湖南省衡阳市某猪场主要病毒抗体检测与分析

湖南省衡阳市某猪场主要病毒抗体检测与分析DetectionAndAnalysisOfMajorVirusAntibodiesInAPigFarmInHengyangCity，HunanProvince目录摘要……………1关键词…………11前言………………22材料与方法………………………32.1试验材料……………………32.1.1试验样本……………………32.1.2试验试剂盒…………………32.1.3试验器材…………………32.2试验方法……………………32.2.1血液样本的采集…………………32.2.2猪瘟病毒抗体检测方法……………32.2.3数据整理及统计………………………33结果与分析……………43.1猪蓝耳病毒免疫抗体情况……………53.2猪瘟病毒免疫抗体情况……………53.3猪口蹄疫病毒免疫抗体情况…………53.4猪伪狂犬gB病毒免疫抗体情况………53.5猪伪狂犬gE病毒免疫抗体情况………54讨论………………65结论…………………7参考文献………………………7致谢………………8湖南省衡阳市某猪场主要病毒抗体检测与分析摘要：在生猪的养殖中,预防传染病主要通过接种疫苗来实现,猪瘟、猪蓝耳病，猪伪狂犬病和口蹄疫是国家强制免疫的传染病，为了检测湖南省衡阳市猪场上述4种传染病，用ELISA对该猪场的123份血清进行猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病毒抗体、猪伪狂犬病毒gB及gE抗体、猪口蹄疫病毒O型抗体检测。结果显示,猪场猪瘟抗体整体阳性率为87.80%,一免前阳性率为46.67%；猪蓝耳抗体检测显示全部为阴性；猪口蹄疫抗体检测显示整体阳性率为91.06%，但是育肥二区阳性率为40%；猪伪狂犬gB抗体整体阳性率为96.75%，其中保育为73.33%；猪伪狂犬gE整体阳性率为69.92%。提示本次调查中猪伪狂犬gB与猪口蹄疫抗体的整体阳性率较高,但对保育及育肥区的生猪保持关注，一免前的仔猪要根据母猪普免猪瘟疫苗的时间进行综合分析。猪伪狂犬gE抗体阳性率较低，建议预防野毒干扰影响生产。

关键词：猪瘟病毒；猪蓝耳病毒；猪伪狂犬病毒；猪口蹄疫病毒；ELISADetectionAndAnalysisOfMajorVirusAntibodiesInAPigFarmInHengyangCity，HunanProvinceAbstractInthepigbreeding,preventinginfectiousdiseasesthroughvaccination.CSF,PRRS,FMD,PRareinfectiousdiseasesthatiscompulsory.Butthefarmersstilllackawarenessofvaccineimmunization.Now,todetectimmunityofapigfarminHengyangCity,HunanProvince,123serafrompigfarmweretestedbyELISA.ThefarmisnotinjectedPRRSvaccine,butinjectedPRvaccine.Nowthepigfarmhas1200sows.Thetestresultdisplaysthatoverallpositiverateofswinefeverantibodyis87.80%,thepositiverateofswinefeverantibodybeforethefirstimmunizationis46.67%;AndthePRRSVantibodytestwasnegative.OverallpositiverateofFMDVantibodyis91.06%,butthepositiverateoffatteningareatwois40%.TheoverallantibodypositiverateofPRV-gBantibodyis96.75%,andthepositiverateofconservationareathreeis73.33%.Last,TheoverallantibodypositiverateofPRV-gEantibodyis69.92%.Itmeansthatwemustpayattentiontopigsinfatteningareatwoandconservationareathree,andthePRV-gEantibodyislow,itisrecommendedtopreventwildpoisonsfominterferingwithproduction.Keywords:CSFV；PRRSV；FMDV；PRV；ELISA1前言我国的养猪业，经过近些年来的发展，已经逐步走向了规模化。我国的猪场饲养品种多样，主要有大白、长白、杜洛克、各类二元杂和各类地方品种。其中以大白的饲养猪场数量最多，约占90%。调查显示现代化猪舍在不断升级，现在的猪舍都能按照生猪的生长阶段划分好生活区域，但在防疫上仍然存在着部分问题。有小部分猪场没有建设好进场更衣室、消毒池或者通风过滤设备，不少猪场至今都没有建立起防鼠、防蚊虫的设备。因此，猪场要加强防疫设备的建设，强化防疫程序的实行与监督。当前环境下市场上针对猪生产的疫苗很多，常见有猪瘟疫苗、经典猪蓝耳活疫苗、猪口蹄疫疫苗、猪伪狂犬疫苗等。如果对猪场疫病的防控，依然按照以前那种发病后再进行用药治疗的途径，不但会付出较多的治疗成本，并且治疗效果也很差，因此必须以预防为主，猪场疫病的预防手段，包括消毒（及时杀灭环境中的病原体）、预防性给药和疫苗免疫。而抗体检测主要是指导和检查免疫效果，评判猪场健康状态。[1][2]目前我国主要通过应用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法对采取的血清样品的抗体水平进行了检测。ELISA，即酶联免疫吸附试验，是一种在实验中常用的分子生物检测技术。它的原理是运用抗原和抗体专一性结合的特性及呈色剂反应，根据最终呈色的深浅对定量样品中的目标蛋白进行定量分析。ELISA具有敏感性强，操作简单，并且能够同时检测多种抗体的优势。[3]猪瘟(ClassicalSwineFever,CSF)是对养猪业影响较大的病毒性疾病之一,是由猪瘟病毒引起猪的一种高度接触性、致死性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的传染病。该病在世界上大部分生猪存栏数较多的地区如亚洲、欧洲、南美洲和非洲部分地区仍然存在。虽然猪瘟疫情基本在控制之内,但非典型猪瘟的发病情况逐渐增多,这也是猪瘟反复发生及流行的主要原因。[4][5]猪蓝耳病病毒是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种以感染猪发热、厌食,妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎,各种年龄猪(特别是仔猪)呼吸障碍为特征的高度传染性疾病。该病于1987年最早发现于美国。目前,该病已遍及北美洲及欧洲,在全球范围内传播。[6][7]口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的以患病动物的口、蹄部出现水疱性病症为特征的传染性疫病。口蹄疫的特点是起病急、传播极为迅速。其发病率可达100%，仔猪常不见症状而猝死，严重时死亡率可达100%。既是世界各国防控的重点,也是我国动物疫病防控中长期规划中重点防治和净化的动物疫病之一。[8][9]猪伪狂犬病(PR)是由疱疹病毒科疱疹病毒属的猪伪狂犬病毒(PRV)引起的一种高度接触性、急性传染病,可引起种猪的繁殖障碍、仔猪呼吸道综合征,病死率最高能够达到100%。猪在经过PRV急性感染后能形成潜伏性感染,终生带毒,在应激条件下潜伏状态的病毒能被激活,并引起复发性感染和向外散毒。目前,猪伪狂犬病主要采用PRV-gE缺失疫苗进行免疫,与之配套的检测方法有PRV-gB抗体检测试剂盒进行抗体检测及PRV-gE抗体检测试剂盒进行野毒感染抗体检测,可以通过检测上述2种抗体。