的宿主。目前采

用该菌株已胜利表达了破伤风毒素［2~41不耐热肠毒素［41乙醛酸脱氢

芽泡杆菌属和梭菌属在受到外界应力时如养分缺乏状况下自身母细胞会形成一种休眠

体即芽抱,它可以抵挡外界环境因素的攻击。年前发觉炭疽芽抱杆菌的芽袍即使将具置于沸

水中蒸煮一断时间后，它仍能存活下来，这一好玩的现象吸引了科学家们开头探究芽泡的耐

热和抵挡其他外界环境因素攻击的作用机制。()枯草芽泡杆菌芽泡芽泡杆菌属()在饥饿或环

境恶劣等逆环境下,为了抵挡外界不良应力这时它的养分细胞会形成一种近椭圆形的休眠

体结构即芽泡。芽泡的结构由内到外依次是核心、皮层、芽泡衣壳和芽泡外壁。芽泡的核

心一般含有大量的染色体、酶和，但含水量却很低,主要是由于它内部的大部分水分子都被叱

咤二竣酸复合体取代掉了。芽泡的外壁由肽聚糖构成，与养分细胞的肽聚糖组分很羽以，仅在

于含量上有差别。芽抱的衣壳由至少种以上的蛋白构成这些蛋白也被称为芽泡衣壳蛋白,

它们具有抗酶解和抗药物的功能,主要受一系列调控基因和结构基因掌握。芽泡的外壁从结

构上又可细分为基底层、内层、外层和层四个部分(图)。

芽泡诱导产生的整个过程也许需要将近八个小时。芽抱的形成受一系列调整酶如激酶

和磷酸酶、细胞周期及其他机制调控

芽泡形成的步骤可简洁地描述成如下几个过程:笫一步，包括、和在内的组氨酸感受激酶

开头活化，这时组氨酸感受激酶以扩展磷转移的方式运载磷,并促使转录因子发生磷酸化。实

际上，诱发芽泡产生的调控过程很简洁，由于只需要调控上游的表达就可以实现，并且都不需

要考虑它的养分是否缺乏。磷酸化调控的调整子基因许多，包括参加不均等分裂的相关蛋白

和参加芽泡形成的。因子蛋白。不均等分裂会使养分细泡分化成个间隔区，大的是母细胞，而

小的则是前泡子。前泡子最终演化为成熟的芽泡。随后,母细胞以一种类似吞噬作用的方式

渐渐包裹前抱子。待吞噬完成后，被母细胞吞并的前抱子则被掩盖上了一个双分子层膜。与

此同时，还产生了两个外部的爰护结构:一个是前泡子内膜与外膜间肽聚糖组装成的核质;另

一个是由衣壳蛋白质构成的芽抱最外爱护层。实际上，肽聚糖的前体起初是在母细胞中合成

的，然后它翻转穿过前泡子外膜进入外膜与内膜间的空间，但是这种翻转机制目前仍不太清

晰。最终,母细胞裂开释放成熟的芽泡进入环境中。此时的芽胞能够快速发芽并可通过汲取

养分恢复它的增殖力量。

新近进展起来的芽泡表面展现技术，由于其具有独特的稳定性和平安性高的特点而引

起广高校者的关注。一般来说,芽泡表面这些系统主要日宿主菌、分子载体和靶蛋白组成。

目前，芽泡表面展现系统中所用的宿主菌有枯草芽抱杆菌、炭疽芽泡杆菌、苏云金芽泡

杆菌、球形芽抱杆菌和巨大芽泡杆菌。分子载体一般应具有如下特质:①它必需含有一个结

构域可以与靶蛋白进行融合;②必需含有一个锚定结构域可使融合蛋白固定在芽抱的表面;

③分子载体和靶蛋白可以形成融合蛋白,相互功能不受影响;④还必需具有抗酶解的力量;⑤

分子载体的敲除不影响芽抱的正常发芽、成熟和分化。芽泡表面展现系统中的外源蛋白也

叫靶蛋白。针对靶蛋白而言，一般并无特殊要求，选择的对象应从试验需要动身。

相对于芽泡表面展现系统来说,噬菌体或细菌表面展现系统都存在着一个明显的缺陷,

那就是这些系统中形成的融合蛋白都必需至少要穿过细胞质膜才能锚定在宿主的表面，这

简洁导致有些融合蛋白由于无法穿过细胞质膜进而就不能有效定位在噬菌体或细菌的表

面。例如那些细胞周质中快速折叠的蛋白或疏水部位深埋在细胞膜的蛋白往往都不能有效

地穿过细胞质膜。芽胞表面展现技术进展较晚，但其却具有如下诸多优点:①芽抱结构比较特

殊没有细胞膜结构,所以当它与外源蛋白融合后形成的融合蛋白在固定到芽泡表面的过程

中避开了折叠不正确和定位不精确的问题;②其次，由于芽胞具有抗可逆环境等特性,

因而它还会提高融合蛋白的稳定性如热稳定性、耐有机溶剂等，尤其在制备生物催化剂方面;

