CN113116928B 预防或治疗眼疾的组合物及方法 （佛教慈济医疗财团法人）

(19)国家知识产权局(12)发明专利62/954,7382019.12.30US地址中国台湾花莲市(72)发明人李原杰孙立易公司11314A61P27/02(2006.01)TW201510220A,2015.03.16mesenchymalstemcellcondiofhepatocytesinacetaminophen-induced审查员张婷本公开提供一种预防或治疗眼疾的组合物数小时于以胎牛血清及间质干细胞培养基佐剂补充的培养基中，以取得间质干细胞条件培养开也提供用于预防或治疗例如干眼症的眼部上对照组R21.一种医药组合物在制备用于预防或治疗有其需要的个体中眼部上皮组织病症的用途，所述医药组合物包含治疗有效量的生物活性制剂，所述生物活性制剂包含如下制备的组合物：取得间质干细胞；于培养基中维持所述间质干细胞；自采集的所述培养基中取得含有分子量小于10kDa的活性成分的部分；其中所述培养基添加有血清及间质干细胞培养基佐剂；其中所述间质干细胞自脂肪组织取得；其中所述眼部上皮组织病症为干眼症；以及其中所述间质干细胞培养基佐剂包含纤维母细胞生长因子-2、N-乙酰基-L-半胱氨酸及L-抗坏血酸-2-磷酸盐中的至少其中一种。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述血清为胎牛血清或人类血清，其在所述培养基中的浓度介于5%至15%的范围。3.根据权利要求1所述的用途，其中所述纤维母细胞生长因子-2在所述间质干细胞培养基佐剂中的浓度范围为5ng/mL至15ng/mL。4.根据权利要求1所述的用途，其中所述N-乙酰基-L-半胱氨酸在所述间质干细胞培养5.根据权利要求1所述的用途，其中所述L-抗坏血酸-2-磷酸盐在所述间质干细胞培养基佐剂中的浓度范围为0.1mM至0.5mM。6.根据权利要求1所述的用途，其中含有所述活性成分的所述部分的分子量小于3kDa。7.根据权利要求6所述的用途，其中含有所述活性成分的所述部分的分子量小于1kDa。8.根据权利要求1所述的用途，其中所述间质干细胞于所述培养基中培养至少2代。9.根据权利要求1所述的用途，其中所述间质干细胞自另一个体取得。10.根据权利要求9所述的用途，其中所述另一个体是哺乳动物。11.根据权利要求10所述的用途，其中所述另一个体是人类。12.一种组合物，其由根据权利要求1至11中任一项所取得的小于10kDa的所述部分和药学上可接受的载体所组成。3预防或治疗眼疾的组合物及方法技术领域[0001]本公开涉及脂肪来源干细胞的条件培养基，尤其涉及用于预防或治疗眼部病症的脂肪来源干细胞条件培养基。本公开也涉及制备脂肪来源干细胞的条件培养基的方法。背景技术[0002]干眼综合征(dryeyesyndrome,DES)或干眼征的发病率日趋增加。干眼造成眼部不适并损害视觉品质(1)。目前用于干眼综合征的治疗策略包括提供润滑剂、抗炎药物诸如皮质类固醇或环孢素、泪点阻塞法、甚或自体血清。泪点阻塞法降低泪膜损失，但增加泪膜中的炎性细胞激素或酶(2)。外用使用自体血清滴液提供模拟天然泪液的润滑以及某些生化组分。但自体血清的制备及保存不便利，且其对于干眼的症状及征候的效果不一致或缺少效果(3)。由于传统治疗方法于日常实践中并不理想，因此需要进一步探索。[0003]据信，干细胞于退化性病变中具有极佳的功用，且已有报导，干细胞产生的旁分泌因子可增强组织再生及愈合作用(4-6)。它们于上皮损害中的修复能力及抗炎效果也业经证明(7,8)。由于角膜及结膜上皮损害及发炎是干眼的两个重要肇因，故干细胞及旁分泌因子对干眼的效果值得更深入的研究。尽管干细胞自身可能具备致肿瘤特性及抗原特性，但相关领域中亟待解决的问题是研发用于有效预防或治疗干眼的医药组合物。发明内容[0004]本公开提供一种治疗有此需要的个体的眼部上皮组织病症的方法，包括向所述个体投予治疗有效量的生物活性制剂，该生物活性制剂包含通过下述制备的组合物：获得间质干细胞；于培养基中培养该间质干细胞；采集该培养基；以及从采集的该培养基中取得小于30kD的部分(fraction)。于至少一个实施方案中，该培养基添加血清(serum)及间质干细血清为胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)或人类血清，其于培养基中的浓度范围为5%至15%。于某些实施方案中，该培养基添加10%血清及间质干细胞培养基佐剂。于某些实施方案中，该血清(例如FBS)以5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%的[0005]于至少一个实施方案中，间质干细胞培养基佐剂包含纤维母细胞生长因子2(FGF-2)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)及L-抗坏血酸-2-磷酸盐(L-ascorbicacid-2-phosphate,AsA2P)中的至少其中一种。于某些实施方案中，该纤维母细胞生长因子-2在间质干细胞培养基佐剂中的浓度范围为5ng/mL至15ng/mL。于某些实施方案中，该纤维母细胞生长因子-2在间质干细胞培养基佐剂中的浓度为5ng/mL、6ng/mL、7ng/[0006]于至少一个实施方案中，N-乙酰基-L-半胱氨酸在间质干细胞培养基佐剂中的浓4[0007]于至少一个实施方案中，L-抗坏血酸-2-磷酸盐在间质干细胞培养基佐剂中的浓[0008]于某些实施方案中，间质干细胞培养基包含约10ng/mL纤维母细胞生长因子2(FGF-2)、约2mMN-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)及0.2mML-抗坏血酸-2-磷酸盐(L-ascorbicacid-2-phosphate,AsA2P)。