首医大临床免疫学课件：临床免疫学检验的实践应用及发展趋势

临床免疫学检验的实践应用

及发展趋势

本次课的主要内容一、一般医院检验科血清免疫室所开展的项目概况与方法学分类二、各主要类别方法的评价及方法选择的原则三、临床免疫学检验的主要误差/差错表现、原因分析及对策四、临床免疫学检测方法的自动化发展趋势结束一、一般医院检验科血清免疫室所开展的项目概况与方法学分类

1.

酶联免疫吸附试验（ELISA）：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb乙肝五项甲肝抗体、丙肝抗体、甲胎蛋白AFP，癌胚抗原CEA、HIV抗体的检测。2.

凝胶沉淀试验（单扩试验）：免疫球蛋白IgG、IgA、IgM，补体C3、C4等。3.

凝集试验：（胶乳）抗O，类风湿因子RF，（碳粒）梅毒血清学试验，（细菌）肥达试验4.

散射/透射免疫比浊测定：免疫球蛋白IgG、IgA、IgM，补体C3、C4，抗O/ASO，类风湿因子RF等5.

金标免疫技术：HBsAg或乙肝五项，[绒毛膜促性腺激素HCG]6.

[放射免疫测定：T3、T4、TSH甲状腺功能系列试验，胰岛素、C肽，其他一些激素如HCG、FSH、LH等的检测。]7.

溶血反应：总补体CH50测定。8.

[化学发光免疫分析与时间分辨荧光免疫测定技术，可以替代ELISA和放免测定的所有项目]9.细胞免疫检测：T、B细胞计数（E、EA、EAC花环实验），淋巴细胞转化试验，微量细胞毒实验CDC，混合淋巴细胞培养。返回二、各主要类别方法的评价及方法选择的原则

方法学评价的内容：1.准确可靠（准确度——参考方法/决定性方法做对照、校准，常规实验时的阴性、阳性对照与其他校准品精密度——重复性试验，批内、批间重复/日间重复，对于一些定量指标还需要参考生化检验的方法评价做线性试验—确定其测量的线性范围，回收试验，相关与回归实验等进行评价。）2.简便快速提高服务水平，出报告要及时，对方法的要求就要简便快速。但也得在保证准确的基础上简便快速才有意义。3.灵敏度最小检出限，至少在医学决定性水平以下。4.特异性该检测方法是否容易受干扰物质的影响，干扰试验。检测指标的特异性：该指标阳性与疾病之间的相关度，阳性预测值、阴性预测值，假阳性、假阴性率表示。5.安全性对工作人员的人身伤害、对环境的污染，绿色无污染已经深入人心。6.经济实惠成本不要太高，检验科有成本核算。诊断价值高，对病人有意义。节约社会资源，减轻病人负担。各主要类别方法的评价1.

酶联免疫吸附试验（ELISA）：比较准确，结果可靠，适合定性或半定量检测，也有些项目用其做定量检测，但结果不如放射免疫准确。安全性好、污染小。在血清免疫室应用最广泛的一种方法。但比较费时，适合大批量检测。手工操作劳动强度较大，可以实现自动化检测。偶有板孔包被不好导致错误结果的现象。2.

凝胶沉淀试验（单扩试验）：粗略定量或半定量的实验方法，操作简单但比较费时，稀释加样后一般需要反应12到24小时才能测量沉淀环直径计算结果。此类方法有被散射/透射免疫比浊测定取代的趋势。3.

凝集试验：定性或粗略的半定量，操作简单、出结果也快。准确性较差，有血清非特异性凝集等干扰因素影响。部分项目有被散射/透射免疫比浊测定取代的趋势。4.

散射/透射免疫比浊测定：在自动生化分析仪上自动稀释、加样、测定，操作简便快速，在保证仪器、试剂质量的情况下结果准确可靠。不足之处在于需要特殊仪器，试剂的质量要求也相当高，抗体需要非常纯，目前使用满意的多为进口试剂，国产试剂的问题主要在于线性范围小，而且空白/本底高，用起来自己都没有把握。进口试剂的成本较高。5.

金标免疫技术：最大的优势是简便快速，不需要特殊仪器设备，HCG孕妇自己都可以检测。是军事检验领域比较看好的一项技术，但是其准确性尚有些问题，主要是灵敏度欠佳，需要被检物达到相当高的浓度才能出现阳性结果。HCG的应用非常成功，HBsAg勉强可以用，乙肝五项的检测板就很失败。若能提高其灵敏度，该方法还是很有发展前途。6.