③最终，被展现的外源蛋白或多肽范围分布较广，它还可展现多聚体类的蛋白。

胞表面展现技术应用领域和其他微生物细胞表面展现系统相比，芽泡表面展现系统已

被广泛应用于诸多领域,概况地说主要是生物分析和生物医学领域。详细地是,芽泡表面展现

系统可用于活性疫苗和抗体的产生、多肽或蛋白库高通量筛选、生物催化剂、生物传感器、

生物检测器、重金属离子和化学物质的生物吸附等

生物检测器

金属离子的生物吸附

生物催化剂

多肽或东白库高通量

疫苗和抗体的生产

生物传感各

图1-9芽抱表面展示技术的应用领域

由于枯草芽泡杆菌的遗传学背景和芽泡的结构信息都比较清晰，所以用它产的芽泡来

构建芽抱表面展现系统也就更简洁实现。年，意大利那不勒斯菲里德里克其次高校讨论小组

首次报道了来自枯草芽抱杆菌外层衣壳蛋白可以用作分子载体将破伤风梭菌破伤风毒素单

位展现在芽抱的表面，并且每个芽泡上约展现有x个融合蛋白分子。新型芽抱表面展现系统

不仅稳定性和展现效率高，而且易于纯化,这些优势促使芽抱表面展现系统为锚定其他的生

核心Core

为磨施体内岐

Innermembraneofsporeprecursor

染色体DNAChromosomeDNA

皮层Cortex

芽眼前体外膜

Outermembraneof

sporeprecursor

Innercoatprotein

外C外食蛋门Oulcrcoatprotein

夕卜光Exosporium

图1枯草芽胞杆菌芽胞结构的模式图

Fig.1ThestructuremodelofthesporeofBacillussubtilis.

表面展现技术的概况

表面展现技术()是指通过基因工程技术将外源蛋白或多肽定位到噬菌体、细胞或芽抱

表面的一种技术。拘束年首次发觉噬菌体能够作为一种展现外源蛋白或多肽的载体后，其他

噬菌体展现技术、酵母表面展现技术和细菌表面展现技术便应运而生。表面展现技术之所

以受到人们的欢迎,主要是由于其可被广泛应用于活性疫苗的研制、肽库的筛选、抗体的生

产、作为去除有害物质和重金属离子的吸附剂、全细胞催化剂和生物传感器等领域。

噬菌体表面展现技术

噬菌体(Bacteriophases,又称Phages)是指一类寄生在原核生物体内的病毒。噬菌体

展现技术(Phasedisplaytechnology)是指将外源蛋白或多肽通过与噬菌体衣壳蛋白融合

后其被展现在噬菌体颗粒的表面,形成的融合蛋白中的外源蛋白或多肽仍保留了巨身的生

物活性的一种分子生物学技术

噬菌体展现技术缺点：详细如下:①外源蛋白或多肽与衣壳蛋白融合后，在表达过程存在

无法猜测的偏性;②被展现的外源蛋白或多肽分子量不能太大,否则会影响噬菌体的组装并

降低它感染宿主的力量;③在构建肽文库时，存在限制容量的弊端。

细菌表面展现技术

细菌表面展现系统主要分为革兰氏阴性菌表面展现系统和革兰氏阳性菌表面展现系

统。

芽胞表面展现技术是将外源目的蛋白编码基因与含有自身启动子的芽胞外套蛋白基因

融合，构建融合基因表达载体，然后将这种载体转化产芽胞的宿主菌株，得到的重组菌株

在生泡培育基中培育时，外源目的基因就会在外套蛋白基因启动子的启动下表达，并通过

与外套蛋白偶联的作用将外源蛋白展现在芽胞的表面。由于芽胞独特的抗逆性，使得展现

在芽胞表面的外源蛋白也具有相应的抗逆性。

革兰氏阳性菌表面展现系统

这些细胞壁蛋白都具有相同的保守特质即端含有一个引导细胞壁蛋白穿过细胞膜的信

号肽和端含有一个将细胞壁蛋白固定在细胞壁上的分选信号肽。因此,革兰氏阳性菌表面展

现系统又可以分为c端融合和N端融合。

革兰氏阴性展现系统由于每种分子载体都具有不同的特性，所以这些特性就打算了它

们只能用在一些特殊的用途中。是革兰氏阴性菌表面展现系统应用最多的宿主菌，由于其表

达系统成熟，操作相对简洁由于革兰氏阳性菌的细胞壁外仅有一层质膜，所以其细胞壁上的

分子载体与外源蛋白或多跌形成的融合蛋白可以很简洁地穿过质膜,这就大大提高了融合

蛋白定位的精确率。其次，可展现一些大分子外源蛋白;第三，革兰氏阳性菌具有较厚的

肽聚糖层，有利于对环境中重金属离子的吸附。同样地，革兰氏阳性菌细胞壁厚的特点有时又

会导致转化效率低的问题，因此这在构建丰富度高的多肽库时很难操作;此外,革兰氏阳性菌

中的诸如枯草芽泡杆菌会分泌产生大量的蛋白酶，这些蛋白酶的消失有时会对外源蛋白的

稳定性造成破坏影响。

革兰氏阳性展现系统的缺点

由于革兰氏阳性菌在进行遗传操作时难度比较大，所以目前仅有少数几种革兰氏阳性

菌被用作表面展现的宿主菌。

母表面展现技术是一种采用真核微生物作为宿主的表面展现系统。其基本原理也是通

过将外源蛋白的编码序列与酵母细胞壁上的分子载体融合，分子载体上的信号肽引导融合

蛋白定位在酵母细胞的表面。

3,-RegKXio(Flolp

GPl锚定蛋白附着佑号区

Flolp痢码冢凝功能域基囚Flolp絮凝功能城

Cellwall

(d)

图1-6薛母衣面展示系统。（a）a-凝集素类型；（b）a-凝集素类型；（c）Flolp的C端融合类型；（d）