[0009]于至少一个实施方案中，间质干细胞于培养基中培养至少2次传代，例如3次传代、4次传代或5次传代。[0010]于至少一实施方案中，间质干细胞自一个体获得，其中所述个体为另一个体。于某间质干细胞自一个体的脂肪组织获得。[0011]于本公开的至少一个实施方案中，本公开也提供一种组合物，其包含以如下方式制备的小于30kDa的部分：自个体获得间质干细胞；于培养基中培养该间质干细胞；采集该培养基；以及从采集的该培养基中获得小于30kD的部分。[0012]于至少一个实施方案中，从采集的该培养基中获得小于10kDa(例如小于8kDa、小[0013]于本公开的至少一实施方案中，本公开也提供一种组合物外用于治疗眼部上皮组织病症的用途，该组合物包含小于30kDa的部分。于某些实施方案中，该眼部上皮组织病症为干眼症。于某些实施方案中，该干眼症由以下至少一种原因造成：泪液缺乏、干燥空气或老化。[0014]本公开提供一种治疗有此需要的个体的干眼综合征的方法，包括向所述个体投予治疗有效量的生物活性制剂，该生物活性制剂包含通过下述制备的组合物：获得脂肪来源的干细胞(adipose-derivedstemcell,ADSC);于第一培养基中维持该脂肪来源的干细胞；于第二培养基中培养该脂肪来源的干细胞；采集该第二培养基；以及从采集的该第二培养基获得小于30kD(<30kDa)的部分(fraction)。[0015]于某些实施方案中，本公开提供一种制备脂肪来源的干细胞条件培养基(adipose-derivedstemcell-condi肪来源的干细胞(ADSC);将脂肪来源的干细胞维持于间质干细胞维持培养基中；收集第2至5代的脂肪来源的干细胞；将脂肪来源的干细胞于以1mM至5mM谷氨酰氨、5%至15%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)及间质干细胞培养基佐剂(mesenchymalstemcellcultureadjuvant,MCA)补充的无酚红伊斯科夫氏改良杜尔贝科氏培养基(Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium,IMDM)中培养36小时至132小时，以获得脂肪来源的干细胞条件培养基(ADSC-CM);采集脂肪来源的干细胞条件培养基；以及离心，之后过滤。于某些实以5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%的量补充36小时、48小时、60[0016]于本公开的至少一个实施方案中，ADSC-CM包含分子量小于30kDa的活性成分，例[0017]本公开也提供用于治疗或预防干眼的脂肪来源干细胞的条件培养基(ADSC-CM),5其中该脂肪来源干细胞的条件培养基是以前述方法获得，并且该脂肪来源干细胞的条件培[0018]于本公开的至少一个实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于3kDa的活性成分。[0019]本公开也提供用于治疗或预防干眼的脂肪来源干细胞的条件培养基(ADSC-CM),其中该脂肪来源干细胞的条件培养基是以前述方法获得，并且该脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于3kDa的活性成分。[0020]于本公开的至少一个实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于1kDa的活性成分。[0021]本公开也提供用于治疗或预防干眼的脂肪来源干细胞的条件培养基(ADSC-CM),其中该脂肪来源干细胞的条件培养基是以前述方法获得，并且该脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于1kDa的活性成分。[0022]本公开也提供用于治疗或预防干眼的方法，包括将以前述方法获得的脂肪来源干细胞的条件培养基投予至个体眼部，其中该脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于30kDa的活性成分。[0023]本公开也提供用于治疗或预防干眼的方法，包括将以前述方法获得的脂肪来源干细胞的条件培养基投予至个体眼部，其中该脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于3kDa的活性成分。[0024]本公开也提供用于治疗或预防干眼的方法，包括将以前述方法获得的脂肪来源干细胞的条件培养基投予至个体眼部，其中该脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于1kDa的活性成分。[0025]本公开还提供包含以前述方法获得的脂肪来源干细胞的条件培养基的组合物，其中该脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于30kDa的活性成分。[0026]本公开还提供包含以前述方法获得的脂肪来源干细胞的条件培养基的组合物，其中该脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于3kDa的活性成分。[0027]本公开还提供包含以前述方法获得的脂肪来源干细胞的条件培养基的组合物，其中该脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于1kDa的活性成分。附图说明[0028]通过阅读下述实施例的说明并参照所附图示，可更完全地理解本公开，其中：[0029]图1显示，在干燥应激研究中，通过细胞计数试剂盒8(CellCountingKit-8,CCK-8测定)测量不同培养基制剂对于人角膜上皮细胞(HCEC)存活率的效果。令HCEC生长至大约80%融合度，随后令其空气干燥10分钟。