[10][11]2材料与方法2.1试验材料2.1.1试验样本实验动物抽检于湖南省衡阳市某猪场的群体生猪，采集猪血液共收集123份，（其中妊娠母猪血样27份，哺乳母猪血样17份，保育仔猪血样15份，种公猪血样10份，育肥猪血样54份）常规方法分离血清。采取血样时妥善进行饲养管理，尽量避免或减少应激和疾病的发生，时刻观察并记录实验动物群体的健康状况。2.1.2试验试剂盒猪瘟抗体检测试剂盒、猪伪狂犬gB、gE抗体检测试剂盒、猪蓝耳病抗体检测试剂盒均为IDEXX公司产品，猪口蹄疫抗体检测试剂盒为金诺公司产品，于-4℃保存。2.1.3试验器材美国BIOTEK酶标仪，恒温箱，高速离心机（上海飞鸽TGL-16C），离心管、一次性真空静脉采血针、微量移液器（50L、200L）及配套枪头。2.2试验方法2.2.1血液样本的采集使用前腔静脉采血的办法，每只试验生猪均采集血样5mL，编号并放在无菌离心管内,倾斜静置30分钟等待血清析出，在驻场兽医的实验室内2000rpm离心15分钟，取上清液于4℃保存备用。血液样本的采集应该按比例从养殖场各区抽取。2.2.2病毒抗体检测方法严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，具体操作步骤如下：（1）将待检血清与试剂盒中的试剂恢复至18到26摄氏度，底物液不要暴露于强光。（2）移液过程中每个样品均使用单独的吸头,防止样品污染。（3）洗涤液充分震荡使沉淀溶解后，用蒸馏水或去离子水作10倍稀释。（4）分别取50L的样品稀释液加入检测孔和对照孔中。（5）分别取50L样品血清，阳性对照和阴性对照加入到相应的检测板孔中。轻轻震动摇匀，切勿溢出，放置于37℃的湿箱中温育2h。（6）甩去检测板中液体，使用配置好的洗涤液反复洗涤3-5次，洗板时注意防止样本之间交叉污染。（7）每个反应孔中加入酶标二抗100L，随取随用，放置于37℃的湿箱中温育30min。（8）洗板3-5次，操作同(6)（9）取底物液100L加入反应孔中，在室温条件下避光显色10min。（10）在各反应孔中加入终止液100L终止反应，震荡摇匀，并于酶标仪450nm处测量各孔吸光度值，空气调零。2.2.3数据整理及统计使用EXCEL相关的软件将试验得出的数据整理与统计，最后计算出结果。3结果与分析编号检测项目份数猪瘟阳性率蓝耳阳性率口蹄疫阳性率伪狂犬gB阳性率伪狂犬gE阳性率整体12387.80%091.06%96.75%69.92%A1-A15育肥A区（140d）1586.67%086.67%100%80.07%B1-B15育肥B区（50d）1580%040%100%93.33%C1-C16育肥E区（90-110d）1693.75%0100%100%56.25%D1-D8育肥H区（后备）8100%0100%100%12.5%E1-E12妊娠中期1291.67%0100%100%66.67%F1-F15妊娠后期15100%0100%100%33.33%G1-G15保育C区1546.67%0100%73.33%86.67%H1-H17哺乳母猪17100%0100%100%82.35%I1-I10种公猪10100%0100%100%100%阳性对照平均值（第1块板）0.1130.37050.07150.2140.1705阴性对照平均值（第1块板）1.90050.0472.05951.23151.3025阳性对照平均值（第2块板）0.11750.3450.15850.19350.1495阴性对照平均值（第2块板）1.960.04451.88251.35951.134结果判定标准及试验成立条件猪瘟病毒抗体阳性：阻断率≥40为阳性，阻断率≤30为阴性，其他的为可疑。当N值大于0.5,同时标准阳性样品阻断率≥50时试验成立。本次试验所得N值为1.93，大于0.5，同时阳性样品阻断率为67.84，大于50。结论：试验成立。（2）蓝耳病病毒抗体阳性：S/P值＜0.40为阴性；S/P值≧0.40为阳性。