花生种质抗旱性鉴定技术规程

1花生种质抗旱性鉴定技术规程本文件规定了花生种质抗旱性鉴定原理、方法和综合评价。本文件适用于花生种质苗期抗旱性评价及抗旱品种鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。发芽试验GB/T3543.4农作物种子检验规程第4部分播种质量发芽试验GB4407.2经济作物种子第2部分：油料类3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4鉴定原理通过利用高浓度聚乙二醇-6000溶液模拟自然干旱环境，对植株根系施加渗透胁迫后，测定相对植株鲜重、叶片相对含水量、比叶重、离体叶片失水速率、伤害度、游离脯氨酸含量和萎蔫指数等一系列能够表征花生种质抗旱能力的关键生化指标，并运用隶属函数法对其抗旱性进行综合评价。5鉴定方法5.1样品准备选取成熟饱满、大小一致的种子样品600粒，充分混合均匀，用1%的次氯酸钠溶液浸泡消毒10min，自来水冲洗3次，蒸馏水冲洗3次。种子质量应符合GB4407.2的规定。5.2幼苗培养将待测种子样品在25℃条件下浸种12h，均匀摆放至铺有双层湿润滤纸的培养皿中，置于人工气候箱内，按照GB/T3543.4规定进行纸间（BP）发芽。在种子发芽3d后，选取塑料盆钵40盆，装等量蛭石，每盆均匀播种5粒，种子芽朝下，播种深度3cm，置于人工气候室内培养，培养条件为：温度28℃/23℃（昼/夜）、光周期16h/8h（昼/夜）、光照强度400μmol·m-2·s-1～600μmol·m-2·s-1、相对湿度60%～70%。5.3根系处理盆栽样品幼苗生长至4叶期，分成对照组和干旱处理组，每组20盆，每盆保留3株。将所有幼苗从塑料盆钵中完整取出，用蒸馏水冲洗根部，吸干表面水分。对照组幼苗的根系完全浸泡在蒸馏水中，干旱2处理组幼苗的根系完全浸泡在20%聚乙二醇-6000溶液中，两组培养条件均同本文件5.2的规定。设3次重5.4指标测定5.4.1相对植株鲜重干旱处理24h后，选取对照组和干旱处理组长势一致的幼苗各5株，蒸馏水冲洗根部，吸水纸吸干表面水分，称量植株鲜重,按照公式（1）计算相对植株鲜重。RFW式中：RFW—相对植株鲜重（%FWt—干旱处理组植株鲜重（g5.4.2叶片相对含水量干旱处理24h后，选取对照组和干旱处理组长势一致的幼苗各5株，剪取倒数第3片复叶，称量叶片鲜重；然后，将叶片完全浸泡在蒸馏水中至恒重，称量叶片饱水重；最后，将叶片放入烘箱80℃烘干至恒重，称量叶片干重。按照公式（2）计算叶片相对含水量。RWC式中：RWC—叶片相对含水量（%FW0—叶片饱水重（gFW1—叶片鲜重（g5.4.3比叶重采用打孔称重法测定。干旱处理24h后，选取对照组和干旱处理组长势一致的幼苗各5株，剪取倒数第3片复叶，用直径为0.5cm的打孔器，避开主叶脉，打20个小圆片，称量鲜重。按照公式（3）计算叶片比叶重。SLW=FW式中：SLW—比叶重（g∙cm-25.4.4离体叶片失水速率干旱处理24h后，选取对照组和干旱处理组长势一致的幼苗各5株，剪取第3片复叶，称量叶片鲜重；然后,于室内避光自然风干,2h后称量叶片风干重；最后，于烘箱中80℃烘干至恒重，称量叶片干重。按照公式（4）计算离体叶片失水速率。3式中：RWL—离体叶片失水速率（mg∙g-1∙min-1FW1—叶片鲜重（gFW2—叶片风干重（g5.4.5伤害度干旱处理24h后，选取对照组和干旱处理组长势一致的幼苗各5株，剪取倒数第3片复叶，用直径为0.5cm的打孔器，避开主叶脉，打20个小圆片，于5mL蒸馏水中浸泡5h后，用电导仪测定初始电导值；然后沸水浴15min，冷却至室温后，测定终电导值。按照公式（5）计算相对电导率，按照公式（6）计算伤害度。式中：L—相对电导率（%）；K1—初始电导值；K2—终电导值。式中：I—伤害度（%）；Lt—干旱处理组的相对电导率（%Lck—对照组的相对电导率（%）。5.4.6游离脯氨酸含量5.4.6.1制定回归方程用分析天平精确称取脯氨酸25.0mg，倒入小烧杯中，少量蒸馏水溶解，然后倒入250mL容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，作为标准溶液（脯氨酸含量为100μg/mL）；取50mL容量瓶6个，分别装入脯氨酸标准溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL和3.0mL，用蒸馏水定容至刻度并摇匀，脯氨酸浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL和6μg/mL。取具塞试管6支，分别吸取各浓度的脯氨酸标准溶液2mL，再加入冰醋酸2mL和酸性茚三酮溶液2mL，每管在沸水浴中加热30min。室温冷却后，各试管加入甲苯4mL，震荡30s，静置片刻，至色素全部转移到甲苯层，用移液器将各管上层脯氨酸甲苯溶液吸至比色皿中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处比色。根据吸光值和脯氨酸浓度制定回归方程。5.4.6.2测定方法干旱处理24h后，选取对照组和干旱处理组长势一致的幼苗各5株，剪取倒数第3片复叶，称取0.5g并剪碎，置于试管中。然后向试管中加入3%的磺基水杨酸溶液5mL，加塞在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动）。室温冷却后，吸取2mL提取液至另一具塞试管中，加入冰醋酸2mL和酸性茚三酮溶液2mL，在沸水浴中加热30min。再次室温冷却后，加入甲苯4mL，震荡30s，静置片刻，萃取红色甲苯层。用移液器将上层脯氨酸甲苯溶液吸至比色皿中，以甲苯溶液为空白对照，测定520nm波长的吸4光值。根据回归方程计算测定液中脯氨酸的含量(μg/mL根据公式（7）计算样品中游离脯氨酸含量的百分数。PC式中：PC—样品中游离脯氨酸含量的百分数（%Y—测定液中脯氨酸的含量(μg/mL）；5.4.7萎蔫指数干旱处理24h后，选取对照组和干旱处理组长势一致的幼苗各5株，采用目测法，对照萎蔫指数等级划分标准评定等级，若萎蔫程度介于两级之间，则为半级。萎蔫指数等级划分标准见表1。表1萎蔫指数等级划分标准0123456抗旱性综合评价6.1计算平均隶属函数值根据测定的相对植株鲜重、叶片相对含水量、比叶重、离体叶片失水速率、伤害度、游离脯氨酸含量和萎蔫指数，利用隶属函数法进行综合性分析。按照公式（8）、公式（9）和公式（10）计算平均隶属函数值。μij=(xij-xjmin)/(xjmax-xjmin)（与抗旱性呈正相关的性状） μij=1-(xij-xjmin)/(xjmax-xjmin)（与抗旱性呈负相关的性状） 式中：ij—第i个品种第j个指标的隶属函数值；Xij—第i个品种