干燥后，将细胞转移至不同培养基中。温育2小时后，使用CCK-8测定计数细胞。对照组代表未经空气干燥处理的HCEC。R代表清爽润滑表示以10ng/mL纤维母细胞生长因子2(FGF-2)、2mMN-乙酰基-L-半胱氨酸及0.2mML-抗坏血酸-2-磷酸酯补充的IM。ADSC-CM表示通过培养脂肪来源的间质干细胞而条件化的IMMCA。CEM表示以角膜上皮细胞生长试剂盒组分补充的角膜上皮细胞基本培养基。数值呈现为三6次重复实验的均值±SEM。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,与对照组比较。#P<0.05,###P<0.001,与CEM组比较；[0030]图2显示，来自干燥应激研究中的HCEC中JUK、P38及Erk1/2基因表达的免疫印迹分[0031]图3显示，经不同滴眼液治疗的圈养于人工气候室(CEC)中的BALB/c小鼠的泪液体<0.05,**p<0.01,***p<0.001。#代表与干燥对照组比较，#p代表与IMMCA组比较，&p<0.05,&&p<0.01,&&&p<0.001.%代表与清爽滴眼液组比较，%p<0.05,%%p<0.01,%%%p<0.001。均值±SEM,N=4.每日一次，将0.2%苯扎氯胺(BAK)投药至每只眼睛；[0032]图4显示BALB/c小鼠的荧光素染色及孟加拉玫瑰红染色。来自CEC的小鼠的角膜染无染色；1=轻微的点状染色(<30点);2=点状染色(>30点)但无弥散；3=严重的弥散染色，但无阳性斑块；以及，4=阳性荧光素斑块。角膜的孟加拉玫瑰红染色评分如下：1=少量分离的点；2=众多分离的点；以及，3=融合的点(最大得分为9分)。*p<0.05,与非干燥对照组连接屏障完整性的共焦显微镜检查。BF:亮视野；[0034]图6A至6E显示，不同组的人工气候室(CEC)诱导的干眼中，结膜杯状细胞的希夫氏过碘酸(PAS)染色结果。图6A:非干燥对照组。图6B至6E:来自CEC作为干燥对照组的小鼠(图非干燥对照组比较，*p<0.05,***p<0.001。+代表与非干燥对照组比较，+p<0.05,+++p<[0036]图7显示，通过免疫组织化学分析，不同滴眼液对于CEC中的BALB/c小鼠的结膜上[0037]图8A至8E显示，来自使用不同滴眼液治疗的圈养于CEC中的BALB/c小鼠的角膜的[0038]图9A至9E显示，来自使用不同滴眼液治疗圈[0039]图10A至10D显示，于干燥应激研究及高渗透压应激研究中，通过CCK-8测量不同培7[0040]图11显示，于干燥应激研究中，通过CCK-8测量不同培养基制剂及ADSC-CM部分对于HCEC存活率的影响。数值呈现为三次重复实验的均值±SEM。*P<0.05,**P<0.01,***P<[0041]图12显示，于干燥应激研究中，通过CCK-8测量不同培养基制剂及ADSC-CM的0-1kDa部分对于HCEC存活率的效果。数值呈现为三次重复实验的均值±SEM。*P<0.05,**P<[0042]图13A至13C显示，使用不同ADSC-CM部分治疗圈养于CEC室中的小鼠的泪液体积。显示了每组的泪液体积均值。*与非干燥对照组比较，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。#与干燥对照组比较，#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001。均值±SE诱导的干眼模型中，BALB/c小鼠的角膜上皮及角膜上皮紧密连接屏障完整性的共焦显微镜[0044]图17A至17E显示，不同组的CEC诱导的干眼中，结膜杯状细胞的PAS染色结果。图17A:非干燥对照组。图17B至17E:来自作为干燥对照组的CEC中的小鼠(图17B),以及使用[0045]图17F显示，不同组的CEC诱导的干眼之间，结膜杯状细胞密度的统计学比较。#与[0046]图18A至18G显示，不同组的CEC诱导的干眼中，结膜杯状细胞的PAS染色结果。图18A:非干燥对照组。图18B至18G:来自作为干燥对照组的CEC中的小鼠(图18B),以及使用ADSC-CM(图18C)、ADSC-CM>10kDa(图18D)、ADSC-CMK10kDa(图18E)、ADSC-CM>3kDa(图18F)[0047]图18H显示，不同组的CEC诱导的干眼之间，结膜杯状细胞密度的统计学比较。*与非干燥对照组比较，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。#与干燥对照组比较，#p<0.05,##p<[0048]图19A至19F显示，不同组的CEC诱导的干眼中，结膜杯状细胞的PAS染色结果。图19A:非干燥对照组。图19B至19F:来自作为干燥对照组的CEC中的小鼠(图19B),以及使用[0049]图19G显示，不同组的CEC诱导的干眼之间，结膜杯状细胞密度的统计学比较。*与非干燥对照组比较，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。#与干燥对照组比较，#p<0.05,##p<[0050]图20A至20E显示，小鼠结膜上皮中MUC16表达的免疫组织化学分析结果。图20A:非滴眼液治疗者及干燥对照组相比，经ADSC-CM及ADSC-CM的0-30kDa部分治疗者中的结膜MUC16表达更高。箭头指示结膜上皮表面上的MUC16表达；[0051]图21A至21G显示，小鼠结膜上皮中MUC16表达的免疫组织化学分析结果。图21A:非8示，与使用IMDM治疗者及干燥对照组相比，经ADSC-CM以及ADSC-CM的0-3kDa部分及ADSC-CM[0056]图25A至25E显示，来自使用不同滴眼液治疗的圈养于CEC中的BALB/c小鼠的角膜的扫描电子显微镜检查结果。