当P值-N值≥0.15并且N值≤0.15时试验成立。本次试验S/P值为0.044。N值为0.045，P值-N值为0.31。结论：试验成立。（3）口蹄疫病毒O型抗体阳性：S/N值≦0.60为阳性；S/N＞0.60为阴性。当N值＞0.7，P值＜0.25时试验成立。本次试验N值为1.97，P值为0.115。结论：试验成立。猪伪狂犬病毒gB抗体阳性：S/N值≦0.60为阳性；S/N＞0.70为阴性；其他的为可疑。当NC值-PC值≥0.3时试验成立。本次试验NC值-PC值为1.09。结论：试验成立。猪伪狂犬病毒gE抗体阳性：S/N值≦0.60为阳性；S/N＞0.70为阴性；其他的为可疑。当NC值-PC值≥0.3时试验成立。本次试验NC值-PC值为1.06。结论：试验成立。3.1猪蓝耳病毒免疫抗体情况猪蓝耳抗体全部表现为阴性，说明该猪场的猪群未曾接触过蓝耳病毒。3.2猪瘟病毒免疫抗体情况猪瘟抗体：从检测结果来看，在123份血清中有猪瘟病毒抗体阳性108份，平均抗体阳性率为87.80%(108/123)，阳性率整体较高，不过猪瘟病毒抗体一免前阳性率46.67%，需要根据母猪最佳普免猪瘟疫苗的时间进行综合分析。3.3猪口蹄疫病毒免疫抗体情况猪口蹄疫病毒抗体：从检测结果来看，在123份血清中有猪口蹄疫病毒抗体阳性112份，平均抗体阳性率为91.06%(112/123)，阳性率整体较高，但是育肥2区（50d）抗体阳性率仅有40%，需要进一步查明原因。3.4猪伪狂犬gB病毒免疫抗体情况猪伪狂犬gB病毒抗体：从检测结果来看，在123份血清中有猪伪狂犬gB病毒抗体阳性119份，平均抗体阳性率为96.75%(119/123)，阳性率整体较高，不过其中的保育3区阳性率73.33%，需要密切关注。3.5猪伪狂犬gE病毒免疫抗体情况猪伪狂犬gE病毒抗体：从检测结果来看，在123份血清中有猪伪狂犬gE病毒抗体阳性86份，平均抗体阳性率为69.92%(86/123)。4讨论4.1猪瘟猪瘟的免疫是所有猪场最为重视的免疫之一，本次报告使用IDEXX试剂盒检测本猪场的猪瘟病毒抗体。猪瘟抗体检测试剂盒的原理是以核衣壳蛋白作为主要的包被抗原来检测血液中对N蛋白的抗体。检测结果显示该猪场平均抗体阳性率为87.80%(108/123)，阳性率整体较高，达成了国家制定的最低免疫合格率70%以上的要旨。不过其中猪瘟病毒抗体一免前猪瘟病毒抗体阳性率仅有46.67%，需要根据母猪最佳普免猪瘟疫苗的时间进行综合分析。[12][13]4.2猪蓝耳猪蓝耳病是我国的二类传染病，呈地区流行性，是一种具备有高度接触性的传染病。本次的检测结果显示该猪场的猪蓝耳抗体全部表现为阴性，说明该猪场的猪群未曾接触过蓝耳病毒。说明该猪场对猪蓝耳免疫防护做的很成功，是一个典型的蓝耳病阴性场。[14]4.3猪O型口蹄疫猪口蹄疫是一种由猪O型口蹄疫病毒引起的急性人畜共患病，在全世界范围都有分布。从本次的检测结果来看，在123份血清中有猪O型口蹄疫病毒抗体阳性112份，平均抗体阳性率为91.06%(112/123)，阳性率整体较高，符合国家标准。但其中的育肥B区（50d）抗体阳性率仅有40%，需要进一步查明原因。[15][16]4.4猪伪狂犬gB猪伪狂犬病也是各猪场传染病免疫防控重要的一部分。就本次检测结果，该猪场的阳性率整体较高，达到了96.75%，符合国家的免疫合格标准。但其中保育C区的阳性率相对于整体仅有73.33%，需要密切关注。[17]4.5猪伪狂犬gE本次检测在123份血清中有猪伪狂犬gE病毒抗体阳性86份，平均抗体阳性率为69.92%。从最近几次检测结果分析，伪狂犬病毒gE抗体阳性被检出的最早时间是2018年10月份。推测感染时间应该在2018年5-9月。现在最佳措施建议为预防伪狂犬野毒干扰影响正常生产。[18]4.6总结猪瘟、猪蓝耳病、猪口蹄疫、猪伪狂犬病都是危害国内养猪业最主要的几类传染病，给生猪的养殖带来了严重的损失，是影响国内养猪业持续发展的重要成分。本次调查结果显示，衡阳市该猪场猪群中的猪蓝耳抗体全部表现为阴性，说明该猪场对猪蓝耳免疫防护做的很成功。