[放射免疫测定：T3、T4、TSH甲状腺功能系列试验，胰岛素、C肽，其他一些激素的检测。]本方法最大的特点就是准确、灵敏度高。适合检测激素、信号分子、细胞因子一类微量的抗原性物质。最大的弊端是放射性污染及对人体的放射损害。能用其他方法替代的项目已经逐渐被替代了，尤其是化学发光法在灵敏度与准确度上都与之接近。但还是有部分项目不可替代。7.

溶血反应：总补体CH50测定，比较传统的一个方法，操作烦琐，又不好改进。对补体总活性测定是一个经济实惠的粗略方法。分别测定多个单独的补体组分可取代总补体CH50测定，但费用剧增。部分检验科仍然保留本项目。8.

[化学发光免疫分析与时间分辨荧光免疫测定技术：灵敏可靠、准确度高，易于自动化。但仪器依赖性高，需要特殊设备，试剂要求也比较高，价格昂贵。]9.细胞免疫检测：T、B细胞计数（E、EA、EAC花环实验），淋巴细胞转化试验，微量细胞毒实验CDC，混合淋巴细胞培养。多为手工操作，而且这些方法的经验要求比较高，方法改进的难度大。检验科多数不愿意开展但是临床又确实需要，如器官移植的病人必须做。方法选择的原则：

1.首要原则是准确可靠，如果做出来的结果自己都没把握、自己都不相信，则最好不要选择该方法。2.在确保准确可靠/能够满足临床需要的前提下尽可能选用安全性好的方法。如有放射污染的放免方法部分项目逐步被无污染的ELISA，化学发光分析所取代。3.在准确可靠与简便快速/经济实惠之间寻找合适的平衡点.返回三、临床免疫学检验的主要误差/差错表现、原因分析及对策

主要误差/差错表现:

很简单1.

定量检测的项目结果时高时低。2.

定性检测的项目结果时阴时阳。3.符号简写的项目搞混淆，做错了项目。原因分析：

患者病情的变化而致的时高时低或阴性阳性改变属正常情况。其他原因导致的变化就是差错或错误，主要原因有：1.试剂的误差，包括批内误差与批间误差。2.操作误差：加样的准确性，孵育、洗涤过程的一致性，等等。3.取放样品、判读结果时的串行错误。4.仪器的误差，仪器的状态，仪器是否校准，5.样品的原因，血清的异常如溶血、脂血、黄疸等是否对检测项目有影响。血标本是否拿错，注意查对，三查七对。对策：1.选用质量可靠的试剂。在更换不同批次或不同厂家试剂时要小心摸索一段时间。2.操作一定要仔细。包括加样、孵育的温度与时间、洗涤与控干的技巧，显色终止后尽快测定，仪器的保养与校准等等。采取适当的措施杜绝加样与判读结果的串行错误。对样品的异常最好做些记录，便于以后分析错误原因。3.要分析成批试验的结果。是否全部都高了，还是大多数都低了，与往常的结果是否大概一致，一般说来，一批试验中有高有低是比较让人放心的。做到这一步，按照试剂商的资料，可以将整体的差错率控制在1%0到1%00。但仅满足于这样的效果仍然会使检验科麻烦不断。4.要分析单个病人的检验结果是否与临床诊断吻合，这一条是临床医生判断检验结果准确与否最主要的标准，虽然不是百分之百正确，但确实大多数结果与诊断是吻合的，不吻合的情况也有，但发报告更要非常慎重。做到这一点，可以将单个病人的错误率控制在1%左右，加上复查的效果，有可能杜绝差错的发生。5.分析同一病人各种项目之间的结果是否吻合。这一条在生化检验中非常有效。在免疫学检验的乙肝五项检查中也是有用的，比如HBsAg和HBsAb都阳性就肯定需要复查。6.按规定留存标本（3-5天），加强复查工作。对没有把握的结果，宁可浪费点试剂、牺牲点时间，也要把它留下来再做一次，复查一下搞确切。对单个病人而言，假设做一次的错误率在1%，而做两次再错的可能性就下降到1%00。通过这样的复查，还很容易查出临床科室的种种问题，从而大大提升检验科严谨求实的形象。7.加强质量控制工作。持之以恒地作好室内质控，包括每批实验的阴性阳性对照；积极参加省市或全国的室间质评工作，作用有两个：有时自我感觉良好，但是与同行一比较相差甚远，有的医院领导总是批评检验科的质量问题，如果我们能拿出优秀的室间质评成绩，则是说明我们清白的最佳证据。8.加强业务学习，不但要学习检验的方法技术，也要学习临床疾病的病理生理改变，才能做到知己知彼，减少差错的发生。总之，我在医院检验科工作几年的经验是：差错也许一年两年不发生，但我们必需把每个样品都看成是一个可能发生差错的陷阱。针对实习同学的特别建议：1.虚心请教，对安排给自己的工作一定要把每一步搞确切再动手。对化验单上不懂的一定要问确实，避免第三类低级错误的发生。2.务必小心仔细，从核对标本到判断结果每一步都不可疏忽大意。3.不要擅自出报告，即便是自己独立做的检验项目，也要请带教老师过目签发。4.要具有自我保护和自我防范意识，尤其是自己不可承担的责任（如重要检验报告的签发）、不能处理的事情（如医患纠纷），自己能做的就是报告带教老师或科室领导处理。否则自己惹上麻烦将是灾难性的后果！返回四、临床免疫学检测方法发展趋势微量、快速、自动化是整个医学检验发展的趋势，免疫学检验也不例外。免疫学检验另一个发展趋势是：由定性向定量方向发展。这些趋势的核心是自动化，有了精密、高效的自动化仪器，才可能实现微量、快速、准确定量的检测。此外，免疫学检验的发展还有以下几个值得关注的特点：另外还有几个特点：

1.

免疫学检验与检验专业其他学科的交叉发展（1）免疫学检验的方法广泛应用于其他领域：应用于临床检验，如HCG，由原来的生物学方法（蟾蜍或青蛙排精）→胶体金免疫试纸条，给检验人员带来巨大的方便。细胞学检验，利用特定细胞抗体进行免疫组化染色，使细胞学检验更加客观。微生物检验，免疫学是从微生物独立出来的，方法技术的相互渗透不必多说。生化检验，利用免疫比浊的方法对载脂蛋白（Apo）A、B，Lp-a，糖化血红蛋白（HBA1C），C-反应蛋白CRP等进行了测定方法的重大改进，简化了操作，提高了准确度。（2）免疫学检验引进生化检验的全自动生化分析仪技术，利用免疫比浊的方法对免疫球蛋白IgG、IgA、IgM，补体C3、C4，抗O/ASO，类风湿因子RF等进行了测定方法的重大改进，简化了操作，提高了准确度。免疫比浊法包括散射比浊与透射比浊是免疫学检验与生化检验交叉发展的成果，使一些操作烦琐的项目面目一新，简单快捷，而且准确度大大提高，该方法在一定程度上使生化检验与免疫学检验的项目区分由绝对变得模糊。2.

高通量芯片检测技术的研发包括基因芯片、蛋白芯片与微处理芯片（微缩实验室），号称可以取代庞杂的检验科。目前研究得很热，但距离实际应用还有很长的路要走。临床免疫学检验的自动化

全自动的免疫分析仪已经进入部分大医院的检验科。不同的自动免疫检测仪的原理结构可能千差万别，但其组成一般可以归纳成三部分：机械操作部分、光学（检测）部分、电子电路（含计算机控制与分析）部分。基本原理：早期的是EIA、ELISA，现在多采用灵敏度更高、准确性更好的化学发光免疫分析法和时间分辨荧光免疫测定技术时间分辨荧光免疫检测系统时间分辨荧光检测技术TRF的简单原理上海新波生物技术有限公司

国产半自动时间分辨荧光免疫分析仪

（ANYTEST-2000型时间分辨荧光检测仪）配套的Egate2310全自动洗涤机和2510变频振荡器

时间分辨荧光免疫分析法的原理与特点时间分辨荧光免疫分析法（Time-ResolvedFluorescence，简称TRF）是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物(代替荧光物质、同位素或酶)，标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，待反应体系（如：抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等）发生后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，以此来判断反应体系中被测物质的浓度。

TRF分析法之所以能够继放免、酶标、化学发光、电化学发光后成为一种更新、更灵敏的检测方法，主要取决于它所用标记物（稀土离子）的独一无二的物理性质及化学性质：标记物体积很小(为原子标记)，标记后不会影响被标记物的空间立体结构，保证了被检测物质的稳定性(尤其对蛋白质影响更小)；此方法实现了多位点标记，这不仅使检测更灵敏，也使一个试剂盒能够同时检测出两种或两中以上的项目（如PSA的检测）；目前只有原子标记才能准确的定量检测DNA、RNA。

稀土原子具有的荧光发射峰谱范围窄、激发光波长范围宽的特点，有利于增强荧光的特异性，提高分辨率；激发光和发射光之间存在较大的STOKES位移，有利于排除非特异性荧光的干扰、降低本底荧光强度；稀土离子螯合物产生的荧光强度高、寿命长，有利于消除环境中其它荧光物质的影响，并可对样品进行多次检测。

时间分辨荧光免疫分析技术具有标记物制备简便、有效期长、不污染环境、操作流程短