图25A:非干燥对照组；图25B:干燥对照组；[0057]图26A至26G显示，来自使用不同滴眼液治疗的圈养于CEC中的BALB/c小鼠的角膜[0058]图27A至27F显示，来自使用不同滴眼液治疗的圈养于CEC中的BALB/c小鼠的角膜具体实施方式[0059]下列实施例用以例示本公开。基于本公开的说明书，本领域技术人员可构思本公开的其他方面。本公开也可如不同实施例中所揭示般予以实施或应用。对于不同方面及应用，可修饰及/或变更实施例以完成本公开而不抵触其范畴。[0060]应进一步注意到，如本说明书中所用，除非明确指出并毋庸置疑地限制为一个参[0061]本公开提供一种治疗有此需要的个体的干眼综合征的方法，包括向所述个体投予治疗有效量的生物活性制剂，该生物活性制剂包含通过下述制备的组合物：获得脂肪来源的干细胞(ADSC);于第一培养基中维持该脂肪来源的干细胞；于第二培养基中培养该脂肪来源的干细胞；采集该第二培养基；从所采集的第二培养基中获得小于30kDa的部分。9[0062]对于维持及培养脂肪来源的干细胞，可使用不同类型的培养基并由本领域技术人员选择。于至少一个实施方案中，培养基选自由α最小必需培养基(alphaminimumessentialmedium,MEM)、杜尔贝科氏改进伊格尔氏培养基(Dulbecco'sModifiedEagle’科夫氏改良杜尔贝科氏培养基(Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium,IMDM)及AIM-V培养基组成的组。细胞可于包含胎牛血清或其他生长因子的多种培养基中培养以进行扩张。于至少一个实施方案中，将细胞转移至实质上缺乏血清的培养基中，并且可通过各种手段执行投予前的条件培养基制备；例如，可将条件培养基于一定条件下无菌过滤或浓缩。于某些实施方案中，条件培养基进行进一步的制备步骤以获得含有不同分子的不同部分，该不同部分的分子具有下列范围的大小：大于100kDa、大于30kDa、大于3kDa、大于1kDa、小于于1kDa、介于大于0kDa与100kDa之间、介于大于0kDa与30kDa之间、介于大于0kDa与3kDa之[0063]于某些实施方案中，条件培养基用于制造药物制剂的活性成分。于至少一个实施方案中，干细胞条件培养基可作为治疗剂单独投予。于某些实施方案中，投予可包括已知药物制剂的方式，包括用于口服投予的片剂、胶囊剂或剂，用于直肠投予的栓剂，用于肠胃外或肌肉内投予的无菌溶液，脂质体或胶囊化制剂。于该等制剂剂中，治疗剂单独使用或偶联至如递送剂或媒介物等。应知悉，本公开的治疗性实体将与被并入制剂中的合适载体、赋形剂及/或其他剂一起投予，以提供改善的转移、递送、耐受性含有媒介物(诸如Lipofectin)的脂质(阳离子性或阴离子性)、DNA偶联物、无水吸收糊、水包油乳液及油包水乳液、乳液卡波蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶、以及含有卡波蜡的半固体混合物。前述混合物的任一者均可适用于根据本公开的处理及治疗，前提条件为制剂中的活性成分不被制剂灭活并且制剂与其投予途径为生理上相容且可耐受。[0064]于一些实施方案中，本公开制备的组合物通过外用制剂投予。外用制剂可用于治粉末，并且可含有赋形剂诸如增溶剂、渗透增强剂(例如，脂肪酸、脂酸)、以及亲水性聚合物(例如，聚卡波非及聚乙烯基吡咯烷酮)。于学上可接受的载体是脂质体或透皮增强剂。本公开的外用制剂可包括皮肤学上可接受的载剂，例如，能够将制剂的其他组分递送至皮肤的物质，那些组分可被皮肤可接受地施用或吸收。典型载体包括溶剂以溶解或分散治疗剂，以及任选的一种或多种赋形剂或其他媒介物用制剂通过将本公开的组合物与外用载体根据本领域周知的方法混合，例如，标准参考文开的外用制剂中。本公开的外用制剂可设计为留在皮肤上，并且于施用之后不会于短期内被洗除。或者，外用制剂可设计为使用之后于特定时间内冲洗掉。[0065]本公开提供一种制备脂肪来源干细胞的条件培养基(ADSC-CM)的方法，包括从个体单离脂肪来源的干细胞(ADSC);将脂肪来源的干细胞维持于间质干细胞维持培养基中；收集传代2至5次的脂肪来源的干细胞；将脂肪来源的干细胞于以1mM至5mM谷氨酰氨、5%至科氏培养基(IMDM)中培养36小时至132小时，以获得脂肪来源干细胞的条件培养基(ADSC-L-半胱氨酸(NAC)及0.1mM至0.5mML-抗坏血酸-2-磷酸酯(AsA2P);采集该脂肪来源干细胞[0067]于本公开的一个实施方案中，MCA包含约5ng/mL至15ng/mL纤维母细胞生长因子2氨酸及约0.2mML-抗坏血酸-2-磷酸酯(AsA2P)。[0068]于本公开的至少一个实施方案中，该方法还包括在过滤后冷冻的步骤。[0069]于本公开的至少一个实施方案中，个体是哺乳动物。于某些实施方案中，该个体是[0070]于本公开的至少一个实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于30kDa的活性成分。[0071]于本公开的某些实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于3kDa的活性成分。[0072]于本公开的又一实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于1kDa的活性成分。[0073]本公开也提供用于预防或治疗干眼的脂肪来源干细胞的条件培养基(ADSC-CM)。于本公开的至少一个实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于30kDa的活性成分。于本公开的某些实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于3kDa的活性成分。于本公开的某些实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于1kDa的活性成分。