另外猪瘟病毒抗体、猪口蹄疫O型病毒抗体、猪伪狂犬gB病毒抗体的整体免疫抗体水平大致达到了国家的免疫合格标准，说明能较好保证猪群健康，不过其中猪瘟病毒抗体一免前猪瘟病毒抗体阳性率仅有46.67%，育肥B区（50d）的猪口蹄疫病毒抗体阳性率仅有40%，保育C区的猪伪狂犬gB病毒抗体阳性率相对于整体仅有73.33%，说明还需要密切关注。另外该猪场猪伪狂犬gE病毒抗体阳性率仅有69.92%，建议该猪场要预防伪狂犬野毒干扰影响正常生产。就总体检测结果而言，该猪场对传染病的防控措施做得很到位，对疫苗免疫也很重视，能够明白疫苗免疫对猪场疫病健康起到的重要作用，当下这几种疫病仍旧是影响养殖业稳定发展的主要疾病，如果有一类疫情爆发，不但会给养殖场带来严重的经济损失，还会对当地的市场经济造成相应的影响。所以要做好疫苗的免疫接种，准时监测猪场内猪群的抗体水平，且通过检测得到的结果合理拟定一个有效的免疫程序，因地制宜，专场专制。[19][20]6结论这五种抗体水平基本合格。参考文献[1]韩焘,原霖,王鸽,马英,翟新验.我国原种猪场防疫技术水平现状与思考[J].黑龙江畜牧兽医,2015(22):120-122.[2]JohannadeGroot,MarkoA.WRuis,JanWScholten,JaapMKoolhaas,WimJ.ABoersma.Long-termeffectsofsocialstressonantiviralimmunityinpigs[J].Physiology&Behavior,2001,73(1).[3]周赛赛,罗润波,陈建春,格桑卓玛,索朗斯珠.基于ELISA技术检测流感病毒的研究进展[J].中国家禽,2019,41(17):45-49.[4]程龙,王皓婷,孙冰玉,刘艳莉,张晶晶,马腾壑.邯郸地区规模化猪场猪瘟抗体检测报告[J].黑龙江畜牧兽医,2017(02):135-137.[5]谷思颖,杨慧敏,屈勇刚,魏其,吴圆圆,任敏.2018年新疆部分地区规模化猪场猪瘟病毒抗体检测与分析[J].[6]刘保红.部分猪场猪瘟和蓝耳病抗体检测与分析[J].中国畜禽种业,2019,15(01):16-17.[7]MichaelP.Murtaugh,MarikaGenzow.Immunologicalsolutionsfortreatmentandpreventionofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)[J].Vaccine,2011,29(46).[8]王朝霞.吉林省东部边疆地区猪O型口蹄疫抗体水平监测及免疫效果评估[D].延边大学,2019.[9]HwangJiHyeon,LeeKwangNyeong,KimSuMi,LeeGyeongmin,MoonYoonjung,KimByounghan,LeeJongSoo,ParkJongHyeon.Needlelessintradermalvaccinationforfoot-and-mouthdiseaseinducedgranuloma-freeeffectiveprotectioninpigs.[J].Journalofveterinaryscience,2019,20(3).[10]何淑芝,郑经成,谭伟军.广东省规模化猪场伪狂犬病抗体检测分析[J].湖北畜牧兽医,2019,40(07):8+12.[11]杨依波,高洪,严玉霖,赵汝,景麟稀,单春兰,刘超英.云南省某规模化猪场不同日龄猪伪狂犬病病毒抗体的检测[J].黑龙江畜牧兽医,2019(06):90-92.[12]祖海涛,田青芳,赵晓南,金文杰,王爱国,朱连德.规模化猪场抗体检测结果及分析[J].中国猪业,2015,10(11):46-50.[13]孙颖,范志新,田昊伦,王凯,侯玉凤,周宏超,郭抗抗.2018年陕西省部分地区小型猪场猪瘟、伪狂犬病、口蹄疫免疫抗体检测分析[J].动物医学进展,2020,41(02):138-141.[14]何海健,蒋春燕,