植物组织培养实验详细操作手册

植物组织培养实验详细操作手册一、实验目的植物组织培养技术依托植物细胞全能性，通过无菌条件下的离体培养，实现外植体（植物离体组织、器官或细胞）的脱分化（形成愈伤组织）与再分化（发育为完整植株），最终获得遗传稳定的再生植株或次生代谢产物。本实验旨在掌握组织培养核心流程，可应用于优良品种快速繁殖（如珍稀花卉、经济林木）、植物脱毒（如马铃薯、草莓脱除病毒）、基因工程受体系统构建及种质资源保存等领域。二、实验原理植物细胞具有全能性（已分化细胞仍保留发育为完整植株的遗传潜力）。在适宜的营养（无机盐、碳源）、激素（细胞分裂素、生长素）及环境条件下，外植体可经历：脱分化：外植体细胞恢复分裂能力，形成无定形、具分裂能力的愈伤组织；再分化：愈伤组织通过器官发生（分化为芽、根）或胚胎发生（形成胚状体），最终发育为完整植株。培养基的激素配比是调控器官发生方向的关键：高细胞分裂素/生长素比值促进芽分化，低比值促进根形成。三、材料与试剂（一）植物材料根据实验目标选择外植体（需健康、无病虫害）：快速繁殖：幼嫩茎段、叶片（如菊花、月季茎尖）、胚珠（如兰花）；脱毒培养：茎尖分生组织（约0.1–0.5mm，病毒含量极低）；愈伤组织诱导：叶片、叶柄、花药（如烟草、拟南芥）。采集后用蒸馏水冲洗表面杂质，备用。（二）试剂与培养基成分1.基础培养基：常用MS培养基（含大量元素、微量元素、有机成分），也可选用B5、White培养基（依植物种类调整）。2.植物激素：细胞分裂素（6-BA、KT）、生长素（NAA、IAA、2,4-D），需用0.1mol/LNaOH或HCl溶解后过滤灭菌（0.22μm滤膜）。3.碳源与凝固剂：蔗糖（20–30g/L，提供能量）、琼脂（6–8g/L，固体培养基用）。4.消毒剂：75%乙醇（表面消毒）、0.1%升汞（HgCl₂，强消毒剂）或2%次氯酸钠（NaClO，对汞敏感材料适用）。5.其他试剂：无菌水、抗氧化剂（如维生素C，防止外植体褐化）。四、仪器设备无菌操作设备：超净工作台（带紫外灯、通风系统）、高压蒸汽灭菌锅（121℃，15–20min灭菌）、干燥灭菌箱（160℃，2h灭菌接种工具）；培养设备：光照培养箱（25±2℃，光照2000–3000lx，12–16h光周期）、暗培养箱（25±2℃，愈伤诱导初期用）；辅助设备：电子天平（精度0.01g）、pH计（调pH至5.8–6.0）、解剖镜（观察茎尖）、接种工具（镊子、手术刀，需灭菌）、组培容器（玻璃瓶、聚丙烯瓶，带透气盖）。五、实验步骤（一）培养基配制与灭菌1.母液制备：大量元素母液（10倍）：按MS配方称取NH₄NO₃、KNO₃等，溶解后定容，4℃保存；微量元素母液（100倍）：称取FeSO₄·7H₂O、Na₂-EDTA·2H₂O（先溶EDTA，再加FeSO₄，加热促溶），定容后4℃保存；有机成分母液（100倍）：称取肌醇、维生素B₁等，溶解后定容，4℃保存；激素母液：6-BA（1mg/mL）、NAA（1mg/mL）等，溶解后过滤灭菌，-20℃保存。2.培养基配制：取母液（大量元素100mL、微量元素10mL、有机成分10mL）于烧杯，加蔗糖（30g）、琼脂（7g，固体培养基），加热搅拌至琼脂完全溶解。冷却至50–60℃时，加入激素（如6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L），用NaOH/HCl调pH至5.8–6.0。3.灭菌处理：培养基分装至组培瓶（每瓶30–50mL），封口后高压灭菌（121℃，20min）。灭菌后冷却，倒置检查污染（24h内无杂菌为合格）。（二）外植体消毒与处理1.预处理：外植体流水冲洗10–15min，去除表面杂质；叶片可剪去边缘，减少污染风险。2.酒精消毒：超净台内，外植体浸入75%乙醇30–60s，无菌水冲洗2–3次（远离明火）。3.强消毒剂处理：升汞消毒：浸入0.1%升汞5–10min（茎尖5min，叶片8min），无菌水冲洗3–5次；次氯酸钠消毒：浸入2%次氯酸钠（加1–2滴吐温-80）10–15min，无菌水冲洗3–5次。4.切割外植体：灭菌工具将外植体切为适宜大小（茎段1–2cm带1–2芽，叶片0.5–1cm²），保持切面平整，减少褐化。（三）无菌接种操作1.超净台准备：提前30min开紫外灭菌，接种前20min关紫外、开风机，用75%乙醇擦拭台面、工具及组培瓶。2.工具灭菌：接种工具浸入75%乙醇，灼烧灭菌（或放入灭菌器），冷却后使用（避免烫伤外植体）。3.接种操作：镊子夹取外植体，接种于培养基表面（茎段直立插入，叶片背面接触培养基），每瓶接种3–5个，封口后标记材料名称、日期、配方。（四）培养条件调控1.初代培养：接种后放入培养箱，温度25±2℃，光照2000–3000lx，光周期12–16h/d（愈伤诱导可先暗培养7–10d）。2.继代培养：外植体分化出芽丛或愈伤组织长至0.5–1cm时，切割为小块（芽丛分切单芽，愈伤分切0.3–0.5cm³），转至新鲜培养基（降低激素浓度），每20–30d继代一次。3.生根培养：芽长至2–3cm时，切下单芽（保留少量愈伤），转至生根培养基（如1/2MS+NAA0.5mg/L），培养条件同初代，10–15d可见根原基。（五）炼苗与移栽1.炼苗：生根后，培养瓶移至自然光照（遮光率50%），打开瓶盖，加少量无菌水，炼苗3–5d（增强环境适应力）。2.移栽：取出植株，洗净根部琼脂，移栽至灭菌基质（蛭石:珍珠岩=1:1或泥炭土:蛭石=2:1），浇透定根水，覆盖塑料膜保湿（1–2d后揭开），温度20–25℃，湿度70%–80%，定期浇水、施肥（稀释MS大量元素溶液）。六、注意事项1.无菌操作：全程在超净台内操作，避免说话、咳嗽，工具、手、台面严格灭菌，接种速度快，减少空气微生物污染。2.外植体选择：优先选取幼嫩、无病虫害材料，老熟组织分化能力弱、易污染。3.培养基质量：琼脂需完全溶解，pH调节准确（偏酸/碱影响琼脂凝固及植物生长），激素需过滤灭菌，避免高温破坏。4.环境控制：培养箱温度、光照稳定，定期清洁；污染瓶立即移出，避免交叉污染。5.褐化与玻璃化：外植体褐化时，培养基加0.1%–0.3%维生素C；玻璃化苗（茎细、叶透明）需降低培养基湿度、增加通风、调整激素比例。七、常见问题及解决方法问题类型可能原因解决方法------------------------------细菌污染外植体消毒不彻底、培养基灭菌不充分、操作污染延长消毒剂处理时间、检查灭菌参数、加强无菌操作真菌污染环境带菌（超净台滤网失效）、封口膜破损更换滤网、密封培养瓶、提前灭菌环境外植体褐化酚类物质氧化、切口过多加抗氧化剂（VC）、缩短消毒时间、减