[0074]如本文中所用，术语“干眼”是指泪膜由于泪液不足或过度蒸发所导致的病变，其造成眼睑间眼表面的损害并且与眼部不适的综合征相关(37)。[0075]本公开也提供用于治疗或预防干眼的方法，包括将以前述方法获得的脂肪来源干细胞的条件培养基施用至个体眼部。于一实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于30kDa的活性成分。于本公开的某些实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于3kDa的活性成分。于本公开的又一实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培11养基包含分子量小于1kDa的活性成分。本公开还提供医药组合物，其包含从前述方法获得的脂肪来源干细胞的条件培养基。于至少一个实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于30kDa的活性成分。于本公开的某些实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于3kDa的活性成分。于本公开的某些实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于1kDa的活性成分。[0076]下面是进一步证明本公开功效的实施方案，但并不试图限制本公开的范畴。[0078]制备例1:脂肪来源干细胞的条件培养基(ADSC-CM)的分离及维持[0079]本研究由佛教济慈医院内部审查委员会批准(IRB102-130),从所有研究个体获得了知情同意书。分别于23、28及30岁的三位女性的美容抽脂时从腹部皮下脂肪获得人类脂肪组织。使用与Griesche及同仁所提供者(9)类似的方法分离基质-血管部分细胞。添加I型胶原酶(Sigma)至最终浓度为0.4mg/mL,以于杂交箱中进行酶切割反应，该反应在37℃、30°角及15rpm的条件下执行45分钟。经切割的脂肪组织以400×g离心10分钟，产生基质血管部分(SVF)颗粒以进行后续的ADSC培养。为了维持及扩张ADSC群体，将细胞于含有伊斯科夫氏改良杜尔贝科氏培养基(IMDM,Gibco)、10%胎牛血清(FBS,Gibco)以及10ng/mLFGF-2(R&DSystems)的间质干细胞维持培养基中培养，如先前所述(10,11)。实验使用传代2至5次的[0081]将ADSC以每烧瓶1×10⁶个细胞接种至150cm²组织培养烧瓶(BDFalcon,355001,Durham,NC)中，使用以2mM谷氨酰氨(Gibco)、10%生长因子2(FGF-2,R&DSystems)、2mMN-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC,Sigma)及0.2mML-抗坏血酸-2-磷酸酯(AsA2P,Sigma)的间质干细胞培养佐剂(MCA)补充的无酚红伊斯科夫氏改良杜尔贝科氏培养基(IMDM)(Gibco)培养。培养72小时后，收集ADSC条件培养基(ADSC-CM),以300×g离心5分钟，透过0.22μm注射器式过滤器过滤。收集来自P2至P5ADSC的ADSC-CM并混合，然后等量分装并冷冻以用于进一步的用途。[0083]使用MilliporeAmiconUltra-15离心管或SpectrumLabs中空纤维过滤器制备用Amicon离心浓缩器(分子量截止值(MWCO)=30kDa、3kDa或1kDa)浓缩至最终浓度为1mg/mL,收集穿透流过的流体并浓缩至最终浓度为1.5mg/mL。将样品快速冷冻，并于-20℃储存[0084]经浓缩的条件培养基以IMDM稀释，加入细胞中以通过细胞计数试剂盒8对有存活细胞数进行定量。[0085]对于经冷冻干燥的条件培养基测试，于5mL冷冻干燥管中制备经渗析的样本的等量分装(1mL),之后在可编程的冻干仪中冷冻干燥。[0086]对于热稳定测试，将条件培养基于56℃温育30分钟或于100℃温育3分钟。[0087]对于脂质提取，通过己烷以1:1比率将条件培养基处理3分钟，并收集下层水相。[0088]对于带电测试，首先将条件培养基渗析至20mMTris(pH8.0)。渗析后，将样品施加至SP-Sepharose阳离子交换柱。用20mMTris、1MNaCl(pH8.0)以6倍柱体积洗脱该柱。Westport,Ireland),NY,USA)计数细胞，或分解于放射免疫沉淀测定(radio-immunoprecipitationassay,[0093]对于免疫印迹分析，细胞以冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并使用含有Halt蛋白酶及磷酸酶抑制剂混合液(Pierce,ThermoFisherScientific,Rockford,IL,℃以13,200rpm离心10分钟，并收集上清液用于实验。细胞提取物的蛋白质浓度使用Bradford氏方法蛋白质检定试剂盒(Amresco,Ohio,USA)通过Bradford氏方法以已知浓度偏二氟乙烯(PVDF)膜(Sigma)上。以含有0.1%Tween-20(PBS-T)和5%脱脂奶的PBS于室温封闭该膜1小时，然后于4℃使用适宜的一抗温育过夜，该一抗为兔单克隆抗Erk1/2酶/c-JunNH2-末端激酶)抗体、用Seppro去除缓冲液(Sigma)以1:1000稀释的兔单克隆抗1:5000稀释的兔单克隆抗GAPDH(甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶)抗体(CellSignaling磷酸化的P38(P-P38)的表达及经磷酸化的Erk1/2(P-Erk1/2)的表达。[0096]实施例2:使用ADSC-CM进行的活[0097]1.鼠干眼模型的建立：[0098]所有实验过程均得到慈济大学实验室动物护理及使用委员会的批准。如先前所述，在人工气候室(CEC)中诱导BALB/c小鼠的干眼相关的眼表面征候(15)。简而言之，将13周龄的BALB/c小鼠暴露于相对湿度为10±3%且温度为21-25℃的CEC中，并且监控并维持10-15L/min的气流。将小鼠分为五组。每一实验组及对照组均由5只小鼠组成。将四组保留在CEC中作为干眼组，将一组保留在湿度为75±3%的室中作为正常非干燥对照组。于四个CEC干眼组中，作为干眼对照组的一组不接受任何滴眼液，而其他三组分别接受下列滴眼液：R、IMMCA(用作尚未经ADSC条件化的对照培养基)及ADSC-CM培养基，每天两次，共计28[0099]于实验结束时(即，于终点的第28天),通过荧光素染色及孟加拉玫瑰红染色评估眼表面，并通过光学同调断层扫描估算角膜厚度。然后牺牲小鼠，保存眼球以进行免疫组织化学研究及电子显微镜检查。[0100]此外，数据的统计学分析表示为均值±均值的标及双样品t测试用以比较CCK-8测定、荧光素及孟加拉玫瑰红染色、以及结膜杯状细胞密度。p<0.05视为统计上显著。[0101]2.泪液分泌检定[0102]通过Zone-Quick酚红棉线(日本昭和药品化工株式会社)的泪液吸收变色区域的长度估算泪液分泌。简而言，以4秒的标准时间移除过量泪液，然后用小镊子夹持Zone-Quick酚红棉线并将其在侧穹隆内放置30秒。首先量测左眼，然后量测右眼。计算两个眼睛的平均值进行分析。本研究中，每一实验组及对照组由10只眼睛(n=5只小鼠/组)组成。[0103]如图3中所示，与泪液分泌检定中的其他组相比，ADSC-CM组小鼠分泌的泪液体积显著不同。于治疗的第一周及第二周，ADSC-CM组的小鼠具有与非干燥对照组小鼠相当的泪液体积，代表ADSC-CM能够维持与非干燥对照组相同的泪液体积水平。于第三周及第四周，ADSC-CM组小鼠分泌的泪液体积仍具有显著高于干燥对照组及以IMMCA治疗的小鼠的泪液体积。[0104]3.荧光素染色及孟加拉玫瑰红染色检定[0105]将一滴1μL的1%荧光素施用至结膜囊内90秒后，使用下列荧光素染色评分系统独立地评估角膜：0=无染色；1=轻微的点状染色(<30点);2=点状染色(>30点)但无弥散；3=严重的弥散染色，但无阳性斑块；以及，4=阳性荧光素斑块(16)。Bijsterveld系统对角膜的孟加拉玫瑰红染色进行评分：1=少量分离的点；2=众多分离的点；以及，3=融合的点(最大得分为9分)(17)。的程度。[0108]4.免疫荧光双重染色[0109]将眼睛固定于10%甲醛中。进行石蜡包埋后，将3μm切片于二甲苯中脱蜡，于一系列乙醇溶液中再水合，并用蒸馏水洗涤两次。于90至95℃,使用pH=9的DAKO靶标修复溶液连蛋白的表达受到抑制。尽管外部施用R或IMMCA减轻了对表达的抑制，但ADSC-CM显示了最佳的补救。于另一实验中，图5B显示，CEC中的BALB/c小鼠的Z0-1及角蛋白12(K12)表达也受[0111]5.组织学分析及免疫组织化学(IHC)检定[0112]对于组织学检定，将眼睛固定于10%甲醛中并包埋在石蜡中。用苏木精-曙红或希夫氏过碘酸(PAS)对3μm厚度的中心垂直面切片进行染色。测量角膜上皮形态及位于中心角膜处的上皮及基质的厚度，并通过ImageJ检定来计算平均结膜杯状细胞密度。的平均结膜杯状细胞密度，并且与非干燥对照组相当。[0114]对于MUC16免疫组织化学，将眼睛固定于10%甲醛中。进行石蜡包埋后，将8μm厚度的切片于二甲苯中脱蜡，于一系列乙醇溶液中再水合，并用蒸馏水洗涤两次。于90至95℃,用pH=9的DAKO靶标修复溶液(DAKO,Glostrup,Denmark)执行抗原修复15分钟。使用Histofine小鼠染色试剂盒(Nichirei,Tokyo,Japan)于8μm厚的切片上执行MUC16染色。以抗MUC16(1:50;SantaCruz,SantaCruz,CA,USA)将切片于4℃温育越夜，并最终使用Histofine简单染色最大PO染色10分钟。使用3,3'-二氨基联苯氨四盐酸盐及钴(D-0426,Sigma,SaintLouise,Missouri,USA)将辣根过氧化物酶反应显影。也进行阴性对照组的实验，但不使用一抗。于分级的乙醇及二甲苯中脱水后，将切片封固于Histokit(HechtAssistent,Sondheim,Germany)中并分析。[0115]如图7所示，MUC16的免疫组织化学分析显示，非干燥组的结膜的MUC16表达是连续ADSC-CM组中的箭头指示结膜上皮细胞。[0116]6.透射电子显微镜(TEM)分析[0117]首先，将新鲜角膜样品于2%多聚甲醛中固定24小时，然后在0.2M二甲胂酸盐缓冲液中的2.5%戊二醛溶液中固定，然后加上1%单宁酸于pH7.0-7.3固定24小时，并且在处于0.2M二甲胂酸盐缓冲液中的1%四氧化锇溶液中后固定1小时。于进一步固定后，用0.2%醋酸氧铀对样品进行2小时的整块染色，然后通过乙醇/丙酮脱水，并于室温下于纯Spurr树脂中包埋8小时。最终，将样品于62℃聚合48小时，然后于透射电子显微镜(HitachiH-7500,HitachiLtd.,Japan)下拍摄照片。[0118]如图8A至8E所示，TEM研究表明，CEC诱导干眼小鼠中，角膜上皮细胞之间的紧密连接及指状交叉(interdigitation)降低。使用ADSC-CM进行的治疗增加了相邻角膜上皮细胞之间的指状交叉及紧密连接形成。[0119]7.扫描电子显微镜(SEM)分析[0120]首先，将新鲜角膜于2%多聚甲醛中固定24小时，然后在0.2M二甲胂酸盐缓冲液中的2.5%戊二醛溶液以及1%单宁酸中于pH7.0至7.3固定24小时，并且使用处于0.2M二甲胂酸盐缓冲液中的1%四氧化锇溶液后固定1小时。然后，样品通过临界点干燥器(Hitachi子显微镜(HitachiLtd.,Japan)观察样品并拍摄照片。效果最佳。[0122]实施例3:使用ADSC-CM不同分子量大小部分进行的体外人角膜上皮细胞(HCEC)干燥应激研究[0123]如上文制备例3中所述，制备不同ADSC-CM分子量大小的部分。获得了含有>ADSC-CM部分，并进行干燥应激及高渗透压应激，然进行的干燥应激研究如上文实施例2中所述。对于高渗透压应激研究，令HCEC生长至大约60%融合度，然后用新鲜培养基(311毫渗透克分子(mOsM))或含有90mMNaCl(480mOsM)的培养基处理24小时。于高渗透压处理后，将细胞于不同培养基中培养。于温育2小时后，以[0124]结果显示于图10A至10D中。显示，含有0至750kDa、0至300kDa、0至100kDa及0至激或高渗透压应激破坏。[0125]制备其他分子大小的ADSC-CM部分以分析ADSC-CM中活性成分的分子大小。获得含所述的干燥应激研究，并通过CCK-8测定评估。结果显示的保护细胞不被干燥应激破坏的效果而言，含有0至30kDa、0至10kDa及0至3kDa的ADSC-CM部分具有优于含有>30kDa、>10kDa及>3kDa的ADSC-CM部分的效果。[0126]使用含有0-1kDa的ADSC-CM部分估，结果显示于图12中。含有0-1kDa的ADSC-CM部分于保护细胞不被干燥应激破坏中仍有效，所保持的细胞的百分比类似于那些经ADSC-CM处理者。[0127]实施例4:使用ADSC-CM不同分子量大小部分进行的干眼的动物活体研究[0128]使用动物活体研究进一步评估上文所制备的ADSC-CM部分的治疗干眼的效果。如上文所述，进行泪液分泌检定、免疫荧光双重染色、组织学分析、免疫组织化学(IHC)测定、透射电子显微镜(TEM)分析及扫描电子显微镜(SEM)分析。其分泌如非干燥对照组一样多或甚至更多的分泌泪液体积。眼液对于角膜上皮特异性蛋白K12的表达，以及对于紧密连接屏障的完整性的效果。自结果可知，使用不同滴眼液治疗，角膜上皮特异性蛋白质K12的表达并未改变，而于干燥处理小鼠中观察到小鼠角膜上皮中紧密连接相关蛋白Z0-1及紧连蛋白的表达量降低，但可通过ADSC-CM以及具有0至30kDa、<10kDa、<3kDa、0至3kDa及0至1kDa的ADSC-CM部分成功地予以阻止。[0131]如上文所述进行组织学分析，以比较不同分子大小的ADSC-CM部分对于角膜上皮形态、中心角膜处的上皮及基质的厚度、以及平均结膜杯状细胞密度的效果。如图17A至图杯状细胞减少，而具有30至100kDa的ADSC-CM部分未显示相同效果。图19G中，具有0至3kDa及0至1kDa的ADSC-CM部分逆转了于CEC诱导干眼中观察到的结膜杯[0133]此外，实施IHC测CEC诱导干眼中观察到被抑制的MUC16表达，而具有30至100kDa的ADSC-CM部分(图20E)未显示相同效果。图20E中的箭头指示结膜上皮细胞。[0134]图21A至图21G显示圈养于CEC中以ADSC-CM及不同ADSC-CM部分治疗的小鼠的疗的小鼠的MUC16表达结果。以ADSC-CM(图22C)、具有0至3kDa的ADSC-CM部分(图22D)及具有0至1kDa的ADSC-CM部分(图22E)治疗的干眼具有与非干燥对照组及以ADSC-CM治疗者类[0136]相同地，也检查圈养于CEC中以不同ADSC-CM部分治疗的动物的MUC4表达量。图23A结果。其显示，具有0至30kDa、<10kDa及<3kDa的ADSC-CM部分显示与非干燥对照组及以疗者类似的MUC4表达量，而以IMDM治疗的小鼠显示类似于干燥对照组中所见的减少的MUC4表达量。<30kDa的ADSC-CM部分的外部施用(图25E)保持了角膜上皮的微绒毛，并且具有与施用ADSC-CM者(图25C)及非干燥对照组类似的效果。然而，30至100kDa的ADSC-CM部分(图25D)并未显示相同的效果。[0139]同样地，图26A至图26G显示使用具有>10kDa、<10kDa、>3kDa及<3kDa的ADSC-CM部部施用保持了角膜上皮的微绒毛，并且具有与施用ADSC-CM者(图26C)及非干燥对照组(图26A)类似的效果。然而，经具有>10kDa的ADSC-CM部分(图26D)及具有>3kDa的ADSC-CM部分(图26F)治疗的干眼不能保持干眼中诱导的角膜上皮的微绒毛。[0140]再者，图27A至图27F显示经具有0至3kDa及0至1kDa的ADSC-CM部分治疗的干眼的均显示与非干燥对照组(图27A)及以ADSC-CM治疗者(图27C)中观察到类似的角膜上皮细胞微绒毛的保持，而经IMDM治疗的小鼠(图27F)显示类似于干燥对照组(图27B)中所见的角膜上皮微绒毛损失及退化。[0141]上述实施例1至4清楚地显示，包含分子量小于30kDa、小于3kDa及小于1kDa的活性[0142]于体外HCEC干燥应激研究中，进行十分钟的干燥造成HCEC存活率下降，这并不能小于1kDa的活性成分的ADSC-CM部分得以显著弥补该存活率下降。同时进行的免疫印迹分析也表明，于ADSC-CM中培养的HCEC的P38或p-Erk1/2表达增加。[0143]干燥CEC中的小鼠具有更多的蒸发，并因此具有更多的角膜荧光素染色及孟加拉具有显著降低的Z0-1及紧连蛋白表达量，而Z0-1及紧连蛋白是紧密连接的标志物。通过施用ADSC-CM及其具有小于30kDa、小于3kDa及小于1kDa的部分，干燥损伤所致的Z0-1及紧连蛋白表达量下降几乎被逆转或甚至更佳。ADSC-CM组的角膜上皮也显示最佳的K12表达，意味着保持角膜上皮的特征。ADSC-CM及其部分对于角膜的紧密连接的有益效果不仅通过共助角膜上皮的管家功能，该功能为建立与外部环境的边界，为液体流失、毒素刺激以及病原体进入提供障碍。[0144]ADSC-CM及其部分不仅保护角膜上皮细胞的紧密连接，而且也保护结膜杯状细胞及膜相关粘蛋白MUC16表达。CEC小鼠的结膜杯状细胞密度显著下降，这一现象通过至高于非干燥小鼠的密度。于非干燥对照组中的MUC16表达是连续的，而于干燥对照组中的[0145]干燥损伤造成角膜上皮微绒毛的损失。尽管通过Refresh或IMMCA的润滑减轻干燥应激所致的微绒毛损伤，但ADSC-CM及其部分将微绒毛保持得最好。[0146]总之，本公开证明了ADSC-CM对于干燥诱导的眼表面损伤的效果，可能是通过Erk1/2及P38的活化而达成。[0147]业经使用示例性实施方案描述本公开。但应理解，本公开的范畴并不限于所公开的实施方案。反之，其旨在包含各种修改及类似的重新安排。因此，权利要求书的范畴应给予最广泛的解释，以涵盖所有此类修改及类似安排。[0148]参考文献DefinitionandClassifiWorkShop(2007).Ocul.Surf.2007;5(2):75-92.Syndromedryeyewithanti-inflamm8:1447-58.[0151]3.PanQ,AngelinaA,MarroneM,Starkdropsfordryeye.CochraneDatabaseSyst.Rev.2017[0152]4.ChenL,TredgetEE,WuPY,Wucellsrecruitmacrophageshealing.PLoSOne.2008;3(4):e1886.mediafrommesenchymalstemcellsenhancenhancedwoundhealing.J.Surg.Res.2015;194(1):8-17.[0155]7.BeyazyildizE,PinarliFA,BeyazyildizMN,etal.Efficacyoftopicalmesenchymalstemcellofexperimentaldryeyesyndromemodel.StemCellsInt.2014;2014:250230.[0156]8.PawitanJA.Prospectofstemcellmedicine.Biomed.Res.Int.2014;2014:965849.[0157]9.GriescheN,LuttmannW,simplemodificationoftheseparationmethodreducesheterogeneityofadipose-derivedstemcells.CellsTissuesOrgans.2010;192(2):106-15.electromagneticfieldontheproliferationanddifferentiationhumanbonemarrowmesenchymalstemcells.Bioofhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsonbiodegradablemicrocarriersenhancesinvitrodifferentiationpotential.CellPdrying.TheBritishJournalofOphthalmology.2001;85(5):610-2.cornealepitheliuminvitroandinvivo.Mol.Vis.2011;17:2400-6.surfacelubricantsagainstdehydration.Cornea.2013;32(9):1260-4.controlled-environmentchamber:anewmousemodelofdryeye.InvestigativeOphthalmology&VisualScience.2005;46(8):2766-71.[0164]16.PaulyA,Brignole-BaudouinF,LabbeC.Newtoolsfortheevaluationoftoxirat.InvestigativeOphthalmology&VisualScience.2007;48(12ofOphthalmology.1969;82(1):10-4.[0166]18.SchaumbsyndromeamongUSwomen.AmericanJournalofOphthalmology.2003;136(2):318-26.eraofantiagingophthalmologycomesotreatment.OphthalmicRes.2010;44(3):146-54.[0168]20.TsubotaK,KawashimaM,Inabaal.TheantiagingapproachforSuppl.1:S3-8.chemistry.J.Gerontol.1956;11(3):298-300.contributionofparacrineeffectversusdirectdifferentiationonadipose-derivedstemcelltransplantate59020.[0171]23.BurlacuA,Grigorescusecretedbymesenchymalcomplementaryeffectsonangiogenesisinvitro.StemCderivedfromhumanbonemarrowmesenchymalstemcelaratmyocardialinfarctionmodel.J.Mol.Med.(Berl).2014;92(4):387-97.[0173]25.Lopez-VerrilliMA,CaviedesA,CabreraA,SandovalS,WynM.Mesenchymalstemcell-derivedCN113116928B说明书18/18页promoteneuriticoutgrowth.Neuroscience.2016;320:129-39.inflammatory